Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
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우리는 라 Denti 감사, 발 렌 세와 직원에 대 한 안과의 UCL 학회에 생물 자원 단위의 기술 지원에 대 한 마우스 축산와 카밀 Charoy 도움이. 이 작품은 의료 연구 위원회 그랜트 (미스터/N011511/1) C. Ruhrberg와 jt는 가슴 앓이 (FS/13/59/30649)에 영국 심장 재단 박사 재학에 지원 됩니다.

모든 동물 작품 영국 홈 오피스 및 기관 동물 복지와 윤리적 검토 바디 (AWERB) 지침에 따라 수행 되었다.
1. 마우스 준비
참고: 6 개월 최대 최소 8 주 나이의 성인 쥐에 실험을 수행 합니다. 기술 재현성 및 다른 동물 사이이 절차의 각 단계에 대 한 일관 된 타이밍을 설명 하기 위하여 각 실험 세션 6 쥐의 2의 최소값 및 최대값을 사용 합니다. 유전자 변형된 마우스에 침투성 유도 물질에 돌연변이의 효과 평가 하려면 이상적으로, 2 돌연변이 생쥐 및 실험 당 2 littermate 제어를 사용 합니다.
<ol><li>자극 혈관 hyperpermeability, 전에 24 h anesthetize 적합 한 흡입 isoflurane 등 마 취를 사용 하 여 마우스. 마 취 유도 3 %isoflurane 사용 하 여 righting 반사 손실 되 고 마우스 외부 자극에 응답 하지 않는 때까지. 1.5 %isoflurane 마 취 유지 보수에 대 한 사용 (마우스 지속적인 호흡 속도 보장). 마 취, 신중 하 게 두 측면 각 마우스의 피부에 상해를 피하는 전기 면도기, 쉐이브. 참고: 마 취 동물에 스트레스를 초래 하지 않도록 하 고 면도, 피부 손상 될 수 있습니다 동안 움직임을 최소화 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>그것의 집 감 금 소를 면도 마우스를 반환 합니다. 남성 쥐에 대 한 각 남자에 배치는 개별 케이지 방지 하기 위해 마 취 회복 후 싸움 하 고, 따라서, 피부 손상. 여성 쥐에 대 한 반환 그들 그룹에 그들의 집에 감 금 소에. 참고: 싸우는 행동 장에, 남성 쥐 사이에서 관찰 되는 경우 절차를 하기 전에 그들을 분리 개별 연습장으로 피부 손상이 치유 수 있도록 실험 하기 전에 3 일 동안.</li>
	<li>그들은 (일반적으로 몇 초 이내)의 식을 복구할 때까지 이동 (1 분) 이내 케이지 쥐를 모니터링 합니다.</li>
</ol>2. 에반스의 주사 파랑 염료
<ol><li>층 류 캐비닛, 히 스타 민 억제제 pyrilamine maleate (4 µ g / µ L 0.9% 식 염 수에) 그리고 에반스 블루 염료 (0.9% 식 염 수에 1 %w / v)의 별도 살 균 솔루션을 준비 합니다. 22 µ m 필터를 통해 솔루션을 전달 하 여 소독.</li>
	<li>30g 바늘으로 살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 intraperitoneally 10 µ L pyrilamine maleate 솔루션/그램의 몸 무게 (그림 1A)와 각 마우스를 주입. 수행 하 주입, 첫 번째, 아저씨는 마우스 고 머리는 땅으로 감독 하 고 복 부 위쪽으로 지시 된다 다음 그것을 기울이기. 방광을 타격을 피하기 위해 중간에서 복 부의 더 낮은 사분면에 주사. 참고: 8 주 및 6 개월의 나이 사이 마우스의 무게 보통 15와 30 g. Pyrilamine maleate 사이의 범위 것입니다 억제 혈관 누설 테스트 에이전트에 독립적으로 추진 그렇지 않으면 것 내 인 성 히 스타 민 방출.</li>
