이 작품 Instituto de에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (Estatal 계획 데 나 + D + 내가 2013-2016 년): CP15-00012, PI16-00860 및 CIBER (CB06/02/0053), 공동 자금 유럽 지역 개발 기금 ' 유럽을 달성 하는 방법 ' 부여 (ERDF). 재는 마드리드 (2016-T1/바이오-1105)와 I의 지역의 정부의 Atracción 드 talento 프로그램에 의해 지원 + 스페인 정부의 드 Economía, 산업 y Competitividad (BIO2017-85056-P)의 D Excelencia. ASM Instituto de에서 미겔 세르 친교에 의해 지원 됩니다 건배 카를로스 3 세 (MS15/00012) 공동는 유럽 사회 기금에 의해 자금을 "당신의 미래에 투자" (ESF) 그리고 ERDF.

1. 항생제 저항 유전자를 인코딩 실험 시스템의 건설
참고: 여기 대장균 MG1655 플라스 미드 또는 염색체 인코딩 항생제 저항 유전자의 받는 사람 부담으로 사용 되었다. 항생제 저항 유전자는 염색체 또는 그렇지 않으면 isogenic 스트레인 (그림 1)에서 다중 플라스 미드에 인코딩됩니다.
<ol><li>
Λ 페이지 통합 사이트 (attB)20 MG1655의 염색체의 항생제 저항 유전자를 삽입
	<ol>
<li>증폭 PCR에 의해 염색체 attB 사이트의 양쪽에서 500 bp 긴 지역. Oligonucleotides YbhC-F를 사용 하 여 (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3')와 attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3')는 왼쪽된 상 동 지역 및 attB-F에 대 한 (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') 및 YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') 적당 한. 뇌관 Tem1-pBAD-F를 사용 하 여 구편-1 저항 유전자 증폭 (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3')와 Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). 약 20 뇌관 디자인 bp (5' 끝) 시퀀스 complementarity 조각에 융합 하는 것을 보여주는.</li>
		<li>퓨즈 (를 포함 하 여 그것의 발기인 지구) 항생제 저항 유전자 PCR 제품을 상 동 지역에서 30 분 동안 50 ° C 등온선 어셈블리21를 사용 하 여.</li>
		<li>Electroporate MG1655 세포 포함 플라스 미드 pKOBEG. 참고: pKOBEG는 λ를 포함 하는 열에 민감한 벡터 이다 빨간 기계, 염색체와 PCR 제품22사이의 homology 기반 유전자 교류를 추진.<ol>
<li>1.1.2 단계23 에서 제품의 1 µ L를 사용 하 여 4 ° C에서 2 mm 큐 벳에 electrocompetent 셀의 40 µ L 및 2.5 kV. Resuspend LB 국물 + 0.2 %arabinose λ의 식을 유지 하기의 1 mL에 빨간 기계 세포.</li>
			<li>Microfuge 관에 총 볼륨을 전송 하 고 염색체에 삽입 하 여 저항 마커의 phenotypic 표정 수 있도록 강렬한 떨고 (200 rpm 궤도 셰이 커에)와 30 ° C (pKOBEG에 대 한 허용 온도)에서 2 h를 품 어.</li>
			<li>LB agar 항생제 저항 유전자 (암 피 실린 또는 carbenicillin 즐편-1대 100 mg/l)에 대 한 선택 하려면 적절 한 항생제를 포함 하는 셀 접시</li>
		</ol>
</li>
		<li>100 µ L 한 페 트리 접시에 접시와 볼륨의 나머지 부분을 아래로 회전, 신선한 파운드 국물의 100 µ L에서 resuspend 다른 배양 접시에 접시. 42 ° c.에서 밤새 품 어 참고:이 온도 pKOBEG의 복제에 대 한 관대 한 비. 이러한 조건에서 성장할 수 식민지 pKOBEG 잃게됩니다와 attB 사이트에 통합 하는 저항 유전자를 발표할 예정 이다 (편의상이 긴장 이라고 불릴 것 이다 MG1655:가 리사 에 여기에서).</li>
		<li>페니와 함께 접시의 식민지를 복제 하 여 pKOBEG의 손실에 대 한 테스트 (어떤 pKOBEG에 대 한 항생제 저항 마커 포함). 참고: 30 º C의 허용 온도에서 페니 격판덮개에 성장의 부족은 플라스 미드의 부재의 지표.</li>
