이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (U1503223, 81673407, 21475131), 비영리 기술의 강성 (2016 C 37110), 닝 보 국제 과학 및 기술에 적용 하는 연구 프로젝트에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 협력 프로젝트 (2014 D 10019), 생명 과학 및 의료 (2015 C 110026)의 닝 보 시 혁신 팀, 닝 보 과학 및 일반적인 부 (2017 C 50042)에 대 한 기술 프로젝트, 리 투 합 입 어 턱 케네스 리 해양 의약품 개발 기금, 그리고 닝 보 대학에서 K. C. 웡 마그나 기금.

1. 솔루션 준비
주: 시 소스에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.
<ol><li>이중 증 류 물 100 mL에 BSA의 5 g을 추가 하 여 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티 원 올리고 머 항 체 OC 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>이중 증 류 물 1000 mL에 트리 스 베이스의와 NaCl의 88 g 24 g을 추가 하 여 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 재고 솔루션을 준비 합니다. PH 7.4에 조정 합니다. 최대 3 개월까지 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>준비는 Tris 버퍼 식 염 수와 트윈-20 (TBST) 솔루션 TBS의 100 mL에 트윈-20의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션 및 900 mL 이중 증 류 물.</li>
	<li>과산화 효소 (HRP) 염소-토끼 IgG (H + L) TBST 용액 10 ml와 사비의 추가 10 µ L에 의해 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>3.68 g 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10 mM curcumin 재고 솔루션의 1 mL에 curcumin의 분해.</li>
	<li>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP) 2.5 mg/mL Aβ 모노 머 솔루션의 2 mL에 합성 Aβ1-42 의 5 mg을 디졸브. 그것은 실내 온도 (25 ° C)에서 20 분 하 게 100 µ L aliquots에 대 한 놓고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장 합니다. 참고:이 절차를 가능한 한 빨리 실행 되어야 합니다. 피 펫 팁 정확한 pipetting 되도록 차단 한다.</li>
	<li>1: 1의 볼륨 비율 ECL 액체 A와 B를 혼합 하 여 electrochemiluminescence (ECL) 액체를 준비 합니다. 이 솔루션은 그냥 사용 하기 전에 준비 되어야 한다.</li>
</ol>2. 샘플 준비
참고: 분석 blotting 점 전에 2 일 샘플 준비를 수행 합니다.
<ol><li>Aβ1-42 단위체 솔루션;의 튜브에 이중 증 류 물 900 µ L를 추가 Aβ1-42 의 농도 0.25 mg/mL를 될 것입니다. 20 분 동안 실내 온도에 있는 혼합물을 놓습니다.</li>
	<li>볼륨은 약 850 µ L까지 고 순도 질소 가스와 함께 솔루션을 증발. Aβ1-42 솔루션의 농도 0.29 mg/mL에 대 한 것입니다. 참고: 솔루션 HFIP는 완전히 증발 되도록 때때로 동요 되어야 한다. 일반적으로, 증발의 30 분 후 잔여 솔루션의 볼륨은 약 850 µ L.</li>
	<li>Curcumin 재고 솔루션 curcumin 작업 솔루션 (0.2와 2 µ M)을 두 번 증 류 물으로 희석. 믹스 Aβ1-42솔루션, curcumin 볼륨 비율 1: 1의 솔루션을 작동. Curcumin의 최종 농도 0.1 1 µ M를 될 것입니다. 참고: 잠재적인 올리고 머 저 해제는 Aβ1-42 솔루션 필요한 경우 어떤 비율에서 섞일 수 있다.</li>
	<li>마그네틱 교 반기에 솔루션을 지속적으로 흔들어 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>자석 교 반기에 플라스틱 분배기 상자를 수정 합니다. 장소 2 자석 막대 상자 2 코너에서 저 어 고 상자 중심에서 샘플 튜브를 배치.</li>
		<li>48 h에 대 한 실 온 (25 ° C)에서 상자를 흔들어. 참고: 자석 교 반기 속도 약 60 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 튜브 원심 및 18000 x g.는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
</ol>3. 점 Blotting 분석
참고: 모든 외피 수평 통에서 수행 됩니다.
<ol><li>니트로 막 1 cm 넓은 스트립으로 잘라. 참고: 니트로 막의 폭 실험 필요에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>2 지구 (지구 1와 2) 0.5 cm에서 각 포인트 간격에 균등 하 게 2 µ L 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>밴드에 물방울이 건조 될 때까지 5 분 동안 실내 온도에 스트립을 놓습니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 5 %BSA 솔루션 스트립을 품 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 TBST 솔루션 스트립을 씻어.</li>
	<li>TBST 솔루션 발음 실 온에서 1 h, 스트립 1 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션을 품 어 및 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 2 스트립.</li>
	<li>씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.</li>
	<li>TBST 솔루션 발음 실 온에서 40 분 이차 항 체 솔루션 스트립을 품 어.</li>
	<li>씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.</li>
	<li>스트립의 표면에 혼합된 ECL 액체를 균등 하 게 적용 됩니다. 이미징 시스템 자동 화학에 스트립 노출 ( 재료의 표참조). 참고: 일반적으로, ECL 액체의 300 µ L 충분 한 막 이다. 막 노출 동안 축축한 유지 되어야 한다. 노출 시간 이미징 시스템에 의해 자동으로 계산 됩니다.</li>
	<li>반 정량적 결과 얻기 위해 ImageJ (국립 보건원) 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 회색 음영 분석을 할.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 우리 Aβ1-42 올리고 머를 포함 하는 샘플을 준비 하 고 분석 blotting 점이 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 방법을 보고 있다. Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플의 준비에 대 한 우리의 방법을 아주 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현할 수 있지만, 지금도 발견 될 몇 가지 포인트. 첫째, HFIP는 합성 Aβ1-42 펩 티 드를 분해 하는 데 사용 됩니다. 집...