	<li>혈관 확장을 촉진 10 분 동안 37 ° C 열 챔버에 마우스를 놓습니다. 또는 열 램프의 사용은 로컬 윤리 지침에서 허용 하는 경우 혈관 확장을 촉진 하는 꼬리에 초점을 맞춘 적당 한 열 램프를 사용 합니다.</li>
	<li>마우스 restrainer를 한 번에 한 마우스를 이동 하 고 70% 에탄올 주입 영역을 청소 하 고 혈관을 더욱 촉진에 꼬리를 문 지 르 세요.</li>
	<li>30g 바늘으로 살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 100 µ L를 관리할 에반스 블루 염료 (그림 1B) 꼬리 정 맥을 통해 정 맥. 출혈을 방지 하기 위해 엄지 손가락 사이 꼬리를 눌러 압력 사출 사이트에 즉시 적용 됩니다. 참고: 시각화의 꼬리 정 맥 주입 영역에 등불을 연출 하 여 개선할 수 있습니다. 마우스 꼬리 정 맥에 정 맥 주사를 수행에 더 세부 사항 게시 프로토콜18에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>30 분 순환 하는 염료를 허용 합니다.</li>
</ol>3. 자극 관 Hyperpermeability
<ol><li>층 류 캐비닛에 살 균 솔루션을 사용 하 여, 마지막 복용량 20 µ L의 볼륨에 전달 될 수 있는 농도에 대 한 관심의 침투성 유도 에이전트 희석. 참고: VEGFA에 PBS, µ 2.5 ng/L의 농도에서 혈관 hyperpermeability를 자극 하는 그림 1-그림 2에 표시 된 예제에서는 실험에서 저조한 50 ng, 그리고 PBS의 총 복용량 사용 됩니다 차량 제어로.</li>
	<li>31 G 바늘으로 2 별도 살 균 300 µ L 주사기를 관심 및 차량 제어의 침투성 유도 에이전트를 로드 합니다. 로드를 3 중에서 솔루션의 20 µ L 각 마우스 주입 충분 한 솔루션 (즉, 바늘의 죽은 볼륨에 대 한 계정에 에이전트와 마우스, 플러스 추가 볼륨 당 차량 60 µ L 준비).</li>
	<li>Isoflurane (마 취 유도 righting 반사 손실 되 고 마우스 외부 자극에 응답 하지 않는 때까지 3%와 1.5% 마우스 지속적인 호흡 속도 확인 하 고 마 취 유지 보수에 대 한) 테스트를 첫 번째 마우스 anesthetize</li>
	<li>Intradermally 마우스 (그림 1C)의 측면에 침투성 홍보 에이전트의 20 µ L를 삽입할. 바늘을 피부에 15 °의 각도에서 인지 확인 합니다. 성공적인 주입을 나타내는 피부 내 제기 거품의 형성에 대 한 확인 하십시오. 2 추가 사이트는 최소 1 c m 간격에 피부 주입을 반복 합니다.</li>
	<li>2 측면을 노출 하 고 반복 제어 차량 솔루션 triplicate 주사 마우스를 설정 합니다. 피부 샘플의 후속 컬렉션에 대 한 그들의 id를 촉진 하기 위하여 각 사출 사이트의 위치 종이에 기록 합니다. 참고:이 단계; 주의 마우스 피부 처리 예를 들어 피부 피부 주사를 수행할 때 곤란 하 게 하지 마십시오.</li>
	<li>주입 된 마우스의 홈 케이지를 반환 하 고 의식 (일반적으로 몇 초 이내) 복구 하 고 감 금 소의 주위에 이동 될 때까지 마우스를 모니터링.</li>
