우리는 미카엘 Lelek, Orestis Faklaris 및 유익한 토론을 위한 니콜라스 부르, 안드레이 Aristov와 엘레나 슈퍼 해상도 기법에 대 한 Rensen 및 Shailaja Seetharaman 원고의 주의 깊은 독서에 대 한 감사합니다. 우리는 기꺼이 (ANR-10-INSB-04; 프랑스 국립 연구 기관에서 지 원하는 프랑스 BioImaging 인프라 네트워크 뿐 아니라 UtechS 광학적 BioImaging (Imagopole) Citech의 파스퇴르 (파리, 프랑스)을 인정 미래에 대 한 투자), 그리고 지구의 Ile-de-France (도메인 d 프로그램 ' Intérêt Majeur-Malinf) Elyra 현미경의 사용에 대 한. 이 작품에 의해 지원 되었다는 리그 죄수 르 암과 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-16-CE13-0019).

1. Coverslips 준비 (1 일, 30 분)
<ol><li>18 m m nº1.5H (5µm + 170 µ m) 유리 coverslips를 플라스틱 선반에 놓습니다.</li>
	<li>랙 아세톤과 5 분 담가 가득 100 mL 비 커에 넣어.</li>
	<li>100 mL 비 커에 전송 랙 절대 에탄올 5 분 담가 가득합니다.</li>
	<li>절대 에탄올 가득한 새로운 100 mL 비 커에 선반을 전송 하 고 초음파 청소기 장치에서 비 커를 배치 (재료의 표 참조) 실내 온도에. "에" 누르고 10 분 기다립니다.</li>
	<li>층 류 흐름 후드 랙 넣고 coverslips 건조 또는 필터링 된 공기 흐름으로 coverslips를 건조 하 게.</li>
	<li>플라즈마 클리너 장치에 coverslips와 선반을 넣어. 진공 펌프에 스위치, 문을 닫고, 진공 청소 후 1 분 사용 된 coverslips에 대 한 플라즈마에 스위치를 3 분까지 기다립니다. 그들을 저장 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 셀 도금 (1 일, 20 분)
<ol><li>Glial 세포 라인 U373 최소 필수 매체 (MEM)에 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스, 및 1% 비필수 아미노산 10 cm 직경 플라스틱 페 트리 접시에 성장.</li>
	<li>층 류 흐름 후드 12-잘 접시에 깨끗 한 유리 coverslips를 놓고 잘 당 preheated 셀 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>(37 ° C, 5% CO2) 셀 인큐베이터에서 세포를 포함 하는 접시를 가져가 라.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 10 mL PBS를 추가.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 추가 1 mL 0.05% 트립 신-EDTA.</li>
	<li>다시 2-3 분 인큐베이터에에서 접시를 놓습니다.</li>
	<li>접시에 37 ° C에 미리 데워 따뜻한 매체의 10 mL을 추가 하 고 셀을 resuspend.</li>
	<li>종자는 coverslips를 포함 하는 12-잘 접시에 잘 (셀 ~ 150 µ L) 당 약 100 000 셀입니다.</li>
	<li>셀 확산 수 있도록 적어도 6 h (또는 숙박)을 기다립니다.</li>
</ol>3. 셀 고정 (주 2 일 2 시간)
<ol><li>80mm 파이프, 7 m m MgCl2, 1mm EGTA, 150 mM NaCl, 골격 버퍼를 준비 하 고 6.9에 산도 조정.</li>
	<li>PBS 한번 셀을 씻어.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 부드럽게 잘 추출/고정 솔루션의 당 1 mL을 추가 (0.25%도, 0.3% 골격 버퍼에 Triton X-100) 37 ° c.에 preheated</li>
	<li>60에 대 한 품 어 실 온에서 s.</li>
	<li>솔루션을 제거 하 고 부드럽게 잘 데워와 갓 4 %PFA (paraformaldehyde) 솔루션의 골격 버퍼에 희석 당 1 mL를 추가 합니다. 주의: 장갑을 사용 하 고 화학 후드 작동.</li>
	<li>다시 10 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서에서 12-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>제거는 PFA 고 잘 당 PBS의 3 mL를 추가 합니다. 참고: 장갑과 화학 후드 작업과 재활용된 PFA 특정 빈에 넣어.</li>
	<li>PBS로 2 회 세척.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 글에서 나오는 autofluorescence을 냉각 하기 위하여 PBS에 희석 갓된 10 mM NaBH4 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 7 분 동안 품 어.</li>