Alzheimer의 질병 (광고) 노인 전세계1에 영향을 미치는 가장 중요 한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 그것은 널리 β 아 밀 로이드 (Aβ)의 비정상적인 집계 광고의 주요 병 적인 요인이 될 수 있습니다 허용 됩니다. Aβ 집계 광고 환자의 두뇌에서 생물 학적 마커 중 치 패의 주요 구성 요소는. 또한, Aβ 집계, 특히 올리고 포함 하 여 광고 진행으로 신경 죽음의 원인이 될 수 있습니다 강력한 neurotoxicity 생산. 따라서, Aβ 올리고 머 형성의 저해 되지 않도록 neurodegeneration, 그리고 Aβ 올리고 머 저 해제 수정 하는 질병으로 발전 될 수 있는 광고의 치료. 많은 연구 올리고 시험관을 형성, 형태학 및 인공 Aβ 올리고의 구조를 탐구 하 고 생체 외에서 모델2,3 를 사용 하 여 Aβ 올리고 머의 억제제를 조사 하는 합성 Aβ 펩 티 드를 사용 , 그러나 4., Aβ 올리고 머의 형성 프로토콜 다른 시험관에 다른 연구 그룹 사이에서 비교할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다 다른 형태학 상 특성을 가진 올리고 머를 발생할 수 있습니다. 따라서, Aβ 올리고 머에 대 한 표준 형성 프로토콜 절실히 필요 합니다.
지금까지 많은 방법은 직접 검색 Aβ 올리고 보고 되었습니다. 전송 전자 현미경 (TEM), 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 및 점 분석 blotting 사용할 수 있습니다 금액 또는 Aβ 올리고 머 생체 외에서5, 의 형태를 검사 하 6. 예를 들어 Aβ 올리고 머의 구조와 형태 TEM에서 관찰 될 수 있다. Aβ 집계의 분자 크기 및 상대 금액 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법에 의해 측정 될 수 있는. ELISA 혈 청, 플라스마, 및 뇌 조직에서 추출 물에서 Aβ 올리고 머를 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로, 분석, 검색, 사용 되는 기술 blotting 점 분석 및 단백질, 식별 사용할 수 올리고 머 및 Aβ 관련 항 체의 도움으로 다른 샘플 올리고 머 Aβ의 상대 농도 평가 하. 또한, 분석 결과 더 럽 히는 점이 젤 전기 이동 법 및 젤에 대 한 더 럽 히 절차 필요 하지 않습니다 상당한 시간 절약을 제공 합니다. 따라서,이 분석 결과 화면 잠재적인 Aβ 올리고 머 억제제를 일반적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표 분석, blotting 점으로 화면 Aβ 올리고 머를 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플 준비 하 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현성 메서드를 설명 하는 억제제 반 정량적 실험 결과 사용 하 여입니다.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td><td>Cell&amp;nbsp;Signalling Technology</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&amp;nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Dimethyl sulfoxide</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;times;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Super low range&amp;nbsp;protein Marker</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Membranes</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue Fast staining solution</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>All - automatic chemiluminescence imaging system</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic agitator</td><td>Shanghai Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