	<li>최초의 마우스, 복구 하는 동안 즉시 단계 3.3 두 번째 마우스와 함께 3.5에 (최대 세션 당 극대로 6 쥐)를 반복 합니다. 다음 단계를 진행 하는 시간을 조정 하려면 각 마우스 주입 했다 시간의 기록을 유지.</li>
</ol>4. 진 피 내에서 축적 된 에반스 블루의 정량화
<ol><li>쥐 주입 했다 순서 관찰 피부 주사 받은 후 자 궁 경부 전위 20 분 여 각 마우스를 컬링 합니다. 참고: 혈관 누설의 기간 사용 하 고, 침투성 유도 에이전트에 따라 다를 수 있습니다 그리고, 그러므로, 피부 주입 및 학살 사이의 시간 최적화 할 수 있습니다.</li>
	<li>각 장소는 그것의 뒤에 코르크 보드에 그것의 발 (그림 1D) 깨끗 한 휴지로 싸서 핀 마우스를 잡아가고.</li>
	<li>무딘가 위를 사용 하 여, 죽은 마우스의 가슴까지 아랫에서 약 3-4 cm의 수직 절 개를 확인 합니다. 포 셉, 메스 피부 안쪽의 진 피와 에반스 블루 축적 (그림 1E)의 사이트에 두 측면에서 멀리 애타게. 그리고 느슨한 피부 아래 핀 메스와 누설 사이트 주위 지역에서 지방을 제거. 필요한 경우 피부에 에반스 블루 누설의 크기를 설명 하는 대표적인 사진을 찍어.</li>
	<li>포 셉, 메스를 사용 하 여 구성 된 각 사이트에 대 한 유출된 에반스 블루 염료 소비 세 피부 지역 침투성 유도 에이전트 또는 차량 주입. 참고: 비슷한 크기, 후속 단계 4.7에 formamide 볼륨의 유사한 부분 이다 흡착 될 나머지 formamide의 비슷한 볼륨에 희석 추출 된 염료를 수 있도록 각 피부 샘플 되도록 피부 영역을 삭제할 주의 . 3.5 단계에서 기록 된 주입 지도 excised 될 영역을 정의 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 각 샘플을 배치 하 고 튜브의 하단에 달려있다 각 샘플 확인 하 고 그에 따라 분류. 추가 사용까지 20 ° C에서-샘플을 저장 합니다. 즉시 처리 하는 경우 아래 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>오븐에서 또는 55 ° c.에가 열 블록의 우물에 오픈 튜브를 배치 하 여 피부 샘플을 밤새 껏 말리</li>
	<li>에반스 파란색 염료를 추출 하는 증기 두건에서 샘플을 이온된 formamide의 250 µ L를 추가, 튜브. 피부 샘플 들은 모두는 formamide 고 오븐 또는 55 ° c.에가 열 블록에서 밤새 품 어 다는 것을 확인합니다</li>
	<li>샘플 최대 속도로 벤치탑 원심 분리기에 원심 (> 10000 x g) 40 분.</li>
	<li>증기 두건에서 투명 하 고, 평평한 바닥 96 잘 접시 (그림 2A)의 별도 우물에 염료를 포함 하는 상쾌한의 100 µ L 각 샘플에서 전송.</li>
	<li>측정 최대 620에서 흡 광도 에반스 블루 nm 740의 참조 독서는 분 광 광도 계에 nm. 참고: 620 nm는 피크의 에반스 블루 흡 광도, 동안 740 nm 에반스 블루 흡수 되지 및 참조 파장 역할.</li>
	<li>기술 변화 (그림 2B)에 대 한 계정에 동일한 에이전트 또는 각 마우스에 대 한 차량 triplicate 주사의 흡 광도 신호 평균.</li>
	<li>차량 제어 (그림 2C) 대 침투성 유도 에이전트에서 판독의 배 차이 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 선언에 전혀 상반 되는 관심사를 있다.

