나고야 대학에서 요코타 나 오 유야 아 사이 부동성 공장 섹션에 대 한 낮은 온도 항 검색의 개발에 대 한 유용한 제안을 제공 하는 감사 합니다. 이 작품 지원 연구비에 의해 Scientific Research (KAKENHI) (C) 2012 (JP25460493)와 (B) 일본 사회 과학의 승진 (JSP)에 대 한 2017 년 (JP17H04065), A 단계 부여 2014 (AS251Z02522Q) 및 2015 년 (AS262Z00715Q)에서 일본 과학 기술 기구 (JST)와 다케다 비전 연구 (석사)에 다케다 과학 재단에서 부여 2014.

여기에 설명 된 모든 방법 동물 관리 및 사용 발달 연구, 아이치 휴먼 서비스 센터에 대 한 연구소의 위원회에 의해 승인 되었다 (출원 번호: M-03).
1입니다. 준비
<ol><li>10 L 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 준비: 32.27 g Na2HPO4·12H2O, NaH2포4·2H2O, 4.5 g의 NaCl의 80.0 g 실 온 (RT)에서 10 L. 저장소 솔루션의 최종 볼륨을 초순에 추가.</li>
	<li>PBS-t: 200 mL의 PBS의 단계 1.1에서에서 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르의 100 µ L 0.05% (vol:vol)의 최종 농도에 200ml를 준비 합니다. 실시간에 저장소</li>
	<li>장갑과 눈 보호를 입고, 하는 동안 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL 준비: 자당 10%에 추가의 7.5 g을 50 mL의 최종 볼륨 중성 포 르 말린 솔루션 (자료 테이블) 버퍼링. 실시간에 저장소 주의: 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 포름알데히드와 흡입 또는 피부 또는 눈 접촉 위험 수 있습니다. 신중 하 게 처리 합니다.</li>
	<li>200 단위/mL phalloidin 형광 염료 어원이 재고 솔루션의 1.5 mL를 준비: phalloidin 형광 염료 켤레 (1 유리병, 동결 건조 된 고체, 여기 및 방출 파장 300 단위: 581 및 609 nm, 각각)의 1.5 mL에 메탄올입니다. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션</li>
	<li>준비 5 mg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션: N, N-dimethylformamide (DMF) 2 mL에 DAPI 10 밀리 그램. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션</li>
	<li>5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에서 준비: 0.5 g, BSA의 PBS의 10 mL. 4 ° c.에 게</li>
	<li>집게를 사용 하 여 18-게이지 바로 바늘의 경사진된 끝을 제거 하 고 액체 바늘 루멘 (그림 1A1)을 통해 흐름을 수 있도록 세로 방향으로 핀 처와 물린된 끝을 꼬집어. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>2. 동물 해 부와 공장의 절연
<ol><li>마우스의 관류 고정<ol>
<li>장갑을 착용 하 고 통풍이 잘되는 지역에서 작동.</li>
		<li>100 mL 유리 비 커를 준비, 10% 중성 포 르 말린 솔루션, 수술 도구 (가 위, 집게), 금속 트레이 버퍼링, 6-0 나일론 봉합, 1.7, 같이 준비 18 게이지 바로 바늘 22 게이지 날개 달린된 바늘, 20 mL 주사기.</li>
		<li>20 mL 주사기에 유리 비 커에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL를 로드 하 고 콘센트에 연결할 22 게이지 날개 달린된 바늘.</li>
		<li>50 mL 원심 분리기 튜브에서의 PBS (최종 5% 젤라틴) 20 mL에 젤라틴 가루 1 g을 추가 하 여 액체 젤라틴을 준비 합니다. RT에 15 분 동안 몸을 담근 채, 후 동요 없이 15 분 동안 물 목욕에서 50 ° C에서 품 어.</li>
		<li>짧게 소용돌이, 그리고 또 다른 15 분 완전히 젤라틴 분해 50 ° C에서 품 어. 사용까지 RT에 튜브를 둡니다.</li>
		<li>자 궁 경부 전위에 의해 성인 마우스를 안락사.</li>
		<li>금속 쟁반에 단계의 2.1.6 마우스를 놓고 수술 도구를 사용 하 여 ensiform 연골을 통해 피부에 작은 절 개를 하 게 합니다.</li>
		<li>흉부와 복 부 지역 노출 양손으로 절 개를 확장 합니다.</li>
		<li>노출 횡 경 막, 복 막 열고 양쪽에 다이어 프 램을 엽니다.</li>
		<li>흉부 새 장 양쪽 모두 앞쪽 axillary 라인을 따라 잘라 다음 마음을 노출 thymus의 위치에서 가로 방향으로 절단 하 여 흉 벽을 제거 합니다.</li>
		<li>혈액을 배수 하 고 좌 심 실의 꼭대기에 22 게이지 날개 달린된 바늘을 삽입 하는 오른쪽 아 트리 움의 auricle에 작은 절 개를 확인 합니다. Perfuse 버퍼 10% 중성 포 르 말린 솔루션으로 조직에 플런저를 밀어.</li>
		<li>골반에 장기 노출 후, 항문에서 직장의 끝을 잘라 하 고는 mesentery를 절단 하 여 시체에서 내장을 분리 합니다.</li>
		<li>공장을, 4cm 위 동굴의 항문 쪽에서에서 내장을 잘라. 나머지 소장의 항문 절반을 삭제 합니다.</li>
		<li>반 물 내리는 절차를 촉진 하기 위하여 공장을 클립. 부하 20 mL의 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL 주사기에 버퍼링 고 18 게이지 바로 바늘 단계 1.7 콘센트에서에서 준비를 연결 합니다.</li>
		<li>잘린된 공장 장의 내용을 제거 하 고 창 자 루멘 표면 (그림 1A2)를 해결 하기 위해의 한쪽 끝에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 솔루션을 주입.</li>
		<li>2.1.15 단계에서 설명한 대로 PBS를 주입 하 여 창 자 루멘을 씻어.</li>
		<li>2.1.15 액체 젤라틴 PBS 바꿉니다 단계에서 설명한 대로 창 자 루멘에 액체 젤라틴을 플러시.</li>
		<li>6-0 나일론을 사용 하 여 봉합 결 찰에 의해 잘린된 공장의 가까이 한쪽 잘라 봉합 하 고 액체 젤라틴 공장 채울 봉합 결 찰 (그림 1A3)에 의해 반대쪽 끝을 닫습니다.</li>
		<li>Cryomold (그림 1A4)의 우울된 부분에 소시지 모양의 공장 섹션에 맞게 4 봉합 사 매듭을 추가 합니다. 참고: cryomolds는 20 m m x 25 m m x 5 m m 우울된 섹션으로,에 대 한 ~ 20 밀리미터 소시지 같은 공장 섹션이 바람직합니다.</li>