		<li>클론을 확인, PCR 증폭 외부 뇌관 YbhC Extern을 사용 하 여 건설 (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') 및 YbhB Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), 젤 전기 이동 법을 통해 amplicon 시퀀스의 정확한 크기를 확인 합니다 삽입 된 유전자의 순서가 정확한 확인을 정화 제품.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다중 플라스 미드에 항생제 저항 유전자를 삽입 합니다. 참고: 때문에 매우 높은 복사 번호와 플라스 미드 세균성 호스트 피트 니스에 큰 감소를 부과 하는 경향이, 좋습니다 복제, p3655 등의 자연의 기원과 다중 플라스 미드의 사용 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1 형 원산지 복제24)입니다. 이 플라스 미드는 일반적으로 약의 적당 한 복사 번호를 제시 셀 당 15-20 복사본.<ol>
<li>PCR (발기인 지역 포함) 선택의 항생제 저항 유전자를 증폭 하 고 PCR 제품 phosphorylate 플라스 미드 PCR 증폭 중추에 선:<ol>
<li>PCR 증폭 항생제 저항 유전자; 즐편-1 사용 뇌관 Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3')와 Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').</li>
			<li>정제 제품 제조업체의 지침에 따라 T4 polynucleotide 키를 사용 하 여 phosphorylate</li>
			<li>PCR 증폭 높은 중 합 효소와 oligonucleotides pBAD-F를 사용 하 여 플라스 미드 백본 (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3')와 pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').</li>
			<li>T4-리가 사용 하 여 두 PCR 파편을 위하여 제조 업체의 지침에 따라.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Electroporate, 앞에서 설명한, 결 찰 제품 및 항생제 저항 유전자 (암 피 실린 또는 100 mg/L에서 carbenicillin에 대 한 적절 한 항생제 선택의 1 µ L의 최대 electrocompetent 대장균 DH5-α 세포의 40 µ L 즐편-1)에 대 한 및 플라스 미드 백본. 참고: arabinose 여기로 LB 보충 필요는 없습니다.</li>
		<li>독자의 선택의 상업적인 소형 예비 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 추출:<ol>
<li>실 온에서 12000 x g에서 centrifuging 여 하룻밤 문화의 5 mL을 수확. Resuspend 물의 resuspension 솔루션의 250 µ L에서 세포와 섞어 잘. 세포의 용 해 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 중화의 350 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.</li>
			<li>DNA 바인딩 열 키트, 1 분 동안 원심 분리기에서 제공 하는 상쾌한을 전송 하 고 삭제를 통해 흐름. 세척 솔루션, 1 분간 centrifuging와 각 세척에서 flowthrough 삭제의 500 µ L 열 두 번 씻는 다. 잔여 세척 버퍼를 제거 하려면 1 추가 분에 대 한 빈 열 원심</li>
			<li>깨끗 한 튜브는 열을 놓고 elute 순화 된 DNA를 막에 매우 순수한 물 50 µ L를 추가 합니다. 1-2 분 원심 하 고 흐름을 통해 순화 된 플라스 미드를 포함 하는 수집. 생어 시퀀스 삽입된 시퀀스 외부에서 뇌관을 사용 하 여 순서 올바른지 확인 없는 돌연변이 진화 실험 전에 저항 유전자에 존재 하는 플라스 미드의 유전자.</li>
		</ol>
</li>
		<li>일단 순서 확인 electroporate 대장균 MG1655 피로, 위에서 설명한 대로 플라스 미드. 참고:이 변형 생성 MG1655/바지.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 실험적 진화 항생제 저항 (그림 1) 진화 구조 접근