	<li>특정 빈에 재활용된 NaBH4 를 넣어.</li>
	<li>PBS로 세척 몇 번이 고 5 분입니다.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 차단 솔루션 (PBS에 5 %BSA 솔루션)를 추가 합니다.</li>
	<li>1 시간 실 온에서 (또는 하룻밤 4 ° C에서)에 대 한 품 어. 참고: 골격 버퍼는 몇 달 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다. PFA, NaBH4 도 (후드, 장갑, 그리고 특정 재활용 쓰레기통) 특별 한 주의 함께 처리 되어야 합니다. 솔루션 추가 하 고 셀의 무결성을 유지 하기 위해 부드럽게 제거 한다. 그것은 건조 하는 셀을 못하게 하는 것이 중요입니다.</li>
</ol>4. Immunostaining (일 2, 5 h)
<ol><li>안티-vimentin 및 안티 tubulin 차단 솔루션에서 1: 500 희석 사용 하 여 기본 항 체의 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>100 µ L 방울 희석된 주 항 체를 파라핀 영화 레이어에 넣고 아래쪽으로 직면 하는 세포와 그들의 위에 coverslips를 배치.</li>
	<li>2 헤 PBS 가진 coverslips 12-잘 접시에 가득 넣어에 대 한 1 차 항 체와 세포를 품 어. 5 분 궤도 셰이 커에 실 온에서 PBS에 각 시간에 대 한 세 번 린스.</li>
	<li>한편, 반대로 마우스 Alexa647과 반대로 쥐 Alexa555 차단 솔루션에서 1:1, 000의 희석 사용 하 여 보조 항 체 솔루션을 준비 합니다. 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체와 세포를 품 어. 4.2 처럼 진행 합니다. 빛 으로부터 세포를 보호합니다.</li>
	<li>PBS는 coverslip 다시 12-잘 접시에 가득 합니다. 5 분 궤도 셰이 커에 실 온에서 PBS에 각 시간에 대 한 세 번 린스. PBS를 제거 하 고 PBS 섞인 0.1 µ m tetraspeck 구슬의 1 µ L의 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>30 분 PBS와 린스에 대 한 궤도 통에 우물을 넣어. PBS를 제거 하 고 PBS에 4 %PFA 솔루션 5 분에 대 한 셀을 품 어. PBS에서 몇 번이 고 씻어. 참고: 고정된 셀 몇 4 ° c.에 PBS에 주 동안 저장 될 수 있다 Immunostaining는 마지막 순간에 이루어져야 한다.</li>
</ol>5. 샘플 준비 (3 일, 5 분)
<ol><li>MEA (시스테, 1 M, pH 8.3), 포도 당 산화 효소 (100 x, 50 mg/mL), 카 탈 라 제 (500 x, 20 mg/mL)의 aliquots는 얼음 바구니에 넣어.</li>
	<li>NaCl Tris 버퍼의 50 mL를 준비 (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) 포도 (100 mg/mL)의 10% 보충.</li>
	<li>10% 포도 당으로 NaCl Tris 버퍼에 10mm MEA, 0.5 mg/mL (75 U/mL) 포도 당 산화 효소, 40 µ g/mL catalase (80-200 U/mL)와 이미징 직전 버퍼 이미징의 1.2 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>마그네틱 샘플 홀더 (예: chamlide 챔버)에 레이블이 지정 된 셀을 포함 하는 coverslip 탑재 하 고 챔버를 완전히 채우기 위해 이미지 버퍼를 추가 합니다. 는 뚜껑을 넣고 이미징 버퍼와 뚜껑 사이 아무 공기 방울이 있는지 확인.</li>
	<li>절대 에탄올 샘플의 바닥을 청소 하 고 누출 하지 않습니다 확인 합니다. 그리스를 사용 하 여 필요한 경우 샘플 홀더를 제대로 인감. 참고: 1 M 재고 MEA 솔루션 (pH 8.3 HCl을 사용 하 여 조정), 50 mg/mL에서 포도 당 산화 효소의 물에 20 mg/mL에서 catalase의 재고를 준비, aliquots 만들고 MEA 및 포도 당 산화 효소 및 catalase의 연도 대 한 최대 한 달 동안-20 ° C에서 저장. Aliquots을 refreeze 하지 마십시오. NaCl Tris 버퍼를 사전에 준비 하 고 몇 달 동안 실내 온도에 저장. 실험 (단계 5.3)의 날에 포도 당을 추가 합니다.</li>
</ol>6. 이미지 수집 (3 일, 셀 당 ~ 1 h)
<ol><li>현미경에 전환 합니다. 수집 소프트웨어에 스위치와 시스템 시작을 누릅니다.</li>