		<li>4 ° c.에서 하룻밤 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL에 조직을 담근 다 참고: 이러한 단계 젤라틴 및 조직의 포 르 말린에 의해 자당 및 단백질 고정 하 여 cryoprotection을 확인합니다. 실시간에 고정 되지 않은 gelatinized 젤라틴 4 ° C에서 녹는 반면 말린 gelatinized 젤라틴 RT에 녹여 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 젤라틴 가득 공장 조직의 스냅
<ol><li>봉합 사 매듭에 공장을 잘라서 출혈 양쪽으로 3 개의 소시지 같은 공장 조각 (그림 1A4) 얻을 수 있습니다. 소시지와 같은 조각 포함 동결된 조직 표본의 준비에 대 한 화합물의 추가 대 한 cryomold에 맞춥니다.</li>
	<li>스냅 동결에 액체 질소로 냉각 isopentane cryomold. Cryomolds-80 ° C에서 저장 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>4. 면역 형광이 술의 부동성 Cryosections를 사용 하 여 세포
<ol><li>Cryosectioning<ol>
<li>-22 ° c cryostat 챔버 온도 (CT) 및 개체 온도 (OT)를 설정 장소 냉동된 조직 적어도 15 분 동안 cryostat 챔버에 cryomold에서 차단 합니다.</li>
		<li>35 m m 문화 접시에 PBS의 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>cryomold에서 냉동된 조직 블록을 제거 하 고 공장의 횡 근 섹션 노출 면도날으로 반 블록을 잘라. 탑재 한 척 (cryostat 어댑터) 절단 평면 면도날을 섹션에 블록의 절반.</li>
		<li>섹션 30 µ m 두께 섹션으로 젤라틴 가득 공장. 사용 고정 집게를 부드럽게 준비 단계 4.1.2 (그림 2B오른쪽)에서 35 m m 문화 접시에 섹션을 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 차 항 체의 응용<ol>
<li>각 상호 통에 가벼운 떨고와 3 mL PBS-T와 함께 5 분에 대 한 3 회 35 m m 문화 접시에 부동성 섹션을 세척 (약 36 회 / 분).</li>
		<li>Antigen 검색 솔루션 준비: 초순 2.7 mL에 항 원 검색 솔루션 집중 (자료 테이블)의 0.3 mL. 부동성 섹션을 포함 하는 35 m m 문화 접시에 항 원 검색 솔루션의 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>뚜껑을 닫고, 접시와 뚜껑 비닐 테이프의 스트립 사이의 간격을 밀봉 하 고 동요 하지 않고 3 h에 대 한 교 잡 인큐베이터에서 50 ° C에서 품 어.</li>
		<li>인큐베이터를 20 분에 대 한 RT에서 멋진 요리를 제거 합니다. 비닐 테이프를 제거 후 씻어 3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션.</li>
		<li>PBS-T 발음을 섹션에 차단 솔루션 (자료 테이블)의 5 방울을 추가 합니다. 온화한 동요와 함께 5 분 RT에서 품 어.</li>
		<li>1 차적인 항 체 솔루션 준비: 인 Y1798 (pY1798) girdin 항 체 (자료 테이블)의 5 µ L와 PBS에서 5 %BSA 495 µ L. 1 차적인 항 체 (차단 솔루션이 필요 하지 않습니다 제거) 섹션에 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>부 화 습도 챔버에 접시를 놓고 가벼운 떨고와 4 ° C에서 밤새 품 어. 참고: 하룻밤 외피는 최대 3 박에 확장할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이차 항 체의 응용<ol>
<li>워시 3 번 5 분 동안 각 3 ml에서 PBS-T 가벼운 진동의 섹션.</li>
		<li>희석된 DAPI 재고 솔루션을 준비: DAPI 재고 솔루션 (단계 1.5), PBS의 998 µ L의 2 µ L.</li>
		<li>이차 항 체 솔루션: PBS, 희석된 DAPI 솔루션, phalloidin-형광 염료 어원이 재고 솔루션의 12.5 µ L, 염소-토끼 IgG-형광 염료 켤레의 1 µ L의 10.5 µ L에에서 5 %BSA 476 µ L (파장: 여기 496 nm, 방출 520 nm).</li>
		<li>PBS-T 발음, 후 이차 항 체 솔루션을 적용 하 고 온화한 떨고와 30 분 RT에서 빛 차폐 인큐베이션 챔버에 품 어.</li>
		<li>3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션을 씻어.</li>
		<li>최종 세척 후 PBS-T를 제거 하 고 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르 부족 PBS의 3 mL을 바꿉니다. 입체 음향 현미경에 접시를 전송.</li>
		<li>장소 200 µ L의 PBS P200 피펫으로 팁을 사용 하 여 작은 물방울에 접시에서 매스 코팅 흰색 유리 슬라이드와 이전 한 공장 섹션의 중앙에 작은 물방울에서.</li>
		<li>입체 현미경 섹션 맞춤 조정 후 섹션을 둘러싼 모든 나머지 PBS 발음.</li>
		<li>수성 설치 미디어의 20 µ L을 추가 하 고 미디어 꼭대기 20 x 20 m m coverslip 장소.</li>
		<li>즉시 크 실 렌 기반 설치 미디어와 함께 coverslip 가장자리 물개. 나무 mappe에 슬라이드를 놓고 2-3 h에 대 한 RT를 공고히 자일 렌 기반 설치 미디어를 허용 합니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 자일 렌 기반 설치 미디어 굳은 후 슬라이드 실시간에 빛 차폐 슬라이드 상자에 2-3 주 동안 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>공초점 현미경의 63 X 목표에 집중 기름을 넣어. Coverslip 슬라이드를 거절 하 고 무대에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>레이저 파장 405, 488, 555 nm, 인수 TC 이미지를 디지털화 하 고 tiff 형식 (.tiff) 이미지를 저장 합니다. 참고: 형광 염료에 대 한 적절 한 검색 필터 세트를 선택 (즉, 여기/방출 맥시 마: 358/461 nm, 490/525, 및 590/617).