<ol><li>파운드 플레이트에 연구 긴장 밖으로 행진: MG1655::가 리사 와 MG1655/바지 플러스 취약 부모의 스트레인, MG1655. 참고: 플라스 미드 바지 이어야 한다 MG1655, 안정 그래서 파운드 접시에 항생제를 추가할 필요가 없습니다. 변이 대장균 에 요금은 충분히 낮은 그래서 그것이 각 단계에서 플라스 미드 시퀀스를 확인 하는 데 필요한 건축 확인 합니다.</li>
	<li>각 잘에서 파운드의 200 µ L 96 잘 접시를 준비 하 고 (한 접시 스트레인 당) 독립적인 스에서 각 스트레인의 48 고립 된 식민지를 예방. 37 ° C와 200 rpm에서 하룻밤 접시를 품 어. 이러한 설립자 인구의 냉동된 재고 유지. 참고: 방지 하 고 96 잘 접시에서 문화 교차 오염에 대 한 제어, intercalating 96 잘 접시에 걸쳐 박테리아 없는 매체와 접종된 웰 스에 의해 바둑판 플레이트 설계를 사용 합니다. 이 플레이트 설계를 사용 하 여 전체 실험 진화 중.</li>
	<li>접종 2 µ L 새로운 96 잘 접시에 창시자 인구와 플레이트의 각 우물에서 연구에서 항생제의 하위 전공으로 각 잘에서 파운드의 198 µ L로 하 여 진화 구조 실험을 시작 합니다. 진화 구조 접근에 대 한 3 개의 긴장의 각각에 대 한 파운드에서 항생제의 ¼ 또는 최소 억제 농도 (MIC, 결정 이전25)의 1/8 시작 하 고 매일 항생제의 농도 두 번. 인구의 저항 돌연변이26취득 기회를 최대화 하기 위해이 방법을 사용 합니다. 37 ° C와 20 h 200 rpm에서 번호판을 품 어. 참고: 창시자 인구의 하룻밤 OD를 측정 합니다. 긴장 가운데 OD에 큰 차이가 있다면 잘 당 세포의 동일한 번호와 함께 실험을 시작 하는 초기 inoculum을 수정 합니다.</li>
	<li>매일, 야간 문화 후 각 모집단의 OD를 측정 하 고 2.3, 더블 전날 보다 항생제의 농도 가진 새로운 96 잘 접시에에서 설명 된 대로, 문화의 전송을 수행. 플레이트 20 h 37 ° c와 200 rpm을 품 어. 참고: 1: 100 희석 요인이 하루 약 6-7 세대 생산.</li>
	<li>동시에, 2.3 및 2.4, 하지만 항생제의 부재에 설명 된 대로 동일한 조건에서 각 변형의 컨트롤 인구를 전파 합니다. 참고: 제어 인구 항생제와 박테리아 실험 조건에 적응을 돕는 일반적인 돌연변이의 존재 때문에 발생 하는 돌연변이 사이 차별 도움이 됩니다. 병렬 돌연변이 항생제의 부재에서 발생 하는 박테리아 실험 조건에 적응 하도록 돕는 것 항생제 내성에 관련이 없습니다.</li>
	<li>600의 파장에서 흡 광도 측정 하 여 살아남은 인구 수 매일 추적 플레이트 리더를 사용 하 여 문화권의 nm (OD). 참고: 광학 밀도 값 0.1 나타냅니다 인구의 멸종 보다 낮은. 그림 2 생존 곡선의 예를 참조 하십시오.</li>
	<li>(3-5 일 마다) 모든 인구를 주기적으로 냉동된 재고 유지.</li>
	<li>[RStudio (버전 0.99.486)에 "생존" 패키지] 로그-순위 테스트를 사용 하 여 항생제12의 농도 증가 따라 시간이 지남에 다른 긴장의 인구의 생존에 통계적 차이 확인 하. 참고:이 실험 경우 다중 plasmids 약효는 특정 항생제 및 유전자 연구에 대 한 항생제 내성의 진화를 결정 합니다.</li>
</ol>3. 분자 기초 항 생 저항 (그림 1)의 진화의
<ol><li>인구와 클론의 대표 번호에서 전체 DNA 추출 긴장 및 치료 수행. 부모 긴장을 포함 (MG1655, MG1655::가 리사 와 MG1655/바지) 실험 기간 동안 축적 하는 돌연변이 검출 하기 수 있기를. 참고: DNA 추출 키트의 예에 대 한 자료의 표를 참조. 각 키트에는 다른 프로토콜; 제조업체 지침을 따릅니다.</li>
	<li>계량 DNA 품질 및 농도. DNA 품질 및 농도 확인 하기 위해 다른 방법이 있다. 260 nm/280 nm의 흡 광도 260 nm/230 nm의 비율을 측정 하는 품질을 결정 합니다. 형광, DNA 바인딩 염료를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 DNA 농도 측정 하 고 거기 확인을 agarose 젤 전기 이동 법이 DNA 저하 또는 RNA 오염.</li>