Β-아 밀 로이드 (Aβ)은 자체 집계로 조립 하는 본질적인 추세를 가진 소수 성 펩 티 드 이다. 다양 한 집계 중 Aβ 올리고 머 최고의 neurotoxin Alzheimer의 질병 (광고)의 진행으로 널리 인정 하 고 광고의 병 인에 중요 한 이벤트로 간주 됩니다. 따라서, Aβ 올리고 머 저 해제 수 neurodegeneration을 방지 하 고 수정 하는 질병으로 발전 될 가능성이 광고의 치료. 그러나, 다른 대형 프로토콜 Aβ 올리고 머의 다른 특성을 가진 올리고 발생할 수 있습니다. 또한, 효과적으로 화면 Aβ1-42 올리고 머 억제제를 많은 방법이 되지 있다. A11 항 체는 항 병렬 β 장 구조와 독성 Aβ1-42 올리고 머의 하위 집합으로 반응 수 있습니다. 이 프로토콜에는 합성 Aβ1-42 펩 티 드에서 에 체 외에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머-풍부한 예제를 준비 하 고 도트 blotting에 의해 상대적 양의 샘플에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머를 평가 하는 방법 설명 A11 Aβ1-42를 사용 하 여 분석-특정 6E10 항 체. 이 프로토콜을 사용 하 여, 억제제 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 수 또한 상영 반 정량적 실험 결과에서.

Aβ1-42 단위체 준비 후 Aβ1-42 올리고 머를 형성할 수 있습니다 여부를 조사 하기 가장 분석 사용 되었다. 아니 볼 수 집계는 HFIP 해산 Aβ1-42 단위체 샘플 (그림 1A)에서 관찰 되었다. 또한, 주위의 직경을 가진 주로 구형 집계 10-80 nm에서에서 관찰 되었다 Aβ1-42 샘플 떨고, 48 h 후 Aβ1-42 준비 (<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about A11-positive Î²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

a11-positive-amyloid-oligomer-preparation-assessment-using-dot

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.7K 조회수.  Ningbo University. 이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: A11-positive β-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

생화학

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure change. With the increase of AD patients worldwide, the pathology and treatment of the disease has become a focus in the International Pharmaceutical Industry. Thus, the establishment of the animal model to mimic AD in the laboratory is of great importance.
Here, we describe a detailed protocol for establishing a mimic of AD in a rat animal model though intracerebroventricular injection of amyloid beta protein 25-35 (A&#946;25-35) combined with aluminum trichloride (AlCl3) and anterodorsal thalamic nucleus injection of recombinant human transforming growth factor-&#946;1 (RHTGF-&#946;1) to rats. The related markers of AD were measured, including: spatial memory, neuronal structure and substructure, neuronal A&#946;, and neurofibrillary tangles (NFT) production. This rat model demonstrates spatial memory impairment, neuronal structure and substructure pathological changes, neuron intracellular A&#946; burden, and NFT aggregation, and provides a close mimic of the neuronal structure and function disorder to that of clinical AD patients. Thus, the presented AD rat modelprovides a valuable in vivo tool for exploring neuronal function, neuronal pathology, and drug screening of AD.

This is a protocol to mimic Alzheimer&#39;s Disease in rats by evaluation of spatial memory impairment, neuronal pathological changes, neuronal amyloid beta protein (A&#946;) burden, and neurofibrillary tangles aggregation, induced by the injection of A&#946;25-35 combined with aluminum trichloride and recombinant human transforming growth factor-&#946;1.