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut.">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li><li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren.">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li><li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt/PKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin/APE.">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li><li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage.">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-mediated+angiogenesis+by+the+Akt/PKB+substrate+Girdin.">Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin.</a> Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+an+intrinsic+regulator+of+neuroblast+chain+migration+in+the+rostral+migratory+stream+of+the+postnatal+brain.">Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain.</a> J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).</li><li>Nahorski, M. 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저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 술 셀 (TCs)의 신뢰할 수 있는 이미지를 얻기 위해 조직학 경험 없이 연구를 허용 하도록 설계 되었습니다. 이 프로토콜은 3 개의 중요 한 포인트: 1) 사이트 및 인 산화 상태 특정 토끼 polyclonal 항 체의 티로신 1798 (pY1798 항 체)에 phosphorylated 인간 girdin에 대 한 특정 회사 (에서 가져온 된 사용 Immuno-Biological 실험실 회사 X =); 2) 젤라틴 작성 공장; 그리고 3) 저온 항 원 복구. 넓은 의미에서 인 산화 상태 특정 항 체의 포스트 번역 상 수정 (예: acetylation 이나 메 틸 화, 인 산화)의 특정 유형을 인식 수정-특정 항 체로 분류 될 수 있다는 특정 한 아미노산 잔류물에 단백질입니다. 오모리 외. 회사 X는 공동 phosphorylated 펩 티 드와 토끼를 면역 하 고 다음 이동의 방법9, unphosphorylated 펩타이드와 고체 상 크로마토그래피를 사용 하 여 결과 항 체를 순화 하 여 pY1798 항 체를 생성 10. pY1798 항 체/티로신 17989점 돌연변이 없이 전체 길이 인간의 girdin 식 벡터를 사용 하 여 인 산화 분석 생체 외에서 집중적으로 검증 했다. 그 후, Kuga 연구진이 발견 회사 X에서에서 pY1798 항 체 장 TCs1의 구체적이 고 민감한 마커. 따라서, 회사 X에서에서 pY1798 항 체의 포함이이 프로토콜에서 중요 한 포인트 이다.
젤라틴 동물의 조직에서 추출한 콜라겐을 포함 하 고 오래 조직화 학적인 연구 cryosections13를 사용 하 여 조직 표본을 포함 하는 데 사용 되었습니다. 4 ° C에서 gelatinized 하지만 상 온에서 녹는 다, 낮은 녹는 포인트 젤라틴14를 포함 하는 동안 액체 상태에 젤라틴을 유지 하는 데 필요한 열의 부작용을 피하기 위해 적용 하기 시작 했다. 이 프로토콜에서 낮은 녹는 포인트 젤라틴 4 ° C에서 gelatinizes RT에서 녹는 젤라틴 파우더에서 만든 마우스 공장의 가로 cryosections의 형태를 유지 하기 위해 사용 되었다. 이 젤라틴을 완전히 공장을 채우기 위해 사용 되었다 때 샘플 다음 포 르 말린-고정 했다 돌이킬 수 없는 젤라틴을 달성 하기 위해. 열 유도 항 원 복구 알데하이드를 포함 하는 fixatives12의 복 면 된 항 원 노출 하는 효과적인 방법입니다. 그러나, 고온 (30 분 동안 95-99 ° C) 일반적으로 파라핀 섹션의 분석에 사용 되는 복잡 한 조직/젤라틴의 형태를 손상 수 있습니다. 여기 우리는 항 원 검색 및 조직의 형태학의 보존을 허용 하는 낮은 온도 항 원 복구 (50 ° C 3 h)를 사용 합니다.
pY1798 항 체는 마우스 공장 뿐만 아니라 생쥐와 인간1에서 여러 기관 (위, 회장, 콜론, 및 쓸 개)에서 TCs 레이블을 수 있습니다. 그러나, 어떤 조직에서 떼어낸된 조직에서 pY1798 신호 저하 빠르게 됩니다 때문에이 프로토콜 포함 공장 루멘에 말린 주입 (단계 2.1.15., 그림 1A2).
부동성 cryosections의 두께와 관련 된 제한이 있습니다. 얇은 cryosections 현미경 검사 법에 대 한 반투명 측면에서 유리한 될 수, 있지만 두께 게이 섹션 육체적으로 취약. 대조적으로, 두꺼운 cryosections 육체적으로 튼튼한, 하지만 낮은 항 체 침투성 섹션으로. 이 프로토콜에서 30 µ m 두께 섹션 사용 되었다 육체적 안정 및 항 체에 융 화 했다. 프로토콜 실패 해야 하는 경우이 방법은 조직학, 광범위 한 경험 없이 연구자에 대 한 설계 되었습니다, 비록 구가 외 에서 사용 하는 유사한 섹션 pY1798/villin/DAPI 트리플 파라핀의 얼룩 1수행된 될 수 있습니다. 파라핀 섹션 했다 phalloidin F-말라 파라핀 섹션에서의 얼룩과 관련 된 어려움을 피하기 위해 여기 사용 되지 않습니다.
티로신-1798 girdin에 인접 한 아미노산 시퀀스의 보존 때문에 pY1798 항 체 마우스, 쥐, 인간을 포함 한 다른 종에서 TCs를 얼룩에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 젤라틴 작성 또한 다른 빈 기관에 대 한 적용할 수 있습니다. 실제로, pY1798, TC, 저온 항 원 복구와 함께 작성 하는 젤라틴의 조합 그리고 악명에 마우스, "어려운" epitopes를 공개 하는 데 유용 수 있습니다 결과적으로, 많은 연구자에 대 한 관심이 있을 수 있습니다.
Girdin의 생물학 역할 및 TCs에 그것의 인 산화의 의미는 명확 하지 않습니다. 그러나, 린 외에 의해 연구 제안 그 티로신 인 산화 girdin의 F-말라 합8의 학위와 관련. 한편, Kuga 연구진이 발견 그 치명적인 apoptosis inducers의 복용량 (예., cisplatin, x 선 방사선) 연결 될 수 있습니다 그들은 가상 마우스 소장에서 TCs의 상대 주파수에서 큰 증가 발생는 가능 enterocytes에서에 변환 TCs, microvilli1girdin의 인 산화와 동기화. 이 가능성은 미래에 추가 조사가 필요 합니다. 최근 급속 한 관찰 3 그룹 기생충 감염15,,1617다음 TC 주파수에서 증가. 따라서,이 부동성 얼룩 뿐만 아니라 인간의 용기 라고 수집 조직, 분석에 사용 될 수 있지만 TC 축적 수 또한 인간의 창 자에서 기생충 감염의 진단에 도움이 됩니다.