	<li>전체 인구 및 개별 샘플에서 사용 하 여 깊은 DNA 시퀀싱 항생제 내성의 유전 기초 조사를 복제 합니다. 참고: 우리는 인간 유전학, 옥스포드, 영국에 대 한 모든 시퀀싱 Wellcome 신뢰 센터에서 실시. 자세한 내용은 참조 산 밀란 외. 201612.</li>
	<li>Breseq 0.26.1 파이프라인27,28 를 사용 하 여 다형성 모드를 사용 하 여 인구에 있는 돌연변이의 주파수를 견적 하는 돌연변이 검출. 실험 기간 동안 축적 된 돌연변이 검출 하기 위하여 부모의 게놈을 다른 진화 게놈 비교 합니다.</li>
	<li>비교 그 인구 제어 인구에 있는 동시에 축적 된 돌연변이 돌연변이 박테리아 일반적인 실험 조건 (적응을 돕는 사이 분화 하는 항생제의 농도 증가에서 진화 그 제어 인구에서 발견) 그 항 생 저항 (항생제 압력을 복종 하는 인구에 독점적으로 그)에 관련 된. 참고: 병렬 돌연변이의 수 이므로 일반적으로 낮은 치료 사이 다른 병렬 변이 쉽게 평가 될 수 있다. 그것은 꽤 찾을 가능성이 연구 항생제 저항 유전자에 돌연변이 제외 하 고 다른 돌연변이 염색체에 항 생 저항, porins 또는 경과 시스템12같은 돌연변이와 관련 된.</li>
	<li>이 프로토콜의 섹션 1에서 동일한 방법을 사용 하 여 부모의 긴장에서 항생제 저항 유전자에 돌연변이 재구성 합니다. 1.1와 1.2 (를 사용 하 여 진화 유전자 PCR 템플릿으로) 부모의 배경에서 새로운 돌연변이 소개 하는 프로토콜의 포인트에 따라. 항생제 저항 phenotypes 돌연변이의 역할을 확인 하는 이러한 새로운 건축의 분석.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACKLING+DRUG-RESISTANT+INFECTIONS+GLOBALLY:+FINAL+REPORT+AND+RECOMMENDATIONS.">TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS.</a> Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).</li><li>Palmer, A. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+predicting+and+manipulating+the+genotypic+evolution+of+antibiotic+resistance.">Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).</li><li>MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+structural+variation+in+haploid+microbial+genomes+from+short-read+resequencing+data+using+breseq.">Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq.</a> BMC Genomics. 15, 1039 (2014).</li><li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+evolution+of+TEM-1+&#946;-lactamase:+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance.">Natural evolution of TEM-1 &#946;-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li><li>Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+modifying+enzymes.">Aminoglycoside modifying enzymes.</a> Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).</li><li>Jerison, E. R., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+investigations+of+evolutionary+dynamics+and+epistasis+in+microbial+evolution+experiments.">Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 35, 33-39 (2015).</li><li>Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Basis+of+Evolutionary+Innovation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

