이 작품에서 국립 암 센터, 한국 (1510121) 및 국가 연구 재단, 한국 (아니 K. 수소를 연구 보조금에 의해 지원 되었다. NRF-2015R1A2A2A04007432).

연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 국립 암 센터, 한국 (NCCNCS-12-630)에 의해 승인 되었다.
1. 샘플 준비 (30 분)
<ol><li>HeLa 세포 (CCL 2, ATCC)의 문화에 대 한 100 m m 문화 접시에 10 mL 전체 DMEM 매체 (10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 펜-strep)를 사용 합니다. 혈 청에 굶주린 HeLa 세포를 준비 하려면 품 어 소 태아 혈 청 하지 않고 DMEM에 confluent HeLa 세포 48 시간에 대 한 이전 연구11에 설명 된 대로.</li>
	<li>세포를 분리 하려면 2 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 그들을 씻어 하 고 100 m m 문화 접시 당 0.25 %EDTA 트립 신 2 mL를 추가 합니다. 그런 다음 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 2-3 분 동안 품 어</li>
	<li>트립 신, 비활성화 문화 접시에 완전 한 DMEM 매체의 5 mL을 추가 하 고 15 mL 튜브를 분리 된 세포를 전송. 그런 다음에 펠 릿을 형성 하기 위하여 10 분에 대 한 300 x g에서 셀 원심.</li>
	<li>상쾌한, 제거 하 고 10 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 두 번 2 mL 차가운 PBS 가진 펠 릿을 세척.</li>
	<li>상쾌한의 제거 후, 셀 펠 릿을 95% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 vortexing에 의해 셀 펠 릿 에탄올과 혼합 합니다. 셀 블록 준비까지 얼음에 고정된 셀을 계속.</li>
</ol>2. 셀 블록 준비 (1 시간 30 분)
<ol><li>냉동된 플라즈마의 준비에 대 한 aliquots, 건강 한 기증자 혈액에서 EDTA 플라즈마를 수집 하 고 표면에 뜨는 플라즈마를 수집 하는 13000 x g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 약 200-400 수 µ L 각에 microfuge 관. 사용까지-80 ° C에서 aliquots를 저장 합니다. 냉동된 플라즈마 aliquots 준비가 되 면, 그들을 검색 하 고 5 분 동안 37 ° C에 외피에 의해 플라즈마를 녹여.</li>
	<li>10 분 동안 700 x g에 고정 된 세포를 원심 다음 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>플라즈마, thromboplastin, 2 방울 및 0.025 M 염화 칼슘 2 방울 2 방울 (약 200 µ L) 셀 펠 릿 믹스. 그런 다음 pipetting으로 그들을 믹스.</li>
	<li>그림 2A와 같이 10 분 동안 실내 온도에 셀 응고를 형성 하기 위하여 혼합물을 허용 한다. 그런 다음 세척 PBS와 셀 응고 두 번 붓는 피 펫으로 PBS를 제거 하 여. 대표적인 화이트 셀 응고는 그림 2B에 표시 됩니다.</li>
	<li>포 르 말린와 필터 종이 축 축 하 게을 미리 moistened 필터 종이 셀 응고를 포장. 그런 다음 그림 2C와 같이 조직 카세트에는 pincette와 응고 혼합물을 놓습니다.</li>
	<li>포 르 말린 고정을 위한 4 ° C에서 하룻밤 버퍼링 된 포 르 말린 (10% 포 르 말린 PBS에) 50 mL를 포함 하는 유리 항아리에 조직 카세트 장소.</li>
</ol>3. 조직 처리 및 파라핀 포함 (하룻밤)
<ol><li>포함 하는 포 르 말린 고정 셀 응고 조직 카세트 로드 조직 프로세서에서 앞에서 설명한11하룻밤. 조직 처리 물 제거 및 파라핀 포함 이전에 고정 된 세포의 조절입니다. 조직 처리 없이 연구를 위한 조직 표 1에 표시 된 것 처럼 절차를 처리를 수행 합니다.</li>
	<li>(그림 2D) 온수 포함 역, 및 60 분 후, 검사는 녹은 파라핀 금속 금형에 거기에 설정.</li>
	<li>조직 카세트에서 형성된 된 셀 응고 하 고 금속 금형 내에서 녹은 파라핀에.</li>
	<li>장소는 셀을 포함 하는 금속 금형에 뚜껑 없이 새로운 조직 카세트 녹은 파라핀 중간 응고와 조직 카세트에 그리고 금속 금형에 더 많은 녹은 파라핀을 부 어. 그런 다음 30-60 초에 대 한 차가운 접시에 공고히 파라핀 하자.</li>
	<li>금속 금형에서 조직 카세트를 분리 합니다. 그런 다음 파라핀 셀 블록은 immunocytochemistry에 대 한 준비. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 포함 된 셀 응고 그림 2E에서 화살표로 표시 됩니다.</li>
</ol>4. Immunocytochemistry (1 시간)에 대 한 슬라이드의 준비
<ol><li>파라핀 셀 블록에 셀 응고에 대 한 영역을 확인 하 고는 톰을 사용 하 여 3-4 µ m의 두께와 조각으로 셀 블록을 잘라. 그림 2 층에서 보는 바와 같이 실 란 코팅 된 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 넣어.</li>
	<li>슬라이드에 고착 하는 섹션을 30 분 동안 37 ° C 오븐에 섹션 슬라이드를 놓습니다.</li>
</ol>5. 셀 블록 (6 h) Immunocytochemistry
참고: immunocytochemical 셀 블록 섹션에 얼룩, 다양 한 키트 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 이러한 키트는 다양 한 감도 특이성 그들의 수정에 따라 있다.
<ol><li>크 실 렌 드 paraffinize 4 분의 50 mL에 섹션을 품 어.</li>
	<li>100% 에탄올 탈수에 대 일 분에 두 번 95% 에탄올, 및 2 분 80% 에탄올에 슬라이드를 품 어. 그런 다음, 실행 10 분 동안 물에 에탄올을 제거 합니다.</li>
	<li>항 원 복구에 대 한 병 포함 40 mL 트리 스-EDTA 검색 버퍼, pH 9.0, 슬라이드를 놓고 30 분 동안 솥에 삶아.</li>
	<li>실행 물, 아래 슬라이드를 세척 하 고 95% 에탄올 4 ° c.에서 10 분 동안에 그들을 품 어 다음, 슬라이드에 세포 얼룩 지역 Pap 펜 쉽게 식별을 표시 합니다.</li>
	<li>Tris 버퍼 식 염 수 0.2%를 포함 하는 슬라이드 워시 트윈 20 (TBS-T), 그리고 과산화 수소 블록에서 품 어 ( 재료의 표참조) 모든 나머지 과산화 효소 활동을 제거 하려면 15 분 동안 실내 온도에. 그런 다음 2 분에 대 한 세 번 TBS T에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 단백질 블록에서을 diluting 하 여 희석된 항 체 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조). 예를 들어 기본 항 체 수 CKAP2 희석 배율을 사용, 그리고 기-67 항 체 1: 500. 다음, 1 시간에 대 한 항 체 희석된 솔루션의 100 µ L에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 어둠 속에서 실 온에서 15 분 동안 키트에 기본 항 체 증강에 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>4 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척 후 HRP 폴리머 (이차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소와 함께 표시)의 2 방울을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 추가 diaminobenzidine (DAB) 솔루션의 100 µ L ( 재료의 표참조), 그리고 3 분에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>씻은 후 TBS T에 두 번, 되며 솔루션 (100 µ L 되며의와 600 µ L의 증류수의 혼합물), 100 µ L을 추가 하 고 1 분에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>TBS-T에서 슬라이드를 한 번 세척 후 2 분에 대 한 95% 에탄올에 잠복기, 95% 에탄올에 담그고 한 번, 그리고 두 번 100% 에탄올에 담그고 탈수. 그런 다음 5 분 동안 유리 항아리 자일 렌 40 mL에에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>슬라이드는 크 실 렌에서 건조, 각 coverslips를 탑재 합니다.</li>