술 셀 (TCs)는 꼭대기 tufts 및 스풀 모양 somas1특징은 위장 epithelia의 사소한 흩어져 요소입니다. TCs 처음 19562에 설명 했다, 비록 TC 기능은 부분적으로 신뢰할 수 있는 TC 마커의 부족 불분명 남아 있습니다.
에노모토 외. 먼저 girdin3, 혈관, 심장 판 막, 힘 줄, 그리고 골격 근육4같은 비 신경 조직에서 뿐만 아니라 신 경계 표현 말라 바인딩 단백질 특징. Girdin의 유전 제거와 쥐 성장 지체와 여러 뇌 변칙4,,56을 표시합니다. 한편, 손실의 기능 돌연변이 인간 girdin에 진보적인 뇌 질환, 심한 지체, 및 이른 개시 간 질 발작7와 연결 됩니다.
2011 년에 린 외. 티로신 tyrosine kinases EGFR 및 Src8등으로 중재 하는 1798에서 girdin의 동적 인 산화 발견. 그들은 또한 phosphorylated girdin 셀 마이그레이션8트리거를 개장 하는 걸 필요는 보여주었다. 오모리 연구진이 개발 사이트-그리고 인 산화 상태 특정 항 체에 대 한 인간의 girdin 티로신 1798 (pY1798 항 체) 고토의 프로토콜 다음에 phosphorylated 사이트 감독 mutagenesis의를 사용 하 여 항 체 확인 식 운반 전체 길이 girdin9,10벡터 스 2017 년, 구가 외. 그 pY1798는 높은 특이성 및 높은 감도1TCs 라벨을 보고 했다. PY1798 항 체는 우수한 착 색 속성을 밝혀 아직 특성 lumenal 끝에 ' 술'을 포함 하 여 전체 셀 모양 girdin의 생물학적 역할 기반 이전 TC 표식에 우수한 고 tc에서 인 girdin를 표시 했다 함수에는 불분명 한1남아 있었다.
이 연구에서 설명 하는 방법을 포함 한다 얼룩, 조직학 기술 표시 대상 단백질에 대 한 1 차적인 항 체와 형광 활용 된 이차 항 체에 대 한 기본 사용 하 여 조직에서 특정 단백질에 면역 형광 검사를 항 체입니다. 이 방법의 목적은 높은 품질 TC 이미지를 얻기 위해 조직학 경험 연구 수 있도록입니다. 이 프로토콜은 부동성 cryosections cryosections 슬라이드 마운트에 대 한 필요 또는 파라핀 섹션을 사용 합니다. 그러나, 무료-부동 섹션은 깨지기 쉬운 유리 슬라이드에서 지원의 부재로 인해 고 섹션 두께 항 체 침투성을 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜 포함 되어 이러한 문제를 극복 하는 두 가지 방법: 1) 얼룩 절차에 걸쳐 무료-부동 섹션의 형태를 보존 하는 젤라틴과 전체 공장 루멘 작성 및 저온 항 원 검색을 사용 하 여 2) pY1798 신호를 강화.