우리는 분자 생물학, 실험 진화 및 다중 플라스 미드 박테리아에 항생제 내성의 진화에서의 역할을 조사 하도록 깊은 DNA 시퀀싱을 결합 하 여 새로운 프로토콜을 제시. 이 프로토콜은 다양 한 분야에서 기술을, 비록 그것을 개발 하는 데 필요한 모든 방법을 간단 하 고 일반 미생물학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 아마 모델 시스템 긴장의 건설과 실험 진화 후 ?...

항생제 저항 박테리아에는 주요 건강 문제1입니다. 근본적인 수준에서 병원 성 박테리아에 항생제 내성의 확산은 자연 선택2,3진화의 간단한 예입니다. 간단히 말하면, 항생제를 사용 하 여 생성 내성 변종에 대 한 선택 합니다. 진화 생물학에 있는 중요 한 문제는 따라서, 항생제에 저항을 진화 세균성 인구 수에 영향을 주는 요소를 이해 하는 것입니다. 선택 실험 박테리아의 진화 생물학을 조사 하는 매우 강력한 도구로 등장 하 고이 필드 진화 문제4,,56의 넓은 범위에 대 한 놀라운 통찰력을 생산 하고있다. 실험 진화에서 단일 부모의 부담에서 시작 하는 세균성 인구는 정의 하 고 긴밀 하 게 제어 된 조건 하에서 passaged 직렬. 이러한 문화의 성장 하는 동안 발생 하는 돌연변이의 일부 세균 피트 니스, 증가 하 고 이러한 문화를 통해 자연 선택에 의해 확산. 실험 기간 동안 인구의 샘플 비 진화 냉동된 화석 레코드를 만들기 위해 주기적으로 저온 유지 됩니다. 박테리아 인구 진화 하 접근의 다양 한 숫자를 사용할 수 있지만 두 가지 가장 일반적인 방법 적합성 분석 실험, 그들의 먼 조상과 전체 게놈 시퀀싱, 즉 경쟁 진화 박테리아의 능력을 측정 하는 그 드라이브 적응 유전자 변화를 식별 하는 데 사용. 선구적인 작업 리처드 Lenski와 동료7,8, 다음 실험 진화에 표준 접근 복제 인구 수가 상대적으로 적은 도전 하고있다 (일반적으로 < 10)에 새로운 적응을 환경 문제, 새로운 탄소 소스, 온도, 또는 육 식 살 균 소 등입니다.
항생제 내성 박테리아에의 한 감염 저항 높은 만큼 환자 조직에 치명적인 수준 항생제 농도 증가 하는 것은 큰 문제가 된다. 임상 세균이 임계값 항생제 농도, 임상 중단점 이상 항생제의 과다 복용에 저항을 진화 하는 것을 허용 하는 무슨에 따라서 관심이. 이 실험적으로 연구 하는 방법? 세균성 인구 수가 적은 항생제의 높은 복용량으로 도전, Lenski 스타일에서 실험, 그리고 가장 가능성이 결과 경우 항생제 멸종을 모든 인구를 몰 것 이다. 같은 시간에 사용 되는 항생제의 복용량은 부모의 긴장의 최소 억제 농도 (MIC) 아래 낮은 경우 다음 가능성이 크다 세균성 인구 저항, 임상 관련 레벨을 진화 할 것 이다 특히 저항 큰 비용을 수행합니다. 이러한 두 가지 시나리오 사이의 한 타협 "진화 구조" 실험9,,1011을 사용 하는 것입니다. 이 방법에서는, 문화는 매우 큰 수 (일반적으로 > 40) 증가 시간이 지남에, 일반적으로 항생제 농도 두 배로 모든 주12항생제의 복용과 함께 도전 이다. 이 실험의 특징은 어떤 인구 증가 저항을 진화 하지 않는 멸종 구동 될 것입니다. 이 방법으로 도전 대부분 인구, 구동 하지만 작은 진화 하는 저항의 높은 수준으로 유지 됩니다. 이 문서에서 우리는이 실험 설계를 사용 하 여 저항의 진화에 다중 플라스 미드 기여를 조사 하는 방법을 보여줍니다.