195217에 그것의 첫 번째 설명, 이후 마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 분자 메커니즘을 공부에 대 한 비교적 간단, 신속 하 고 안정적인 방법으로 연구자를 제공 하고있다. 예를 들어 마일 분석 결과 능력 또는 다른 대리인의 힘 hyperpermeability19,20,21 을 유도 하거나 hyperpermeability 차단 에이전트8 의 효능을 테스트 하려면 테스트를 사용 되었습니다. ,2223. 또 다른 예로 혈관 침투성을 유발 하는 에이전트 테스트 유전자 변형된 생쥐와 그들의 littermate 컨트롤의 특정 수용 체와 신호 ligand 유도 된 hyperpermeability에 대 한 단백질 시험 요구 사항을 결정 하 응답10,11,12,13,,1415,20,23. 마일 분석 결과의 여러 수정된 버전 이후 사용 되고있다, 예를 들어 추적 프로그램 사용에 관하여. 따라서, 에반스 블루는 되었습니다 대체 다른 크기 또는 스피어11,13dextrans 형광 표시와 일부 연구.
조사 관 hyperpermeability 메커니즘에 대 한 다른 분석을 통해 마일 분석 결과의 주요 이점은 이다 그것은 비교적 쉽게 수행 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 또한, 기술로 vivo에서 , 그대로 혈관의 맥락에서이 분석 결과 모델 혈관 누설 통해 누설 측정으로 체 외에 분석 실험 같은 뿐만 아니라 트랜스 유량 분석 실험 또는 트랜스 내 피 전기 저항 ( 내 피 단층에, 전적으로, 초점 TEER) 분석 분석 실험 대체 vivo에서 혈관 hyperpermeability의 hyperpermeability 유도 에이전트에 대 한 다른 배달 경로 사용 하 여 또는 다른 사이트에서 혈관 누설에 대 한 분석 하 여 여기에 설명 된 마일 분석 결과에서 다를 수 있습니다. 폐 나 기관지11,,1315혈관 누설 시험 뒤 꼬리 정 맥을 통해 에이전트의 체계적 전달에 의해 예. 마일 분석 결과의 한 가지 한계는 특정 에이전트의 피부 주입 수 있습니다, 원칙적으로, 또한 혈압과 내 피 장벽 파괴 뿐만 아니라 흐름에 영향을, 따라서, 영향 하지 혈관 침투성도 직접. 그럼에도 불구 하 고,이 분석 결과 최근 표시 되었습니다 측정 혈관 침투성에 의해 유도 된 VEGF-A15조직 혈압 영향을 독립적으로. 마일 분석 결과의 또 다른 한계는 다른 조직에서 혈관 침대 응답 수 있습니다 다르게에 침투성 홍보 요원, 그리고 피부에 마일 분석 결과 함께 결과 않을 수 있습니다, 따라서, 대표, 예를 들어에서 발생의 이다는 폐 또는 두뇌입니다.
동물의 나 이와 체중 누설 마일 분석 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 변수들의 효과 최소화 하기 위해 연구원 littermates를 사용 해야 합니다 또는 마찬가지로 크기 고 컨트롤로 마우스를 세. 관심사의 특정 유전자에 대 한 마우스 돌연변이 평가할 때는 heterozygous heterozygous 번 식 전략 및 wildtype littermates 컨트롤로 사용 대 통해 쥐를 생성 합니다. 또한, 그것은 비 경구 주입24,25통해 관리 일부 마 취 약물에 대 한 설명 하고있다 vasoconstriction을 피하기 위해 isoflurane, 등 신속 하 게 되돌릴 수 가스 마 취약을 사용 하는 것이 좋습니다. 마우스 측면 꼬리 정 맥으로 에반스 블루 염료의 주입이이 프로토콜에서 중요 한 단계 이며, 실험 및 데이터의 품질에 크게 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 연구원은 꼬리 정 맥 주사를 수행할 유능한 이어야 하며 것입니다 가능성이 필요 마일 시험 시작 하기 전에 이전 경험 또는 실험. 또는, 연구원은 에반스 블루, 복고풍 궤도 주입 그들은 그것을 경험 하는 경우 등을 제공 하 다른 정 맥 경로 사용할 수 있습니다. 침투성 추진의 피부 주입 솔루션 에이전트 독립 손상 피부에 발생할 수 있습니다. 따라서, 피부 주사 볼륨에서 20 µ l를 초과 하지 않아야 합니다, 해야 항상 히 스타 민 억제제의 실시 되며 차량 제어 주사 정규화.
마일 분석 결과 사용 되었습니다 많은 연구자에 의해 VEGF A 신호 통로의 예를 들어 구성 요소를 평가 하 VEGF A 유도 혈관 침투성 복수 암 환자16 및 여러 신생의 비전 방해 부 종 때문에 눈 질병7. 따라서, 우리와 다른 사용 마일 분석 결과는 VEGF A 신호 폭포12,13,14, 의 특정 구성 요소 부족 유전자 조작 된 생쥐에서 VEGF A 유도 혈관 누설을 비교 하 15 , 20 , 23.이 방법을 사용 하 여 우리의 최근 연구 결과 밝혀 주요 병 적인 VEGF A isoform, VEGF165, VEGFR2 및 NRP1, NRP1 세포질 도메인 SRC 가족 kinases의 ABL 중재 하는 키 니 아 제 활성화를 촉진 하는의 복잡 한을 통해 신호 14hyperpermeability 응답 보여주고 있습니다. 또한 VEGFA 혈관 성장을 촉진 하 고 따라서 치료 hyperpermeability 활동 특히 저해 될 수 있는 경우 허 혈 성 조직에 혈액 흐름을 복원 하는 데 사용할 수. Elucidating 혈관 hyperpermeability로 혈관 내 피 세포의 VEGF A 응답을 조 타 하는 분자 메커니즘 연구 따라서 병 적인 VEGF A 유도 부 종 억제 하기 위해 선택적으로 조작 될 수 있습니다 경로 식별할 수 있습니다, 에 질병, 암 등 허 혈 성 안과 질환. 마일 분석 결과 의심할 여 지 없이 이들과 많은 다른 유형의 기능 연구 분자 레 귤 레이 터 및 혈관 hyperpermeability의 이펙터를 명료 하 게를 근간에 유용한 방법으로 계속 됩니다.