<table><tbody><tr><td>Slc:DDY 6-week-old female mice</td><td>Chubu Kagaku Shizai</td><td>Not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O</td><td>Wako</td><td>199-02825</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Wako</td><td>199-10665</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100,&amp;nbsp; Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether</td><td>Katayama Chemical</td><td>Not applicable</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>190-00013</td><td></td></tr><tr><td>10% buffered neutral formalin solution</td><td>Muto Chemical</td><td>20215</td><td>Step 1.3.</td></tr><tr><td>Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21915-35</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>N.N-dimethylformamide (DMF)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13015-75</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647-10G</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge stainless steel straight needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun</td><td>Kono Seisakusho</td><td>Not applicable</td><td></td></tr><tr><td>22-gauge winged needle</td><td>Terumo</td><td>SV-22DLK</td><td></td></tr><tr><td>20 mL TERUMO syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-20ES</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Iwaki centrifuge tubes</td><td>Iwaki</td><td>2325-015</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL micro test tube</td><td>Star</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin powder, Gelare-blanc</td><td>Nitta Biolab</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece</td><td>Sakura FineTech</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)</td><td>Shoei Work&#039;s</td><td>1101-3</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26404-75</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td>Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.</td></tr><tr><td>Protein Block</td><td>Dako</td><td>X0909</td><td>Blocking solution in 4.2.5.</td></tr><tr><td>Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies</td><td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td><td>28143</td><td>Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1</td><td>Matsunami Glass</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy</td><td>Merck Millipore</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>MAS-coated slide glass white</td><td>Matsunami Glass</td><td>MI-MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Mappe KO-type</td><td>Shoei Work&#039;s</td><td>99-40007</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)</td><td>Gilson</td><td>F144801, F123600, F123601, F123602</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water production system</td><td>Advantec</td><td>GS-590</td><td></td></tr><tr><td>Plastic glove, Star Nitrile Glove</td><td>Star</td><td>RSU-NGVM</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Deep freezer, SANYO Ultra Low</td><td>Sanyo</td><td>MDF-382</td><td></td></tr><tr><td>Showcase refrigerator</td><td>Nihon Freezer</td><td>NC-ME50EC</td><td></td></tr><tr><td>Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C)</td><td>Taitec</td><td>0068750-000</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C)</td><td>Taitec</td><td>HB-100</td><td></td></tr><tr><td>Incubation chamber for immunostaining</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature)</td><td>Taitec</td><td>NR-1</td><td></td></tr><tr><td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C)</td><td>Tokyo Rika Kikai</td><td>MMS-3010</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope (for tissue handling)</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope (for Figure 1B)</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope (for Figure 3)</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser-scanning microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