박테리아는 두 가지 주요 노선, 염색체 돌연변이, 그리고 모바일 유전 요소, 주로 플라스 미드13의 인수를 통해 항생제에 저항을 취득. 플라스 미드 활용14,15박테리아 사이의 저항 유전자를 옮길 수 있기 때문에 항생제 내성의 진화에 중요 한 역할을 재생 합니다. 플라스 미드의 크기와 생물학에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있습니다: "작은", 세균성 세포 및 "큰" 높은 사본 수, 낮은 복사 번호16,17. 항생제 내성의 진화에 큰 플라스 미드의 역할 그들은 저항 및 멀티 저항 박테리아15중 보급의 핵심 드라이버는 conjugative 플라스 미드를 포함 하기 때문에 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 작은 다중 플라스 미드 박테리아17,18, 매우 일반적인 있으며 그들은 종종 항생제 저항 유전자19에 대 한 코드. 그러나, 항생제 내성의 진화에서 작은 다중 플라스 미드의 역할에 공부 되었습니다 했다.
최근 작품에서 우리는 다중 플라스 미드가 그들은 유전자 돌연변이 속도 셀12당 더 높은 유전자 복사본 수를 증가 하 여 수행 하는 유전자의 진화를 가속 수 제안. 그것은 다중 플라스 미드 3 세대에 대 한 저항을 부여 하는 가장-1 돌연변이의 외관의 속도 가속 표시 했다 E. 콜라이 긴장 MG1655 및 β-lactamase 유전자 즐편-1 실험 모델을 사용 하 여 cephalosporin ceftazidime입니다. 이러한 결과 표시 다중 플라스 미드 항생제 내성의 진화에 중요 한 역할을 재생 있습니다.
여기, 우리는 우리가 개발 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제시 다중 플라스 미드 중재 항생제 내성의 진화를 조사. 이 메서드는 세 가지 다른 단계: 연구는 다중 플라스 미드 또는 호스트 박테리아의 염색체에 유전자의 첫 번째, 삽입. 둘째, 선택적인 압력에 적응 하는 다른 긴장의 잠재력을 평가 하기 위해 실험 진화 (진화 구조)의 사용. 그리고 세 번째, 분자 기초 플라스 미드 중재 진화 DNA 시퀀싱 및 부모의 유전자 형에서 개별적으로 의심된 돌연변이 재구성을 사용 하 여 기본을 결정.
마지막으로, 여기에 설명 된 프로토콜 항생제 내성의 진화를 조사 하도록 설계 되었습니다, 비록 한 주장할 수 있다이 방법은 어떤 multicopy에 돌연변이 의해 취득 하는 혁신의 진화를 분석 하 일반적으로 도움이 될 수 있습니다. 플라스 미드로 인코딩된 유전자입니다.