	<li>가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 얼룩 패턴을 관찰 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+immunofluorescence+of+cultured+cells.">High-quality immunofluorescence of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).</li><li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+-+Avoiding+the+pit+falls.">Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls.</a> J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li><li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Techniques.">Immunofluorescence Techniques.</a> J Invest Dermatol. 133, e4 (2013).</li><li>Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+the+thromboplastin-plasma+cell-block+technique+for+fine-needle+aspiration+and+serous+effusions.">The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions.</a> Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).</li><li>Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+the+cell+block+method+versus+the+conventional+smear+study+in+pleural+fluid+cytology.">Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology.</a> J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).</li><li>Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+block+cytology:+Improved+preparation+and+its+efficacy+in+diagnostic+cytology.">Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology.</a> Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).</li><li>Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value,+feasibility,+and+validity+of+preparing+cell+blocks+from+fluid-based+gynecologic+cytology+specimens.">Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens.</a> Cancer. 96, 204-209 (2002).</li><li>Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+electron+microscopy+on+paraffin-embedded+cytologic+material.">Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material.</a> Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).</li><li>Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mouse+cytoskeleton-associated+protein,+CKAP2,+with+microtubule-stabilizing+properties.">Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties.</a> Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).</li><li>Hong, K. U., Choi, Y. -. B., Lee, J. -. H., Kim, H. -. J., Kwon, H. -. R., Seong, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+phosphorylation+of+tumor+associated+microtubule+associated+protein+(TMAP)/cytoskeleton+associated+protein+2+(CKAP2)+at+Thr-596+during+early+phases+of+mitosis.">Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis.</a> Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).</li><li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -. L., Poojan, S., Hong, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CKAP2+(cytoskeleton-associated+protein2)+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer.">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107 (2017).</li><li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients:+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry.">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li><li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis.">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li><li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining:+The+fluorescent+antibody+method.">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li></ol>