use of anti-phospho-girdin antibodies to visualize intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections

말라 바인딩 단백질 girdin 걸 다양 한 조직에 셀 이동 하는 리 모델링에 필요한 cytosolic 단백질 이다. Girdin 수용 체와 티로신 1798에서 비 수용 체 티로신 kinases phosphorylated입니다. 오모리 연구진이 개발 사이트 및 인 산화 상태 특정 항 체 티로신-1798 (pY1798)에서 인간 girdin에 대하여 특히 묶는 phosphorylated 티로신-1798, 하지만 하지 unphosphorylated 티로신-1798. pY1798 항 체 특히 술 셀 (TCs) 포유류 위장 조직에 존재 하는 레이블을 사용 되었습니다 하지만 이러한 세포의 기능을 명확 하지 않다. 이 프로토콜에는 pY1798 항 체와 면역 형광을 사용 하 여 공장에서 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다. 성공적이 고 간단한 TC 시각화를 위해이 프로토콜 포함 2 개의 조직학 기술: 젤라틴 가득 공장 조직, 그리고 3 헤와 공장 작성 50 ° C에서 저온 항 원 복구에서 자유 롭 뜨 cryosections의 생산 저온 항 원 복구 TCs이이 프로토콜의 성공적인 사용 pY1798 모 끝에서 배포 하는 TCs의 얼룩에 결과에서 강력한 신호를 보장 하는 반면 젤라틴 얼룩 절차에 걸쳐 무료-부동 섹션의 모양 유지 토 굴입니다. 얼룩진된 TCs 스풀 모양 소마와 형광 신호 튀어나온 '술.'에 해당 하는 lumenal 끝에 응축 Phalloidin 얼룩 두꺼워 솔 국경에 pY1798-긍정적인 TCs와 colocalized 고 TC 술에서 연장 rootlet 질량에 해당 합니다. 위장 내 시경으로 수집 하는 인간의 생 샘플에서 TCs 검사이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 또한, TCs 최근 알려졌다 쥐, 기생충 감염에 따라 축적이 프로토콜 인간의 창 자에서 기생충 감염의 진단에 대 한 응용 프로그램을 할 수 제안.