심장 혈관 시스템의 주요 기능은 순환 및 모든 장기에서 조직 사이의 가스, 영양소, 및 폐기물의 전송을 활성화 하는 것입니다. 혈관 같은 교류1허용 기저 침투성의 기관 특정 수준이 있다. 예를 들어, 신장에 혈관은 혈액 뇌 장벽, 높은 꿰 뚫을 수 없는 인터페이스2,,34를 형성 하는 동안 높은 투과성, 있습니다. 혈관의 내벽을 형성 하는 내 피 세포 순환 및 기본 조직 사이 물리적 방 벽을 제공 하 고 기관 특정 방식으로 혈관 침투성을 조절. 그러나, 특정 자극 기저 레벨1위에 interstitium에 순환에서 액체 넘쳐 흐름을 증가 하는 내 피 방 벽의 부분적인 붕괴를 일으킬. 그런 hyperpermeability는, 예를 들어 조직 외상, 염증, 종양에 사이트에서 동안 관찰 패 혈 증, 신생 질병 또는 뇌와 심장, 눈에 조직 허 혈 뇌졸중 또는 심근 경색, 각각 발생 하는 경우 5 , 6 , 7 , 8. 만성 상승 하는 때 hyperpermeability를 차례로 눈 질환9시력의 손실 등 조직 손상, 부 종, 리드. 따라서, 혈관 hyperpermeability 응답 모델링은 내 피 침투성을 증가 하는 메커니즘을 이해 하 고 이것을 억제 하도록 설계 된 에이전트의 효능을 테스트 하는 것이 좋습니다.
마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 대리 측정으로 혈관 누설에 vivo에서 측정 하는 잘 설립 하 고, 일반적으로 사용 되 고 비교적 간단한 기술입니다. 합성 내 피 장벽 규제, 혈압 이나 혈액의 흐름, 별도로 혈관 누설을 증가 시킬 수 있습니다 요소 계정 고려 하지 않습니다 비록 마일 분석 결과 일반적으로 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공 생각은 물질의 침투성 변조 활동 그들의 활동을 홍보 하는 신호 중재자를 식별. 따라서, 마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 중재자와 행동10,,1112,13, 의 그들의 메커니즘을 식별 하는 다 수의 연구에 필수적인 되었습니다 14,15, 등 혈관 내 피 성장 인자 VEGF A는 VPF16혈관 침투성 요소로 식별 원래 이었다.
원래 마일이 고 기니 피그17혈관 침투성을 공부 하 여 개발 된, 그들의 분석 결과 혈관 침투성의 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 선택의 모델 유기 체 이제는 마우스를 사용 하 여 이후에 적응 했다 유전자 조작의 절묘 한 적합성으로 인해 규정. 간단히, 에반스 블루 염료는 정 맥 성인 쥐에 주입 하 고 30 분 (그림 1)에 대 한 순환 허용. 차량 제어 대 침투성 유도 요원은 intradermally 유도 혈관 누출 (그림 1) 마우스의 측면에 반대에 여러 사이트에 주입 됩니다. 따라서, 알 부 민-바운드 에반스 블루 염료 extravasates 하 고 (그림 1) 진 피에 축적. 마우스를 학살 하는 고통 없이, 후 에반스 블루 진 피에서 추출 되 고 혈관 누출의 레벨 테스트 물질을 차량-유도의 비율로 계산 광학 밀도 (그림 2).