<table><tbody><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BiorRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td>UF1060</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (shaker)</td><td>Cole-Parmer Ltd</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power supply</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Electrophoresis chamber</td><td>BioRad</td><td>1704405</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Biohit</td><td>725020, 725050, 725060, 725070</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pippetes</td><td>Biohit</td><td>728220, 728230,&lt;br/&gt; 728240</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader Synergy HTX</td><td>BioTek</td><td>BTS1LF</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8388</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>BD Difco</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Resctriction enzymes</td><td>Fermentas FastDigest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Plasmid extraction kit</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>gDNA extraction kit</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kits</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>gDNA extraction kit</td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9054</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>ClearLine</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates (-80&amp;ordm;C storage)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249945</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Quantification of DNA concentartion</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>BioRad</td><td>1610743</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0031</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0014</td><td></td></tr></tbody></table>

testing the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance

다중 플라스 미드는 원핵생물에서 매우 풍부 하지만 세균 진화에서 그들의 역할 제대로 이해 남아 있습니다. 우리는 최근에 증가 유전자 복사 셀 다중 플라스 미드를 제공한 당 플라스 미드로 인코딩된 유전자의 진화를 가속 수는 것을 보여주었다. 이 작품에서는, 우리는 유전자 진화를 촉진 하는 다중 플라스 미드의 능력을 테스트 하는 실험 시스템을 제시. 간단한 분자 생물학 방법을 사용 하 여, 우리는 항생제 저항 유전자 대장균 MG1655, 염색체 또는 다중 플라스 미드에 삽입할 수 있는 모델 시스템을 건설 한다. 우리 항생제의 농도 증가 따라 다른 변종을 전파 실험 진화 접근을 사용 하 고 우리는 시간이 지남에 세균성 인구의 생존을 측정. 선택 항생제 분자 그리고 저항 유전자는 유전자 돌연변이의 인수를 통해 저항을 부여만 수 있습니다. "진화 구조" 이렇게 항생제 내성의 획득 홍보 다중 플라스 미드의 잠재력을 테스트 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 실험 시스템의 다음 단계에서는 항생제 내성의 분자 기초는 특징 이다. 돌연변이 식별 하기 위해 항생제 내성의 수집에 대 한 책임 우리가 사용 하 여 전체 인구와 클론에서 얻은 샘플의 깊은 DNA 연속. 마지막으로, 연구에서 유전자에 돌연변이의 역할을 확인, 우리 부모의 배경에서 그들을 재구성 하 고 테스트 결과 긴장의 저항 표현 형.

우리의 이전 작품에서 진화 β-lactamase 유전자 즐편-1 제 3 세대 cephalosporin ceftazidime12 에 저항을 부여 쪽으로 조사 되었다. 이 유전자는 돌연변이 즐편-1 편-1은 ceftazidime29등 cephalosporins의 활동의 범위를 확장할 수 있습니다 편-1 ceftazidime에 저항을 부여 하지 않습니다, 하지만 때문에 선정 되었다. Β-lactamases 등 ?...

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Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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11.5K 조회수.  Universidad Complutense de Madrid. 여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

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Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

연구

환경과학

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

세균성 활용 주파수의 고해상도 비교

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

유전학

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

면역학 및 감염병학

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

항생제 내성 플랫폼을 이용한 항생제 복제

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Multidrug Efflux 시스템 특성화를 위한 Single-copy 유전자 발현

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

저자 스포트라이트: Advancing Antibiotic Resistance Research Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System (유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 항생제 내성 연구 발전)

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Bacterial Transformation

<h4>Background</h4>

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine against pneumonia, Frederick Griffith set out to study two different strains of the Streptococcus pneumoniae: a non-virulent strain with a rough appearance (R-strain) and a virulent strain with a smooth appearance (S-strain) due to an outer polysaccharide capsule2. This outer layer of the S-strain bacteria enabled them to withstand the host immune system, eventually leading to a life-threatening illness. When Griffith separately injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice lived. However, when he injected mice with a combination of the heat-killed S-strain with live R-strain, the mice died2. When he analyzed the samples obtained from dead mice injected with the combination, he observed live S-strain bacteria to be present. In 1928, Griffith noted that a &#8220;transformation&#8221; process must have occurred to change the nonvirulent bacteria into the virulent strain. As the first known discovery of bacterial transformation, his discovery paved the way for the development of an essential tool in genetic engineering - transformation3.