모든 저자는 관심 없음 충돌 선언 하 고 있다.

Immunofluorescent 고정된 경작된 한 세포에 얼룩 현재 형태학 정보1을 유지 하면서 단백질 표정 수준 셀에서의 결정에 대 한 선택의 방법입니다. 그러나, immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 우수한 대안을 수 있습니다. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록와 immunocytochemistry의 준비에 대 한 자세한 절차는이 프로토콜에서 설명 되었습니다 그리고 우리 immunocytochemistry 셀 연구에의 응용을 촉진할 수 있다 바랍니다.
Immunocytochemistry immunofluorescent 얼룩 위에 몇 가지 장점이 있습니다. 하지만 갓 배양된 세포, 필요 immunofluorescent 일반적으로 셀에 대 한 얼룩 파라핀 셀 블록 몇 년13실 온에서 보관 하실 수 있습니다. 또한, immunocytochemistry 셀 블록에 일상적인 immunohistochemistry 인간의 조직4에 사용 된 동일한 항 체를 채용 하 여 세포내 식 패턴을 탐색할 수 있습니다. 또한, 그것은 단백질 수준 또는 posttranslational 수정 미리 다양 한 약물 또는 다양 한 문화 조건11세포 배양 하 여 변화를 탐색할 수 있습니다.
Immunocytochemical 얼룩의 장점, 달리 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록의 준비 시간이 걸립니다 그리고 비용이 많이 드는14. 또한, 대부분 연구소가이 기법에서 경험이 부족 하 고 이러한 상황에서 기술적 오류는 일반적. 가장 일반적인 오류는 세포 형태학의 가난한 보존과 가난한 또는 불규칙 한 immunocytochemical 파라핀 셀 블록 섹션에 얼룩. 이들과 대부분의 다른 최고의 셀 조건 셀 블록을 만들고 충분 한 솔루션을 사용 하 여 셀 혈전을 형성 하 여 피할 수 있습니다.
현재 프로토콜의 데모, 셀 블록 HeLa 세포에 대 한 준비 하 고 두 확산 마커, CKAP2 및 이전에 보고 된11기-67에 대 한 수행 했다 immunocytochemical 얼룩. Immunocytochemistry, 세포가 외피와 소 태아 혈 청 하지 않고 미디어에 의해 조작 및 혈 청 기아의 효과 관찰 될 수 있었다. 많은 슬라이드만 슬라이드 당 4-5 µ m 두께 셀 블록 섹션을 사용 하 여 셀 블록에서 준비 될 수 있다 때문에 항 체의 많은 수에 대 한 이러한 준비 파라핀 포함 된 셀 블록을 사용할 수 있습니다. 따라서, 두 개의 서로 다른 조건에 해당 하는 식이 패턴은 여러 다른 항 체와 평가할 수 있습니다. immunostaining CKAP2에 대 한 패턴 및 조직 이미 되어 암에 기-67 보고9,10,,1112, 그리고 얼룩 결과 immunocytochemical 계산 될 수 쉽게, 때문에 얼룩 패턴 immunohistochemistry에서 그들과 아주 유사 했다.
끝으로, immunocytochemical 파라핀 셀 블록에 얼룩 immunofluorescent 얼룩;에 훌륭한 대안이 될 수 있습니다. 또한, 그것은 사용할 수 있습니다 쉽고 안정적으로 식 형태학 정보를 유지 하면서 셀 라인에서 프로 파일링에 대 한 기초 연구에.