	<li>설치 관리자 도구 그룹에서 인수 탭 확장 이미징 설치 도구를 선택 합니다. 인수의 레이저 WF (와이드 필드) 모드를 선택 합니다. 100 X 나 1.46 목표를 선택 합니다. TIRF u-HP 모드 조명 되 고 보기의 필드를 줄이기 위해는 겨냥 틀을 사용 하 여 선택 하 고 더 작은 영역으로 레이저 에너지를 집중. optovar 1.6 x 렌즈 100nm의 픽셀 크기를 사용 합니다.</li>
	<li>시계열 도구를 선택 하 고 시간 경과 50 000 프레임 및 프레임 사이의 0.0 ms를 설정. 인수 매개 변수 도구 그룹에서 채널 도구를 확장 하 고 "모두 보기"를 선택 하십시오.</li>
	<li>Alexa647 트랙 설정: 여기 라인 레이저는 642와 405 그들을 수락 확인. 영상 설정에서 "655 LP" 방출 필터를 선택 합니다. "647을"를 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>클릭 다른 가벼운 패스를 추가 하 고 선택 모드를 채널 도구에서 '+'에 "스위치 트랙 모든: 프레임" 이미지 설치 도구에서. 561 488, 405 레이저 라인을 확인 하 고 그들을 설정 하려면 수락. 선택은 "혈압 570-650 + LP750" 방출 필터 및 optovar 렌즈 1.6을 사용 하 여 x. TIRF-uHP 모드 선택 되어 있는지 확인 하십시오. 트랙을 "555"의 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>획득 모드 도구를 선택 하 고 200 x 200 픽셀 프레임 크기를 설정 합니다. 초점 장치 및 전략 도구를 선택 하 고 (경우 초점 잠금 시스템) 1 000 프레임에 확실 한 포커스를 설정.</li>
	<li>목표에 석유를 넣고 샘플을 넣어. 찾기 탭을 선택 하 고 형광 램프의 셔터를 엽니다. 초점을 찾을 하 고 접 안 렌즈를 사용 하 여 이미지를 찾습니다. 조이스틱을 사용 하 여 보기의 필드의 중앙에 넣어.</li>
	<li>획득 모드 돌아가 인수 탭을 선택 합니다. "647" 트랙 선택, 642-레이저 전력 0.2%로 설정, 0 405-레이저 전원 설정, 노출 시간 설정 50 ms 및 50의 이득. 연속 수집 모드 관찰 화면에 셀을 선택 합니다. 초점을 조정 합니다. 보기의 필드에 하나 이상의 tetraspeck 구슬 있는지 확인, 필요한 경우 그들을 보고 대비를 증가. 자동-스케일 모드를 사용 하 여 디스플레이 대 한. Vimentin 네트워크의 넓은 필드 epifluorescence 이미지를 스냅 클릭 하 여가지고 고 그것을 저장 합니다. TIRF 조명을 확인 하려면 TIRF 클릭, 조명의 동종 분야 하 고 그것을 저장 하는 데 필요한 경우 조명 겨냥 틀의 각도 조정 합니다. 참고: TIRF와 epifluorescent 이미지는 높은 품질의 원시 데이터 수집을 시작 하기 전에 중요 하다. 불연속, 비균일 레이블이 필 라 멘 트 품질 dSTORM 이미지 상승을 줄 것 이다.</li>
	<li>"647" 트랙의 선택을 취소 하 고 선택 하 고 확인 "555" 트랙. Microtubule 네트워크의 epifluorescence 이미지 가져가 라 하 고 그것을 저장 합니다. TIRF 이미지와 너무 합니다.</li>
	<li>"555" 트랙을 선택을 취소, 선택 하 고 "647" 트랙을 확인 다음 연속. 0으로 이득의 넣고 10 양 노출 시간 설정 642 nm 레이저 전원 100% 어두운 상태로 (~ 2 kW/cm2) Alexa647 염료의 대부분을 펌프. 일단은 fluorophores 점멸 시작, 15 ms에 노출 넣고 300를 얻을. 조명의 TIRF 모드를 선택 합니다. 자동 규모 없이 범위 표시 모드를 사용 하 여 단일 분자 신호 (빨간 색으로 표시 된) 카메라를 포화 하지 않습니다 확인. 채도 사라질 때까지 그 경우에 이득 감소. Tetraspeck 구슬 수집의 시작 부분에 포화 상태로 유지 됩니다. 셀의 연속 관측을 중지 하려면 중지 를 누릅니다.</li>
	<li>온라인 처리 도구를 확장 하 고 온라인 팜 처리 중 폭풍 이미지 시각화를 확인. 다음 매개 변수를 사용 하 여: 피크 마스크 크기 (9 픽셀 직경) 및 잡음에 피크 강도 대 한 6 9. 논문 매개 변수 처리 (충분히 밝고 하지 중복)에 고려는 분자를 정의 합니다. PAL-통계 도구에서 플롯 유형 선택: 히스토그램, 그리고 히스토그램 소스: 정밀도. 수집을 시작을 누릅니다.</li>
	<li>중, 촛점 (아무 초점 잠금 장치 경우) 필요한 경우. (노출, 레이저 힘) 매개 변수를 조정 (0.001%에서 시작) 단일 분자 사이 1 µ m의 최소 거리 fluorophores의 중간 밀도 유지 하는 405 nm 레이저 선 결국 전환 (> 9 픽셀 100 nm, 피크 마스크 크기) ( 그림 1A-B). 분자 밀도 조금 너무 높은 경우 TIRF 대신 조명 힐로 (높은 경향 및 광학 적 층 시트) 모드를 사용 합니다. 이 레이저 힘 20% 증가 합니다. 주위에 또는 10 아래 아래 복원된 이미지 히스토그램에 지역화 정밀도의 최대 중심으로 확인 nm. 참고: 시간과 함께, 분자 수가 감소 하는 일반적으로 그리고 405 nm 레이저 파워를 따라 천천히 증가. 지역화 정밀 (슈퍼 해상도 이미지 아래에 표시 되는 히스토그램) 피크 10 아래 가능한 한 많이 감소 하는 목표는 nm (그림 1C). 필요한 경우, 너무 많은 밝은 구슬 필드에 존재 하는 경우 팜 이미지의 명암을 증가.</li>