Transformation is the genetic change in a cell due to the intake of DNA from the environment. In Griffith&#8217;s experiment, the DNA that encodes the protective polysaccharide coating of the S-strain bacteria did not break down from the heat shock and was introduced into the R-strain, allowing the latter to bypass the immune system of the mouse. While this process constantly occurs in the wild between organisms and even different species, scientists transform bacteria in laboratory settings for research purposes4.

<h4>Bacterial Transformation using Plasmids</h4>

Bacteria are the ideal organisms for transformation as they can easily take in exogenous genetic material into their genome and quickly amplify it3,5. They have one circular chromosome and multiple small circular pieces of double-stranded DNA called plasmids within the cytoplasm. These plasmids can replicate independently from the chromosomal DNA and generally provide certain functional benefits, such as resistance to antibiotics6,7. In their natural environment, bacteria undergo &#8220;bacterial transformation&#8221; by taking in plasmids from other bacteria in a process called conjugation8. Moreover, when they multiply, each of their progeny receives a copy of the new plasmid.

Plasmids that are used for experimental purposes are called plasmid vectors. In a laboratory setting, scientists can artificially create &#8220;recombinant plasmids&#8221; that are approximately 5,000-10,000 base pairs in length by inserting DNA fragments into a plasmid vector. These recombinant plasmids usually have certain components: an origin of replication (ORI), an antibiotic resistance gene, a multiple cloning site, a promoter, a selection marker, and the gene of interest. The origin of replication is where replication begins. The antibiotic resistance gene allows the bacteria that take in the plasmid to survive on plates in the presence of a certain antibiotic drug. Although plasmids are relatively small pieces of DNA, scientists need to treat the host cells to enable the plasmid penetration through the cell membrane. Hence, the efficiency of the transformation is directly related to porosity of the host membrane. One common approach is to heat-shock the bacteria that have been treated with a calcium chloride solution9. The bacteria that do not incorporate the plasmid will not transform, and therefore have no resistance to survive on the plate and be visible. The multiple cloning sites aid in DNA insertion by containing sites for restriction enzymes to cut the plasmid where the gene of interest can be inserted and ligated. The promoter drives transcription of the gene of interest. It is tagged by a marker, usually a fluorescent protein such as a green fluorescent protein (GFP), or can be an additional antibiotic resistance gene. The antibiotic resistance gene and the other selection markers help us determine whether the collected bacteria contain the plasmid of interest.

<h4>Applications</h4>

Effective transformation methods enabled scientists to isolate and profile genes and gene products and led to many advancements in life sciences and medicine, such as development of effective drugs, generation of genetically-modified crops, and advanced diagnostic tools10. In addition, with technological advancements, new methods of transformation have emerged. For instance, Gateway Cloning allows insertion of multiple DNA fragments into different vectors as well as transfer of DNA sequences between plasmids11. Furthermore, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 is a gene-editing technique that directly modifies nucleotides in the genome and does not require the use of plasmids12. After transformation, researchers often isolate and profile the gene of interest and its products. Subsequently, the whole process of genetic cloning has opened up a new field of genetic manipulation. Thanks to genetic cloning, researchers can manipulate bacteria to produce large amounts of specific human proteins, such as insulin to treat diabetes patients10. Cloning also has served a major importance in modern day agriculture. Genetically modified organisms (GMO) are a direct result of genetic cloning and bacterial transformation10. For instance, scientists are working to generate genetically modified crops with nitrogen-fixing genes incorporated into their genome to boost food production and reduce fertilizer use, thus, diminishing the economic and environmental impact of fertilizers13. In sum, bacterial transformation is the first step of modern-day biotechnology and the foundation of future research discoveries.

<h4>References</h4>

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Bacterial Transformation using Plasmids - Concept

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