합성 아 밀 로이드 베타 단백질의 Intracerebroventricular 주입에 의해 쥐 동물 모델에서 Alzheimer의 질병의 귀중 한 모방의 설립

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

행동분석학

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding immunostaining (specifically for ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1), a calcium binding protein expressed by microglia) and tissue processing for electron microscopy (EM). Methoxy-X04 is a fluorescent dye that crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. Injection of the animals with methoxy-X04 prior to sacrifice and brain fixation allows pre-screening and selection of the plaque-containing brain sections for further processing with time-consuming manipulations. This is particularly helpful when studying early AD pathology within specific brain regions or layers that may contain very few plaques, present in only a small fraction of the sections. Post-mortem processing of tissue sections with Congo Red, Thioflavin S, and Thioflavin T (or even with methoxy-X04) can label &#946;-pleated sheets, but requires extensive clearing with ethanol to remove excess dye and these procedures are incompatible with ultrastructural preservation. It would also be inefficient to perform labeling for A&#946; (and other cellular markers such as IBA1) on all brain sections from the regions of interest, only to yield a small fraction containing A&#946; plaques at the right location. Importantly, A&#946; plaques are still visible after tissue processing for EM, allowing for a precise identification of the areas (generally down to a few square millimeters) to examine with the electron microscope.

This article describes a protocol for visualizing amyloid A&#946; plaques in Alzheimer&#39;s disease mouse models using methoxy-X04, which crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. It allows pre-screening of plaque-containing tissue sections prior to immunostaining and processing for electron microscopy.

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible for phagocytosis and clearance of debris and detritus. These cells include CNS-resident macrophages known as microglia, and mononuclear phagocytes infiltrating from the periphery. Light microscopy has generally been used to visualize phagocytosis in rodent or human brain specimens. However, qualitative methods have not provided definitive evidence of in vivo phagocytosis. Here, we describe quantitative 3D in silico modeling (q3DISM), a robust method allowing for true 3D quantitation of amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent Alzheimer&#39;s Disease (AD) models. The method involves fluorescently visualizing A&#946; encapsulated within phagolysosomes in rodent brain sections. Large z-dimensional confocal datasets are then 3D reconstructed for quantitation of A&#946; spatially colocalized within the phagolysosome. We demonstrate the successful application of q3DISM to mouse and rat brains, but this methodology can be extended to virtually any phagocytic event in any tissue.

Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

We developed a methodology for quantitative 3D in silico modeling (q3DISM) of cerebral amyloid-&#946; (A&#946;) phagocytosis by mononuclear phagocytes in rodent models of Alzheimer&#39;s disease. This method can be generalized for the quantitation of virtually any phagocytic event in vivo.

양적 3D<em&gt; 인 실리코</em알츠하이머 병의 쥐 모델에서 뇌 아밀로이드 - 베타 탐식&gt; 모델링 (q3DISM)

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

의학

Detecting Amyloid-&#946; Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies on accumulation of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain. A&#946; is produced from the proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &#946;-secretase and &#947;-secretase. In pathological circumstances, the increased &#946;-cleavage of APP leads to overproduction of A&#946;, which aggregates into A&#946; plaques. Since A&#946; plaques are a characteristic of AD pathology, detecting the amount of A&#946; is very important in AD research. In this protocol, we introduce the immunofluorescent staining method to visualize A&#946; deposition. The mouse model used in our experiments is 5&#215;FAD, which carries five mutations found in human familial AD. The neuropathological and behavioral deficits of 5xFAD mice are well-documented, which makes it a good animal model to study A&#946; pathology. We will introduce the procedure including transcardial perfusion, cryosectioning, immunofluorescent staining and quantification to detect A&#946; accumulation in 5&#215;FAD mice. With this protocol, researchers can investigate A&#946; pathology in an AD mouse model.

In the neuropathology of Alzheimer's disease, one of the most crucial characteristics is the deposition of amyloid-&#946;. In this protocol, we describe the method of immunofluorescent staining in 5&#215;FAD transgenic mouse to detect amyloid-&#946; accumulation in plaques. The process of perfusion, cryosectioning, staining and quantification will be described in detail.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비_{1-42와 유도}

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

합성 아 밀 로이드 베타 단백질의 Intracerebroventricular 주입에 의해 쥐 동물 모델에서 Alzheimer의 질병의 귀중 한 모방의 설립

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

양적 3D

Detecting Amyloid-β Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42와 유도

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

합성 아 밀 로이드 베타 단백질의 Intracerebroventricular 주입에 의해 쥐 동물 모델에서 Alzheimer의 질병의 귀중 한 모방의 설립

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

양적 3D

Detecting Amyloid-β Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비_{1-42와 유도}