	<li>106 국부 (일반적으로 40 000 프레임) 후에 도달 되는 영화를 막으려고 중지 를 누릅니다. 0.2%로 다시 레이저를 넣어 (642 nm)와 0 (405 nm). .Czi 형식으로 폭풍 수집의 원시 데이터를 저장 합니다. 트랙 "647" 채널 도구에서 선택을 취소 합니다 선택 하 고 트랙 "555" 확인.</li>
	<li>25 ms 노출 시간을 설정 하 고 0을 얻을. 연속 버튼 누르고 펌프 Alexa555 염료 어두운 상태 (~ 2 kW/cm2 각)을 100% 모두 561 488 레이저 설정. fluorophores 점멸, 250, 이득을 넣어 시작 힐로 조명 모드를 사용 하 고 단일 분자 범위 표시 모드와 카메라를 포화 하지 마십시오 확인. 그 경우는 이득 감소. 중지를 누릅니다. 488-레이저 파워 50%를 감소.</li>
	<li>수집을 시작을 누릅니다. 중, 채도의 제한에서 반드시 이득을 점차적으로 증가. 405 nm 레이저 파워 시야 (참조 단계 6.18)에 단일 분자의 중간 밀도 유지를 단계적으로 증가. 405 레이저 15% 보다 높은 경우 488 레이저 파워를 20-30% 감소. 그런 다음 점차적으로 분자를 가능한 한 빨리 점멸 유지 하기 위해 405 레이저 라인을 증가 하는 동안은 488 감소. 최대한 강도로 561 여기 레이저와 결합 488 레이저 라인 모두 온 / 오프는 fluorophores의 405 레이저 라인만에 비율을 증가 하는 반면 증가 한다.</li>
	<li>아니 더 많은 분자는 깜박이 이상의 500 000 있어 (후 약 20 000 프레임)에 도달 된 수집 이상 중지 합니다. .Czi 형식으로 폭풍 수집의 원시 데이터를 저장 합니다. 참고: 항상 더 높은 파장을 피하기 위해 표백 (또는 활성화) 다른 색상의 시작 합니다. 그것은 정기적으로, 예를 들어 이미지 버퍼를 변경할 수 때문에 chamlide 챔버는 봉인 하지 다른 버퍼 조건을 테스트 합니다. 488 레이저 라인을 사용 하 여 알 렉 사 555 염료를 고갈 하 561 레이저 파워 (100 mW 레이저)와 제한 된 경우에 필요 하다.</li>
</ol>7. 이미지 재건 (5 분)
<ol><li>PAL-드리프트 도구에서 8의 최대 크기를 가진 자동 세그먼트 모델 기반 보정 유형을 사용 합니다. 눌러 적용 여러 번 연속에서 드리프트 해결 될 때까지. 이 모델 기반 보정 알고리즘 수정 드리프트 교차 상관 분석에 따라 적용 됩니다.</li>
	<li>PAL-필터 도구를 사용 하 여 분자를 현지 최고의 했다만 선택 하 여 폭풍 이미지의 모양을 향상 시킬. 예를 들어 30 지역화 정밀도 제한 및 120-180 nm PSF.</li>
	<li>1 PSF. 렌더링 선택 자동 동적 범위 값이 95 %HR 렌더링 자동 동적 SWF 90% 값의 확장 요소와 가우스 디스플레이 모드 뿐만 아니라 PAL 렌더링 도구 5 또는 10 nm의 픽셀 해상도 사용 합니다. 최고 품질의 렌더링을 선택 합니다.</li>
	<li>처리 탭 (후 처리 모드)의 팜 메뉴에서 팜 변환을 선택 합니다. 선택 하 고 다음 적용을 누릅니다. 형식으로 만든된 이미지를 저장 합니다. LSM (그리고 하지.czi, 매우 중요 한). 참고: 이미지 재구성 수집 또는 수집 소프트웨어의 이미지 처리 모드를 사용 하 여 저장 후 즉시 수행할 수 있습니다. 오프 라인 모드를 후 처리에서 매개 변수 (피크 마스크 크기, 잡음에 피크 강도)의 값이 다른 스택 분석 가능 하다. 항상 "겹치는 분자 취소" 하지 "평균 지역화 하기 전에"를 선택 합니다.</li>
</ol>8. 폭풍 이미지 (10 분)의 지역화 정밀 추정
<ol><li>폭풍 원시 데이터를 열고 탭 팜 방법 선택 하 고 손바닥 을 다시 처리 하는 이미지를 사용 합니다. 선택키를 누릅니다.</li>
	<li>9와 6 (또는 이미지에 대 한 선택 매개 변수)의 소음에 피크 강도 피크 마스크 크기를 사용 하 여 재구성을 시작 하려면 적용 을 누릅니다.</li>
	<li>사각형 그래픽 도구를 선택 하 고 단일 분자를 유리 표면에 주위 raw 이미지에 사각형을 그립니다. 일반적으로 몇 가지 단일 분자 거기 있다.</li>
	<li>프레스 적용 다시, 그리고 사각형 영역 내에 있는 분자 분석.</li>
	<li>PAL-통계 도구에서 플롯 유형 선택: 막대 그래프 및 히스토그램 소스: 위치 또는 Y 위치, 위치 막대 그래프를 시각화.</li>
	<li>이미지 아래 왼쪽에 있어 목록으로 테이블을 저장 합니다.</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 만들 히스토그램의 X 및 Y 위치 (그림 1D).</li>