대부분 실험실에서 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 하지 일반적으로 사용 됩니다. 오히려, 배양된 세포를 고정, 파라핀 포함 되지 셀 subcellular 지 방화 연구에서 채택 된다. 그 배양된 세포를 고정, 형광 chromogen 대신 사용 되었습니다. 따라서, immunofluorescent 얼룩 현재 셀 문화1을 채용 하는 연구에서 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법입니다. 그러나 슬라이드, immunofluorescent 얼룩이 지기에 대 한 준비는, 비행기 현미경2아래 표시 된 아주 다른 이미지를 표시할 수 있습니다 immunofluorescent 현미경 검사 법에만 관찰할 수 있습니다. 또한, immunofluorescent 얼룩에 대 한 슬라이드의 보존 밝은 빛 으로부터 보호를 요구 하 고 형광 신호 약한 이미징 형광 신호3의 손실로 인해 반복 노출 되. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 결과 매우 비슷합니다 immunohistochemistry 파라핀 끼워 넣어진 조직4에서 그리고 그들은 쉽게 임상 정보로 번역 될 수 있다. 따라서, immunocytochemistry는 우수한 대안을 수 있습니다. 그러나, 셀 블록 준비 되지 않았습니다 인기 기초 연구 실험실에서. 이 프로토콜에서 다음, 셀 블록 준비 및 immunocytochemical 얼룩 제공 됩니다 셀-문화 연구의 분야에서이 방법의 사용을 촉진.
셀 블록 준비 및 immunocytochemistry는 독특한 방법, 하지 그리고 그들은 이미 기본 연구4,5임상 진단에서 적용 된. 다양 한 셀 블록 준비 방법 되었습니다 보고4,, 비용 효율적인, 간단 하 고 쉽게 적응할 수 있는6 thromboplastin 플라즈마 방법이입니다. 따라서,이 문서, thromboplastin 플라즈마 방법4,,56,7,에 소개 된 프로토콜8 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록의 준비에 사용 됩니다.
현재 연구에서 두 확산 마커를 사용 하는 immunocytochemistry 메서드 및 thromboplastin 플라즈마 셀 블록의 준비에 대 한 자세한 절차 시연 했다. 한 표시는 골격 관련 단백질 2 (CKAP2), 최근에는 mitotic 마커9,,1011;으로 보고 되었습니다. 다른 하나는 가장 유명한 확산 마커12기-67. 대표적인 구조는 그림 1에 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>HeLa Cells</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&amp;nbsp;CCL-2)</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9106-S1</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher SCientific</td><td>1330-20-7,100-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethenol</td><td>GD Chem</td><td>DJ16016</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Agilent</td><td>10118581</td><td></td></tr><tr><td>DAB Quanto Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-125-QHDX, QHCX 170405</td><td></td></tr><tr><td>Ultravision LP detection Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PBQ141209, LPB141209, LPH141210</td><td>Kit for immunocytochemistry; contains protein block</td></tr><tr><td>TintoRetriever Pressure Cooker</td><td>Bio SB Corporation</td><td>BSB 7008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>IBS-BT008</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corporation</td><td>115106</td><td></td></tr><tr><td>Thromboplastin</td><td>Neoplastin Cl Plus</td><td>NC0591432</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA retrival Buffer</td><td>Dignostic Biosystem</td><td>E625-A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&amp;nbsp;bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ultra vision peroxide block H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02Q141212</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>363313</td><td></td></tr><tr><td>Pap-Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-0155</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>PAA Laboratories</td><td>H21-002</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Daejung</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>tissue processing cassette</td><td>Simport</td><td>M492-5</td><td></td></tr><tr><td>100 mm culture dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>140712</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Marienfeld</td><td>2262817</td><td></td></tr><tr><td>Glass Zar</td><td>Hyunil Lab-Mate</td><td>HIP-1027</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Class II Laminar Flow Hood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1300 series A2</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Processor</td><td>Leica BioSystem</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>CX-21</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin embedding station</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC 350-1, EC 350-2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Section Bath (Round)</td><td>CellPath</td><td>HCP-JAW-0100-00AEU</td><td></td></tr><tr><td>Fume Hood</td><td>Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.</td><td>FH-150</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of protein expression level in cultured cells by immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks

Immunofluorescent 얼룩 때 현재 단백질 표정 수준 결정에 대 한 선택의 방법 세포 배양 시스템에 형태학 정보도 필요 하다. Immunocytochemical 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록, 여기 제시에 얼룩의 프로토콜 파라핀 포함 된 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩에 우수한 대안 이다. 이 프로토콜에서 HeLa 세포에서 파라핀 셀 블록 thromboplastin 플라즈마 메서드를 사용 하 여 준비 하 고 immunocytochemistry 두 확산 마커, CKAP2 및 기-67의 평가 위해 수행 되었다. 핵 및 HeLa 세포의 세포질 형태학 셀 블록 슬라이드에서 잘 보존 했다. 같은 시간에는 immunocytochemistry에서 CKAP2와 기-67 얼룩 패턴 immunohistochemical 파라핀 암 조직에 얼룩에 아주 유사 했다. 혈 청 무료 조건 HeLa 세포의 사전 부 화를 포함 하 여 수정된 세포-배양 조건, 효과 아키텍처 정보를 유지 하면서 평가 수 있습니다. 결론적으로, 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry immunofluorescent 얼룩에 우수한 대안 이다.

파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 (그림 3AB)에서 되며 후 오신 스테인드 슬라이드, 세포의 세포질과 핵의 대부분은 그대로, 형태 보존은 현재 프로토콜 (우수 제안 그림 3A)입니다. Immunocytochemical 얼룩에 긍정적인 CKAP2 얼룩이 관찰 되었다 압축된 chromatin, mitotic 스핀 들 및 세포질 (그림 4)에서 이전에 보고 된10. 기-67 얼룩 예상된 (그림 4)로 세포 핵에서 관찰 되었다. 만 셀 CKAP2 압축된 chromatin에서 얼룩 mitotic 세포 했다 ( 그림 4AB화살표 참조). 많은 CKAP2 양성 세포는 완전 한 매체 (그림 4A)에서 부 화 후 준비 된 했다 높은 mitotic HeLa 세포에 표시 했다. 비교에서는, 혈 청에 굶주린 HeLa 세포 (그림 4B)에서 몇 CKAP2-긍정적인 세포 있었습니다. 높은 mitotic는 HeLa 세포의 대부분이 기-67 긍정적인 (그림 4C). 반면, 혈 청에 굶주린 HeLa 세포에서 기 67 양성 율 50% (그림 4D)로 높은 유지. 이러한 결과 매우 그는 이전 보고서11, CKAP2은 보다 안정적인 확산 마커 암 세포에서 보다 기-67의 비교.
제대로 준비 된 셀 블록, 핵, 세포질에서 분리 하 고이 또한, 릴리스할, 불 쌍 한 형태 론 적. 냉장고에 고정된 셀의 하룻밤 보다 더 이상 보육 같은 가난한 결과 발생할 수 있습니다. 또 다른 중요 한 문제는 셀은 우수한 형태에도 불구 하 고 immunocytochemistry에 의해 잘 스테인드 하지. 이 문제는 셀 응고 작을 때 더 자주 발생 합니다. 일반적으로, 착 색 강도 그림 3B;에서 같이 일반 하지만 셀 응고 크면, 불규칙 한 얼룩의 더 적은 기회. 따라서,이 프로토콜에 우리는 큰 셀 응고를 형성 하기 위하여 플라즈마, thromboplastin, 및 염화 칼슘의 볼륨 증가.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg"> 그림 1: 셀 블록 준비 계획. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg"> 그림 2: 파라핀 셀 블록 준비의 그림. (A) thromboplastin 플라즈마 튜브에서 셀 병. (B) TP 셀 응고 PBS 세척 후. (C) 셀 moistened 필터 종이에 응고. (D) 조직을 포함 한 녹은 왁 스로 역. 금속 몰드 (화살표)에 녹은 왁 스 응고에 대 한 보유 하고있다. (E) 파라핀 포함 셀 응고 (화살표) 파라핀 또는 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 포함 된. (F) 얇은 파라핀 코팅된 슬라이드의 중간 부분에 섹션. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg"> 그림 3: 셀 블록 준비 및 확인 되며 오신 및 immunostaining 품질. (A) 되며-및-오신-스테인드 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 섹션에 HeLa 세포의 이미지. (B) 불규칙 착 색 기-67의 저조한에 immunocytochemistry에 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록 섹션 준비. 스케일 바는 (A) 100 및 (B) 200 μ m. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg"> 그림 4: Immunocytochemical 헬러 셀 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 얼룩. (A) CKAP2 높은 mitotic 조건 하에서 얼룩. (B) CKAP2 혈 청 공 복 상태에서 얼룩. (C) 기-67 높은 mitotic 조건 하에서 얼룩. (D) 기-67 혈 청 공 복 상태에서 얼룩. 100 μ m 스케일 바 표시 됩니다. 화살촉 표시 CKAP2-긍정적인 세포. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>절차</td>
			<td>단계</td>
			<td>솔루션</td>
			<td>시간/온도</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">탈수</td>
			<td>1</td>
			<td>70% 알코올</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>80% 알코올</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>95% 알콜</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>100% 알코올</td>
			<td>15 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">지우기</td>
			<td>1</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>60 분/4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>10 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>10 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>크 실 렌</td>
			<td>10 분/실시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>* RT, 실내 온도</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 조직 처리 절차입니다.