젤라틴-공장의 작성
젤라틴-충전 (그림 1B)의 혜택은 젤라틴으로 마우스 공장을 작성을 위한 일반적인 절차 (그림 1A), 표시 됩니다. 간단히, 18 게이지 바로 바늘의 경사진된 팁 피어 싱 창 자 벽 (그림 1A1) 로부터 보호 하기 위해 제거 되었습니다. 젤라틴 채우기 사용 하 여 달성 했다 10% 액체 젤라틴 ( 작성 전에 중립 말린 솔루션 잘린된 공장 섹션 소장 하 고 창 자 루멘 표면 (그림 1A2)를 해결 하기 위해의 한쪽 끝에서 주입을 버퍼링 그림 1A3). 결과 소시지 모양의 조각 (그림 1A4) 내장, 냉동, 되었고 transversely는 cryostat에서 30 µ m 두께 조각으로 구분. 작성 하는 젤라틴의 부재, 꼬임, 뒤로 스윙 villi 허용 (그림 1B왼쪽) jejunal 섹션에 의하여 경향이 있다. 젤라틴 작성 섹션의 둥근 디스크 모양을 유지 하 고 (그림 1B오른쪽) villi의 수직 위치를 유지. 이미지는 명확 하 게 작성 부동성 공장 섹션의 형태를 보존 하는 젤라틴에서 제공 하는 혜택을 나타냅니다.
장 술 셀의 성공적인 영상
pY1798 항 체 점 럽, 부 럽, 파라핀 섹션 얼룩, 얼룩, 해 동 실장 cryosection 또는 부동성 cryosection1,9얼룩을 포함 하 여 변수 immunostaining 기술을 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 형광 pY1798 항 체, phalloidin, TCs1의 구조적 특성을 설명 하기 위해 얼룩 DAPI를 사용 하 여 마우스 공장에서 TCs의 얼룩에 대 한 자유 롭 뜨 cryosections에 집중 했다. 일반적으로, TCs는 약 한 TC/100 상피 세포 모 팁에서 토 굴1의 속도로 흩어져 있습니다. 대표 결과 그 pY1798 reproducibly 막, 스풀 모양 소마와 강하게 스테인드 lumenal 팁, 강력한 신호 응축 튀어나온 TC1의 ' 술'에 해당 하는 곳의 세포질을 포함 하 여 전체 TCs를 구분 (그림 2A-2B). 한편, phalloidin phallotoxin, 버섯 버섯 phalloides에서 유독한 bicyclic heptapeptides의 가족 이며 장 브러시 테두리를 이루는 microvilli에 filamentous 말라 (F-말라)에 대 한 높은 선호도가지고 11. Phalloidin reproducibly와 눈에 띄게 표시 rootlets 술1에서 확장의 질량에 해당 하는 굵은 브러시 테두리. 따라서, pY1798 신호 (스풀 모양 소마, lumenal 끝 신호 응축) 눈에 띄게 두꺼워 phalloidin 양성 브러시 테두리의 일관 된 공동 지역화 방법을 보여 줍니다이 프로토콜 성공적으로 관계 없이 TCs 식별 여부 그들은 토 굴그림 2B) (또는 모그림 2A) (에.
낮은-온도 항 원 복구 부동성 섹션 얼룩에 효과적입니다.
95-99 ° C에서 열 기반 항 원 복구 파라핀 섹션 및 슬라이드 마운트 cryosections의 분석을 위해 널리 이용 된다. 그러나 이러한 섹션은 일반적으로 슬라이드12에서 지원 되는 슬라이드 마운트 섹션 보다 더 깨지기 때문에, 손상을 초래 하지 않고 부동성 섹션에 적용이 접근 어려운입니다. 저온 항 원 복구 (50 ° C 3 h)부터 물 목욕을 사용 하 여 미치지 않았다 형태 우리 장 님에서 항 원 복구의 객관적인 효과 평가 하는 예비 실험에서 부동성 공장 섹션의 테스트를 통계적으로 낮은 온도 항 원 복구 (그림 3)의 효과를 확인 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg"> 그림 1: cryosections의 형태 보존을 위한 공장 부분의 젤라틴 작성 젤라틴으로 마우스 공장 intraluminal 작성 절차의 (A) 사진. (A1) 18 게이지 바로 바늘의 경사진된 팁을 용기 벽을 관통 하는 피하기 위해 제거 되었습니다. (A2) 버퍼링 된 중성 포 르 말린 용액 (10%)는 잘린된 공장 장의 내용을 플러시하고 창 자 루멘 표면 수정에 한 쪽 끝에 주입 했다. (A3) 잘린된 공장 액체 젤라틴 및 출혈 6-0 나일론 봉합 (검은 화살표)를사용 하 여 양쪽으로 가득 합니다. (A4) 4 더 많은 봉합 사 매듭 (흰색 화살표) 기존 봉합 매듭 (검은 화살표) 사이 3 개의 짧은 조각 나왔고. 조직은 다음 두 개의 지정 된 위치 (흰색 화살표)에서 3 개의 소시지 모양의 조각으로 구분 됩니다. (B) 부동성 cryosection 형태학에 젤라틴 채우기의 유익한 효과 젤라틴 작성 없이 섹션 경향이 꼬임, 쉽게 뒤로 (왼쪽); 스윙 villi 허용 젤라틴 작성, 30 µ m 두께 섹션 디스크 모양 유지와 villi의 수직 위치는 보존 (오른쪽). 이미지는 Nomarski 미분 간섭 명암을 사용 하 여 촬영 했다. 스케일 바, 1 m m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg"> 그림 2: 대표적인 형광 이미지 마우스 장 술 셀의 TCs 모 (A) 또는 토 굴에서의 공초점 형광 이미지 (B), 부동성 마우스 공장 섹션에서 사이트별로 얼룩진 고 인 산화 상태 특정 항 체에 대 한 girdin에 티로신 phosphorylated 1798 ( pY1798, 녹색, 최적의 여기/방출 파장 490/525 nm), phalloidin (빨강, 590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 파랑, 358/461 nm). 낮은 확대 이미지 (스케일 바, 50 µ m)에서 흰색 상자로 둘러싸인 영역 오른쪽 (스케일 바, 10 µ m)에 확장 됩니다. pY1798 항 체 reproducibly 위치 ( (A), 모에 또는 (B)토 굴에서), lumenal 팁 (화살표), 막, 및 스풀 모양 TC 소마의 세포질에 얼룩과 TCs, 얼룩. Phalloidin 얼룩 (화살촉)에서 눈에 띄게 굵은 브러시 테두리는 TCs의 또 다른 독특한 기호 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg"> 그림 3: 낮은 온도 항 원 복구 pY1798 면역 형광을 향상 시킵니다. 실험 절차의 두 그룹-저온 항 검색의 효율성을 확인 비교 되었다. 부동성 공장 섹션 (30 µ m 두께, n = 13)에서 단일 고정된 블록 두 그룹으로 분할 되었다 및 각 그룹에서 섹션 전체 프로토콜 다음 얼룩진 했다 또는 같은 프로토콜 부족 저온 항 원 복구 (4.2.2 단계). 얼룩, 후 섹션 그룹 숫자, 표시 하는 개별 슬라이드에 장착 했다 고 마스킹 테이프로 덮여 있었다 각 슬라이드에 라벨. 모든 슬라이드 단행, 테이프에 새로운 숫자 표시 되었고 FITC 필터를 통해 형광 현미경에서 관찰. 표시 pY1798 양성 TCs의 총 수는 각 그룹에 평균 했다 하 고 막대 그래프 (평균 ± 표준 편차)에 표시 했다. 두 꼬리 t-검정은 두 그룹 사이의 평균 수를 비교 위해 수행 되었습니다. P-값이 0.05 이하로 통계적으로 간주 됐다. 저온 항 원 복구는 크게 pY1798-면역 형광의 효율성을 개선. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