	<li>가우스에 의해 배포판에 맞게 하 고는 σX , σY 값을 저장 합니다. 지역화 정밀 σSMLM (σX *σY)에 의해 추정 된다 ^0.5.</li>
	<li>가능한 많은 분자에 8.3-8.8 단계를 반복 하 고 평균 σSMLM
</li>
</ol>9. 채널 등록 (5 분)
<ol><li>피지 (이미지 J) 소프트웨어를 사용 하 여 각 색상의 폭풍 이미지를 엽니다.</li>
	<li>각 tetraspeck 구슬의 위치를 측정 하기 위해 자동 선택 도구 선택 합니다.</li>
	<li>각 구슬에 대 한 X 및 Y 변화를 계산 하 고 그들을 평균.</li>
	<li>"변환" 명령을 사용 하 여 계산으로 두 번째 이미지 번역 X 및 Y 교대.</li>
	<li>병합 채널 명령을 사용 하 여 두 이미지를 병합 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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S., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+buffers+for+3D+STORM+microscopy.">Simple buffers for 3D STORM microscopy.</a> Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).</li><li>Eliasson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filament+protein+partnership+in+astrocytes.">Intermediate filament protein partnership in astrocytes.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).</li><li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microtubule-associated+motors+drives+intermediate+filament+network+polarization.">Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization.</a> J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+Intermediate+Filaments+Template+Microtubule+Networks+to+Enhance+Persistence+in+Cell+Polarity+and+Directed+Migration.">Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration.</a> Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).</li><li>Nieuwenhuizen, R. 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M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+and+the+astrocyte+intermediate+filament+system+in+diseases+of+the+central+nervous+system.">Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytoma+grade+IV+(glioblastoma+multiforme)+displays+3+subtypes+with+unique+expression+profiles+of+intermediate+filament+proteins.">Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).</li><li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment.">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li><li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy:+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters.">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924 (2015).</li><li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers.">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy.">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933 (2015).</li><li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy.">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