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Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

현재, 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩 때 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법 형태학 정보도 필요 하다. 여기에 소개이 프로토콜 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 다른 방법을 제공 합니다.

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

determination-protein-expression-level-cultured-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.4K 조회수.  National Cancer Center. 현재, 고정된 셀에 immunofluorescent 얼룩 때 단백질 식 레벨의 결정에 대 한 선택의 방법 형태학 정보도 필요 하다. 여기에 소개이 프로토콜 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 immunocytochemistry의 다른 방법을 제공 합니다.

비디오: Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

연구

의학

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

형광 항체를 사용하여 마우스 표피의 파라핀 섹션에 Immunohistochemistry

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

생물학

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

암 연구학

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Isolation of Stably Transfected Melanoma Cell Clones

Cell populations that have stable changes in their genomic information are widely used by scientists as a research model. They do not require repeated cell transfection as it can lead to a heterogeneous cell population and variable transfection efficiency, affecting reproducibility. Moreover, they are preferable for large-scale analyses. The generation of stable cell clones is useful for a wide range of applications, such as research on gene functions and recombinant protein production. There are a few methods to obtain a homogenous cell population upon initial transient transfection. Here, we describe the isolation of single cell clones with glass cylinders. Although this method has been known for some time, there are a few crucial steps, and neglecting them may lead to failure. We have successfully used this method to obtain clones stably overexpressing a protein of interest (POI) or with knockout of a gene of interest (GOI). We describe preparation steps such as the optimization of selecting drug concentrations, preparation of glass cylinders, and validation of whether the obtained clones have the desired change in the expression of the GOI by PCR, western blot analysis, immunostaining, or gDNA sequencing (depending on the type of derived clones). We also discuss the phenotypic heterogeneity of well-established cell lines as this might be an issue in obtaining stable cell clones.

<meta charset="utf8"></head><body>안정적으로 transfection된 흑색종 세포 클론의 분리

A protocol is described for isolating stably transfected melanoma cell clones using glass cylinders. We focus on practical advice that may be decisive for the success of the entire procedure.

안정적으로 transfection된 흑색종 세포 클론의 분리

Cell populations that have stable changes in their genomic information are widely used by scientists as a research model. They do not require repeated ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Standardized Processing for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Immunohistochemistry Controls

Positive and negative controls with known expression of target proteins are essential for the development of immunohistochemistry (IHC) assays. While tissue controls are beneficial for well-characterized proteins with defined tissue and cellular expression patterns, they are less suitable for the initial development of IHC assays for novel, poorly characterized, or ubiquitously expressed proteins. Alternatively, due to their standardized nature, cell pellets, including cancer cell lines with defined protein or transcript expression levels (e.g., high, medium, and low expression), transfected over-expressing cell lines, or cell lines with genes deleted through cell engineering technologies like CRISPR, can serve as valuable controls, especially for the initial antibody characterization and selection. In order for these cell pellets to be used in the development of IHC assays for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues, they need to be processed and embedded in a manner that recapitulates the procedures used for tissue processing. This protocol describes a process for creating and processing formalin-fixed, paraffin-embedded cell pellet controls that can be used for IHC method developments.

Presented here is a protocol for generating formalin-fixed, paraffin-embedded cell pellet controls for immunohistochemistry.

포르말린 고정, 파라핀 포매 세포 펠릿 면역조직화학 대조군을 위한 표준화된 공정

Positive and negative controls with known expression of target proteins are essential for the development of immunohistochemistry (IHC) assays. While ...

Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

요약

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이 비디오의 챕터

양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

형광 항체를 사용하여 마우스 표피의 파라핀 섹션에 Immunohistochemistry

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

안정적으로 transfection된 흑색종 세포 클론의 분리

안정적으로 transfection된 흑색종 세포 클론의 분리

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

포르말린 고정, 파라핀 포매 세포 펠릿 면역조직화학 대조군을 위한 표준화된 공정