<table><tbody><tr><td>Pyrilamine maleate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>Resuspend in PBS</td></tr><tr><td>Deionised Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Microlance Needles 30g x 0.5&quot;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Plastipak 1ml Luer</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

등뼈 동물 유기 체에 있는 혈관 피의 주요 기능은 혈액 세포, 플라즈마 고분자와 물에는 피 내 막의 침투성에 따라 적용할 수 있습니다 그것에 의하여 신체의 각 조직과 혈액 사이 방 벽으로 봉사 하는 생리 적인 필요 합니다. 특정 질병에서 cytokines 및 성장 요인 출시 대상으로 뚜렷이 증가 혈관 침투성; 내 피 장벽 그러나, 그들의 장기간된 존재 만성 혈관 hyperpermeability 그리고 그로 인하여 조직 손상 부 종이 발생할 수 있습니다. 마일 분석 결과 혈관 누설의 프록시 측정을 통해 혈관 hyperpermeability를 공부 하는 연구자를 허용 하는 비보에 기법 이다. 여기, 우리는 포유류 생리학과 병리학 공부에 가장 널리 사용 되는 모델 생물 마우스에서이 절차를 수행 하는 방법에 자세한 프로토콜을 제공 합니다. 절차는 반대 하는 마우스의 옆구리에 침투성 유도 요원 및 차량 제어 솔루션의 여러 피부 주사 뒤 순환 알 부 민을 에반스 블루 염료의 정 맥 주입을 포함 한다. 따라서, 에반스 블루 염료는 점차 진 피로, 그것은 축적 하 고 차량 기준으로 유도 하는 침투성 에이전트에 의해 유도 된 누설으로 정량화에 대 한 추출 될 수 있다 누출. 마일 분석 결과 야생 타입에서 수행할 수 또는 유전자 마우스 모델을 수정 및 약국 혈관 침투성 규제 요원 대상 유도 또는 차단 수 있는 식별 하는 분자 메커니즘 연구와 결합 될 수 있습니다. hyperpermeability입니다.

우리 사용 마일 분석 결과 wildtype C57/Bl6 마우스에서 차량 제어 (PBS)를 기준으로 혈관 누설 유도 VEGF A의 능력을 평가 합니다. 자, 우리 대표 실험 50를 포함 하는 20 µ L 솔루션의 피부 주입으로 자극된 wildtype 마우스를 사용 하 여 보여 VEGF-A PBS 또는 차량 PBS만의 ng. VEGF A 주사 피부 샘플에서 에반스 블루 염료 누설에 명확한 증가 명백한 제자리에 (그림 1E)는 PBS에 비해 formamide (그림 2A)에 염료의 추출 후. 여러 실험의 정량화를 보여줍니다 50 ng VEGF의 크게 더 에반스 PBS 혼자 (그림 2B), 평균 보다 블루 누설 3-fold 혈관 누설 차량 (그림 2C)에 비해 증가 유도.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> 그림 1: 마일 분석 결과에서 혈관 누설 유도. 도식 표현 (상단 패널) 및 해당 이미지 (하단 패널)의 순차적 단계는 마우스에서 마일 시험을 수행할 때. (A) Pyrilamine maleate intraperitoneally (B) 100 µ l 1% 에반스 블루를 꼬리에는 마우스의 정 맥의 정 맥 주입 전에 10 ~ 30 분 내 인 성 히 스타 민의 릴리스를 방지 하기 위해 주입. (C) 30 분 후, 혈관 누설 에이전트의 피부 주입에 의해 유도 된다 (50 ng VEGF-A;의 동그라미를 그린) 차량 제어 (PBS, 흰 동그라미) 대. (D, E) 에반스 블루 축적의 사이트에 액세스 하려면 마우스 피부 주사 후 학살된 20 분 이며 두 측면의 피부를 해 부하 고 쌓. i.p.: 복; i.v.: 정 맥; 아이디: 피부; 스케일 바, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> 그림 2: 혈관 누설 마일 분석 결과에서 정량화. (A) 에반스 블루 염료 흡 광도 분 광 광도 계 독서에 대 한 96 잘 접시에 로드 및 그림 1 에서 각 피부 주입에서 가져온 피부 샘플에서 formamide에서 추출 됩니다. (B, C) 두 유도 하는 침투성 에이전트의 중 (B) 정규화 된 흡 광도 값 (광 밀도, OD) 그려서 여러 실험에서 흡 광도 판독의 그래픽 표현 (VEGF A; 어두운 동그라미를 그린) 및 차량 (PBS; 회색 서클), 또는 (C) 배 세에 차량 대 에이전트에 대 한 변경 (오차 막대: sem의). Triplicate PBS와 (A)에 표시 된 VEGF A 샘플의 흡 광도 수치는 평균 하 고 흰색 또는 녹색 원으로 각각 (B, C)에 표시 된. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