프로토콜의 중요 한 단계
선물이 여기 microtubules의 dSTORM 이미지에 유물과 glial 세포에서 IFs를 최소화 하는 프로토콜. 샘플 준비 및 이미징의 모든 단계에서 아티팩트를 만들 수 있습니다: 고정, 차단, immunolabeling, 드리프트, 비-최적의 깜박이 조건23중. 우리는 가장 중요 한 단계 아래 목록.
표면에 fluorophores의 비 특정 바인딩 제...

세포질 중간 필 라 멘 트 (IFs)는 10 nm 직경 호모-또는 heteropolymers의 경우 단백질의 세포 유형 특정 하위 집합입니다. IFs는 세포 기능 세포 운동 성, 확산 및 스트레스 응답의 큰 범위에 참여합니다. 그들의 주요 역할은 90 이상 인간의 질병 직접 경우 단백질;에 돌연변이 의해 발생 하는 사실에 의해 강조 표시 예를 들어, 경우 구성에서 변경 함께 종양의 성장과 확산1,2,3. 3 골격 시스템 제어 셀 분극, 부문 및 마이그레이션2,3같은 세포질 기능을 공동에서 작업 하는 증거가 성장 하고있다. 공간 구조와 기능 간의 밀결합을 이므로 다른 필 라 멘 트와 함께 IF의 구조 조직에 대 한 통찰력을 얻을 하 고 cytoskeletal 잡담 이해 결정적 이다. 이 문서에서는 수퍼 해상도 기술 듀얼 컬러 dSTORM (직접 확률적 광학 재건 현미경)4 와 어떻게 경우 사이 상호 작용을 조사 하는 데 사용은 및 microtubules 수행 하는 프로토콜에 고정, 교양 2 차원 (2D)에 셀입니다.
지난 여러 슈퍼 해상도 기법 개발 되었습니다 10 년, 그리고 거기 발견 20145화학에 있는 노벨상의 근원에 있었다. 이러한 모든 기술 중에서 거짓말 같은 팜6 (Photo-Activated 지역화 현미경) photoswitchable 형광 단백질을 사용 하 여 폭풍7 쌍의 fluorophores 또는 dSTORM4 단일 분자 지역화 기반 방법 기존의 fluorophores와. 이러한 모든 메서드는 (i) 형광 기자 들의 대부분의 스위치 "off" 상태로 구성 된 동일한 원칙을 기반 으로"(비-형광), (ii)는 형광으로 그들의 부분 집합의 확률적 활성화 상태 지역화 하기 위해 그들의 공간 위치 나노미터의 정확도, 및 (iii) 가능한 fluorophores의 많은 하위 집합을 활성화 하려면이 과정의 반복입니다. 20 ~ 40까지 가로 해상도 제공 하는 활성화 된 분자의 모든 지역화를 사용 하 여 최종 이미지 재구성 nm. 팜/폭풍을 수 있도록 여러 상용된 광학 시스템 이제 일상적인 실험에 대 한 생물학에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기, 하나의 같은 시스템 microtubules의 IFs 구조 협회 연구 사용 되었다. 모든 단일 분자 지역화 기반 방법 중, 듀얼 컬러 dSTORM 기술을 선정 되었다, 그것은 매우 얇은 플레이트 영역을 관찰 하는 데 적합 하기 때문에 (< 1 µ m) 부착 셀의 이미지 해상도의 상당한 향상을 제공할 수 있습니다 최소한의 시간과 돈을 투자입니다. 실제로, dSTORM 면역 형광 세포 얼룩을 정기적으로 사용 하는 표준 유기 염료와 호환 되는 매우 편리 하 고 다양 한 기술입니다.
듀얼 컬러 dSTORM 실험 조건을 최적화 하는 제한 된 경우에 특히 두 염료 선택된 버퍼에 제대로 깜박일 수 있습니다 하는 데 필요한 하나의 색상 dSTORM 이미지 fluorophore Alexa6478를 사용 하 여 얻기 위해 상대적으로 간단한 동안, 레이저 파워입니다. 우수한 논문 dSTORM9,10,11,,1213, 멀티 컬러 이미지를 설정 하는 방법에 사용할 수 있으며 이러한 서류 자세히의 가능한 소스 설명 유물과 저하 이미지 해상도 그들을 극복 하는 방법. 이 문서, 셀 고정, immunostaining, 샘플 준비 최적의 실험 조건, 이미지 수집 및 이미지 재구성에서는 밀도 세포질 경우 네트워크와에 microtubules의 이미지 순서 설명 듀얼 컬러 dSTORM와 glial 세포입니다. 간단히, Chazeau 외12 에서 설명 하는 추출/고정 방법을 glial 세포에 적응 되었고 후 정착 단계, 최적화 된 항 체 농도와 사용, 10 m m 폭풍 버퍼 MEA 뎀시9 외 인에 설명 된 실험 설정 및 샘플 형식에 대 한 최적의 발견.
Glial 세포는 주로 세 가지 유형의 경우 단백질을 표현: vimentin, nestin와 GFAP (glial 산 성 fibrillary 단백질). 이 3 개의 단백질은 이다14공동 유해를 표시 했다. 우리는 이전 슈퍼 해상도 구조화 조명 현미경 (SR SIM)이 세 경우 단백질 같은 단일 경우 필 라 멘 트에 찾을 수 있습니다 그리고 glial 세포 15에서 비슷한 분포 및 역학 표시는 사용 하는 것을 보였다. 3 IF 단백질 사이의 유사성 때문 vimentin 얼룩 사용 되었다 기자로 서 모든 경우에 네트워크에 대 한. DSTORM를 사용 하 여, 우리 어떻게 회절 가능 했다 microtubules 따라 경우 양식 번들 현미경 기법15제한 해결 관리. 이러한 관측 vimentin IFs 템플릿 microtubules 수 하는 방법을 이해 하 고 셀 마이그레이션16극성 축 유지 보수 홍보 그들의 성장 궤도 조절 하는 데 도움이 됩니다. 슈퍼 해상도 이미지 두 cytoskeletal 서브 시스템의 상호 작용에 중요 한 정보를 제공 하 고 공간 협회와 셀 형 특정17수 있는 로컬 기능 사이의 링크에 대 한 통찰력을 가져. 일반적으로, 밀도 및 특이성 좋은 immunostaining 조건에 도달 하 듀얼 컬러 dSTORM cytoskeletal 요소 또는 다른 유형의 세포, 사이 누화를 공부에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 astrogliosis 중 고 세포종에서 골격 변화 특성을 더 도움이 될 것입니다, 그리고 가장 일반적인 및 가장 악성 종양의 경우 단백질의 표정은 이다 중앙 신경 변경 18 19,,2021.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Media (MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>non essential amino acid</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>cell culture 1/100e</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>cell culture 1/100e</td></tr><tr><td>F&amp;oelig;tal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>cell culture 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>fischer scientific</td><td>11540486</td><td>cell culture</td></tr><tr><td>coverslip 18 mm n&amp;deg;1,5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>coverslips</td></tr><tr><td>paraformaldehyde (PFA) solution</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>cell fixation</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>cell fixation</td></tr><tr><td>triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>non ionic surfactant. Used for cell fixation</td></tr><tr><td>sodium borohydride (NaBH4)</td><td>Sigma</td><td>452904-25ML</td><td>cell fixation</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>sample passivation 3% in PBS</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>primary antibodies</td></tr><tr><td>Rat anti alpha tubulin</td><td>Biorad</td><td>MCA77G</td><td>primary antibodies</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Fisher scientific</td><td>10635923</td><td>secondary antibodies</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Fisher scientific</td><td>10226162</td><td>secondary antibodies</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &amp;micro;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td><td>fluorescent beads</td></tr><tr><td>Chamlide magnetic chamber</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL</td></tr><tr><td>Cysteamine (MEA)</td><td>Sigma</td><td>30070</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>glucose oxidase from Aspergillus niger</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>glucose</td><td>sigma</td><td></td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>catalase from bovine liver</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>Tris (trizma)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>for the blinking buffer</td></tr><tr><td>Wash-N-Dry coverslip rack</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>paraffin film</td></tr><tr><td>ultrasonic cleaner</td><td>Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>plasma cleaner</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intermediate filaments and microtubules with 2-dimensional direct stochastic optical reconstruction microscopy