구가 외 인 산화 상태는 말라 바인딩 단백질 girdin 티로신 1798 (pY1798)에 phosphorylated에 대 한 특정 항 체 술 셀 (TCs)을 사용할 수 있습니다 발견. 이 프로토콜의 부동성 공장 cryosections pY1798 항 체와 immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다.

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K 조회수.  Aichi Human Service Center. 구가 외 인 산화 상태는 말라 바인딩 단백질 girdin 티로신 1798 (pY1798)에 phosphorylated에 대 한 특정 항 체 술 셀 (TCs)을 사용할 수 있습니다 발견. 이 프로토콜의 부동성 공장 cryosections pY1798 항 체와 immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다.

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

연구

발생학

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

마우스의 Cajal (ICC) 네트워크의 중간 세포의 시각화

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

생물학

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...

장 조직의 고품질 면역염색을 위한 효율적인 Swiss Roll Method

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ileum. Each anatomical region of the intestine has a unique function that is reflected by differences in cellular structure. Investigating changes in the intestine requires an in-depth analysis of different tissue regions and cellular alterations. To study the intestine and visualize large pieces of tissue, researchers commonly use a technique known as intestinal Swiss rolls. In this technique, the intestine is divided into each anatomical region and fixed in a flat orientation. Then, the tissue is carefully rolled and processed for paraffin embedding. Proper tissue fixation and orientation is an often-overlooked laboratory technique but is critically important for downstream analysis. Additionally, improper Swiss rolling of intestinal tissue can damage the fragile intestinal epithelium, leading to poor tissue quality for immunostaining. Ensuring well-fixed and properly oriented tissue with intact cellular structures is a crucial step that ensures optimal visualization of intestinal cells. We present a cost-effective and simple method for making Swiss rolls to include all sections of the intestine in a single paraffin-embedded block. We also describe optimized immunofluorescence staining of intestinal tissue to study various aspects of the intestinal epithelium. The following protocol provides researchers with a comprehensive guide to obtaining high-quality immunofluorescence images through intestinal tissue fixation, Swiss-roll technique, and immunostaining. Employing these refined approaches preserves the intricate morphology of the intestinal epithelium and fosters a deeper understanding of intestinal physiology and pathobiology.

저자 스포트라이트: 장 세포 생물학 연구를 위한 효과적인 면역형광 염색 프로토콜

The intestine is vital for digestion and absorption. Each region-duodenum, jejunum, ileum, colon-serves distinct functions due to unique cellular structures. Studying intestinal physiology demands meticulous tissue analysis. This protocol outlines tissue fixation and processing using the Swiss roll technique, ensuring accurate immunostaining through proper tissue preservation and orientation.

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

요약

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Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

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마우스의 Cajal (ICC) 네트워크의 중간 세포의 시각화

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Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

Imaging the Gut with "CLARITY"

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜

Intestinal Swiss Rolls 및 파라핀 포매 조직의 면역형광 염색에 최적화된 프로토콜