evaluating-vascular-hyperpermeability-inducing-agents-skin-with-miles

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K 조회수.  University College London. 여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

연구

발생학

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

암 연구학

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

의학

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

생체공학

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

혈관 기능 및 형태의 비 침습적 평가에 대한 방법 론적 접근

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ultimately lead to new knowledge concerning the causes of or new ways to inhibit or treat plasma extravasation. It is important that researchers have the proper tools, including the best methods available, for studying plasma extravasation. In this article, we describe a protocol, using the Evans blue dye method, for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice. This protocol is intentionally simple, to as great a degree as possible, but provides high quality data. Evans blue dye has been chosen primarily because it is easy for the average laboratory to use. We have used this protocol to provide evidence and support for the hypothesis that the enzyme neprilysin may protect the vasculature against plasma extravasation. However, this protocol may be experimentally used and easily adapted for use in other strains of mice or in other species, in many different organs or tissues, for studies which may involve other factors that are important in understanding, preventing, or treating plasma extravasation. This protocol has been extensively optimized and modified from existing protocols, and combines reliability, ease of use, economy, and general availability of materials and equipment, making this protocol superior for the average laboratory to use in quantifying plasma extravasation from organs.

In this article, an economical, optimized, and simple protocol is described which uses the Evans blue dye method for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice that can be adapted for use in other strains, species, and other organs or tissues.

최적화 된 에반스 블루 마우스에서 혈관 누출을 평가 하는 프로토콜

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

생물학

인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘 조사

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate mechanisms of vascular smooth muscle and endothelial function in the cutaneous circulation. This technique allows for the pharmacological dissection of the pathophysiology of microvascular endothelial dysfunction as indexed by decreased nitric oxide-mediated vasodilation, an indicator of cardiovascular disease development risk. In this technique, a microdialysis probe is placed in the dermal layer of the skin, and a local heating unit with a laser Doppler flowmetry probe is placed over the probe to measure the red blood cell flux. The local skin temperature is clamped or stimulated with direct heat application, and pharmacological agents are perfused through the probe to stimulate or inhibit intracellular signaling pathways in order to induce vasodilation or vasoconstriction or to interrogate mechanisms of interest (co-factors, antioxidants, etc.). The cutaneous vascular conductance is quantified, and mechanisms of endothelial dysfunction in disease states can be delineated.

저자 스포트라이트: 심혈관 질환 위험 집단의 메커니즘을 밝히기 위한 약리해부 접근법 

Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate microvascular function in health and disease. Both dose-response and local heating protocols can be utilized for this technique to explore mechanisms of vasodilation and vasoconstriction in the cutaneous circulation.

피내 미세투석: 인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘을 조사하기 위한 접근 방식

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

요약

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유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기

생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

혈관 기능 및 형태의 비 침습적 평가에 대한 방법 론적 접근

최적화 된 에반스 블루 마우스에서 혈관 누출을 평가 하는 프로토콜

Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

피내 미세투석: 인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘을 조사하기 위한 접근 방식

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