말라 microfilaments, microtubules, 및 중간 필 라 멘 트 (IF)의 구성 골격 세포 모양, 극성, 및 운동 성의 제어에 핵심 역할을 한다. 말라와 microtubule 네트워크의 조직을 광범위 하 게 공부 하지만 IFs의 하지 아직 완전히 특징 이다. IFs는 평균 직경 10 nm의 형태로 세포 세포질에 걸쳐 확장 네트워크가 있다. 그들은 말라와 microtubules 분자 모터와 cytoskeletal 링커를 통해 물리적으로 연결 됩니다. 이 꽉 협회는 대부분의 세포 기능에 필요한 3 개의 cytoskeletal 네트워크의 조정된 규칙을 보장 하는 규제 메커니즘의 핵심 이다. 그것은 따라서 IFs 혼자와 각각 다른 cytoskeletal 네트워크의 함께 시각화 중요 합니다. 그러나, 만약 네트워크는 특히 glial 세포에서에서 대부분 셀 형식에 매우 조밀한 해상도 표준 형광 현미경 검사 법으로 달성 하기 매우 어려운 게 (~ 250의 해상도 측면 nm). 직접 확률적 광학 재건 현미경 (dSTORM) 한 작업량의 측면 해상도 증가 허용 하는 기술 이다. 여기, 우리가 측면 dSTORM 해상도 조밀한 조직 IF 네트워크의 그리고, 특히,의 경우 번들 microtubules를 둘러싼 해결을 보여줍니다. 이러한 꽉 협회는 이러한 두 네트워크의 조정된 규칙에 참여, 설명 어떻게 vimentin IFs 템플릿 및 microtubule 조직 안정화로 microtubule 종속 기공을 인신 매매에 영향을 미칠 수. 더 일반적으로, 우리는 듀얼 컬러 dSTORM 기술로 두 개의 cytoskeletal 컴포넌트의 관찰 그들의 상호적인 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하는 방법을 보여줍니다.

현미경 50 mW 405 nm 및 장비 100 mW 488, 561와 642 nm 고체 레이저, 한 EMCCD 512 x 512 카메라, 알파 계획 apo는 100 X / 1.46 객관적이 고 밴드 통과 570-650 / 긴 655 방출 필터를 통과 아래 제시 하는 대표적인 결과 위해 사용 되었다.
그림 1A raw 이미지 수집 하는 동안 사용 해야 하는 잡음 비율 분자 밀도 신호의 예를 제공 ?...

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Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행 하려면

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K 조회수.  Institut Pasteur. 이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행 하려면

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Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

연구

생체공학

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

생화학

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

면역학 및 감염병학

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

마이크로소관의 라벨이 없는 고속 이미징을 위한 간섭 반사 현미경 검사법 구현

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

생물학

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

3 차원에서 세포 외 소포의 직접 스토카스틱 광학 재건 현미경 검사

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as specialized arrays during mitosis to regulate chromosome segregation. Proteins that interact with microtubules include motors such as kinesins and dynein, which can generate active forces and directional motion, as well as non-motor proteins that crosslink filaments into higher-order networks or regulate filament dynamics. To date, biophysical studies of microtubule-associated proteins have overwhelmingly focused on the role of single motor proteins needed for vesicle transport, and significant progress has been made in elucidating the force-generating properties and mechanochemical regulation of kinesins and dyneins. However, for processes in which microtubules act both as cargo and track, such as during filament sliding within the mitotic spindle, much less is understood about the biophysical regulation of ensembles of the crosslinking proteins involved. Here, we detail our methodology for directly probing force generation and response within crosslinked microtubule minimal networks reconstituted from purified microtubules and mitotic proteins. Microtubule pairs are crosslinked by proteins of interest, one microtubule is immobilized to a microscope coverslip, and the second microtubule is manipulated by an optical trap. Simultaneous total internal reflection fluorescence microscopy allows for multichannel visualization of all the components of this microtubule network as the filaments slide apart to generate force. We also demonstrate how these techniques can be used to probe pushing forces exerted by kinesin-5 ensembles and how viscous braking forces arise between sliding microtubule pairs crosslinked by the mitotic MAP PRC1. These assays provide insights into the mechanisms of spindle assembly and function and can be more broadly adapted to study dense microtubule network mechanics in diverse contexts, such as the axon and dendrites of neurons and polar epithelial cells.

Here, we present a protocol for reconstituting microtubule bundles in vitro and directly quantifying the forces exerted within them using simultaneous optical trapping and total internal reflection fluorescence microscopy. This assay allows for nanoscale-level measurement of the forces and displacements generated by protein ensembles within active microtubule networks.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as ...

세포골격 네트워크를 시각화하기 위한 맞춤형 형광 현미경

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the dynamics of these 3D, dense networks calls for optical sectioning, which is often associated with fluorescence confocal microscopes. However, recent developments in light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) have established it as a cost-effective and, at times, superior alternative. To make LSFM accessible to cytoskeleton researchers less familiar with optics, we present a step-by-step beginner's guide to building a versatile light-sheet fluorescence microscope from off-the-shelf components. To enable sample mounting with traditional slide samples, this LSFM follows the single-objective light-sheet (SOLS) design, which utilizes a single objective for both the excitation and emission collection. We describe the function of each component of the SOLS in sufficient detail to allow readers to modify the instrumentation and design it to fit their specific needs. Finally, we demonstrate the use of this custom SOLS instrument by visualizing asters in kinesin-driven microtubule networks.

저자 스포트라이트: Advancing Knowledge in Far-From-Equilibrium Materials Through Light-Sheet Microscopy (광시트 현미경을 통한 평형에서 멀리 떨어진 재료에 대한 지식 발전)

This protocol describes in detail how to build a single-objective, light-sheet fluorescence microscope and its usage for visualizing cytoskeleton networks.

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...