Name: constructing thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides via photo-induced thiol-ene/yne hydrothiolation
Uploaded: 2018-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation at JoVE.com

저자 인정 (제 21372023, 21778009 및 81701818); 중국 보조금의 자연 과학 재단에서 재정 지원 과학과 기술 (No. 2015DFA31590); 중화 인민 공화국의 심천 과학 및 기술 혁신 위원회 (제 JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250, 및 GJHS20170310093122365); 그리고 중국 박사 후 과학 재단 (No. 2017 M 610704).

1. 장비 준비
<ol><li>수동 펩 티 드 합성 장치에 대 한 효율적인 증기 두건에서 진공 매니폴드 (테이블의 재료)를 배치 합니다. 다음, 진공 매니폴드에 3 방향 stopcocks를 놓고 질소 또는 아르곤 가스 라인에 그들을 연결 합니다. 고무 격 막 사용 하 여 모든 사용 하지 않는 후미 모자.</li>
	<li>수 지 가득 열 (0.8 x 4 cm, 10 mL 저수지, 재료의 표참조) 매니폴드 3 방향 stopcocks (그림 1)를 사용 하 여 연결 합니다. 진공 여과 또는 고무 피 펫 벌브로 밀어내어 진공 시스템에 연결 된 펌프를 사용 하 여 열에 있는 용 매를 제거 하.</li>
	<li>Photoreactor (그림 2)를 사용 하 여 UV 방사선에 대 한 10 350 nm 램프 (테이블의 재료)를 갖추고 있습니다. 아르곤 가스 탱크는 photoreactor 이전에 photoreactions 동안 아르곤 가스로 가득 되도록 photoreactor 공기 흡입구를 통해에 연결 합니다.</li>
	<li>photoreactor의 UV 램프에 전환 하기 전에 확인 경우에 자외선에서 방사선 photoreactor 문이 닫혀 있다.</li>
</ol>2. 수 지 준비
참고: 일반적으로, 펩 티 드 기판의 건설 수행 됩니다 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 합성 프로토콜을 사용 하 여. 이 C 터미널 아 미드 나머지 다음 펩 티 드 분열을 그대로 링크 아 미드 수 지를 사용 하 여 실시 됩니다. 이 프로토콜은 종이 걸쳐 사용 됩니다.
주의: N, N-dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM), 4-methylmorpholine (NMM), 및 N, N-diisoproylethylamine (DIPEA)은 유독 하 고 유해한 흡입, 섭취, 또는 피부 접촉에 의해. Diethyl 에테르 가연성 이다입니다. Trifluoroacetic 산 (TFA) 부식성입니다. 1, 2-ethanedithiol (EDT)는 매우 악취를 풍기. 따라서, 모든 유기 용 제, 화학 물질, 적절 한 개인 보호 장비 (니트 릴 장갑, 실험실 외 투, 및 보호 안경) 처리와 있어야 화학 증기 두건 내부 처리 합니다.
<ol><li>다음 수식을 사용 하 여 필요한 수 지의 양을 계산 합니다. 확장 (mmol) / (적재 능력 (mmol/g) 1000 (mg/g)을 수 지) 수 지 (mg)의 질량 = 예를 들어, 링크 아 미드 MBHA 수 지 (0.5 m m o l/g) 25 µmol에 대 한 금액 = 0.025 m m o l / (0.5 m m o l/g 1000 mg/g) = 50 mg. 다음, 열 수 지의 50 밀리 그램 무게 하 고 3 방향 stopcocks를 사용 하 여 진공 매니폴드에 그것을 설정 합니다.</li>
	<li>열 (0.8 x 4 cm, 10 mL 저수지)에 수 지를 DCM의 1-2 mL를 추가 합니다. 수 지를, 부드럽게 교 반 하십시오 질소 또는 아르곤 stream을 사용 하 여 10 분. 다음, 진공 여과 사용 하 여 용 매를 제거.</li>
</ol>3. N-터미널 Fmoc Deprotection 및 세척
<ol><li>Deprotecting 솔루션 N 맨끝 Fmoc 준비: 50% (v/v) morpholine 유리병에 DMF에의 한 적절 한 볼륨 (200 mL)를 준비.</li>
	<li>수 지에 deprotection 솔루션의 1-2 mL를 추가 하 고 부드럽게 10 분 동안 그것을 선동 한 다음 진공 청소기를 사용 하 여 솔루션을 배수. 그 순서 대로 DMF (1-2 mL)과 DCM (1-2 mL) using, 수 지와 반응 선박 3 배 총을 철저 하 게 세척. 다음 절차를 반복 합니다 deprotection 및 세척 1 x.</li>
</ol>4. Fmoc 보호 아미노산 커플링
<ol><li>Fmoc-크 람-오 (5 equiv., 41.4 mg), 무게 25 µ-스케일 수동 합성의 경우 예를 들어, 알라닌 잔류물의 커플링을 사용 하 여 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HCTU; 4.9 equiv., 50.5 m g)에 폴 리 프로필 렌 컨테이너 DMF (0.5 mL)에 녹 이십시오.</li>
	<li>DIPEA 추가 (10 equiv., 43.5 µ l) 0.25 M를 생성 하기 위해 활성화 아미노산 솔루션 (표 1). 대략 1 분 사전 활성화에 따라 수 지에 솔루션을 추가 하 고 약 1-2 h N2 와 거품.</li>
	<li>이 단계에서 일련의 단계를로 펩 티 드 사슬에 있는 각 아미노산을 통합: N 맨끝 Fmoc 그룹, 그리고 세척의 deprotection HCTU를 사용 하 여 활성화를 통해 아미노산의 결합에 의해 뒤에 먼저. 참고: 더 이상 연결 시간 (예., 2 h) 것이 좋습니다 경우 sterically 방해 아미노산 잔류물에 따라 커플링 [예., Fmoc-목 (tBu)-오, Fmoc Cys (Trt)-오, Fmoc-그의 (Trt)-오, Fmoc Arg (Pbf)-오]. 비 천연 아미노산을 베어링 켄/alkyne 5 대신 3 항목에 사용 됩니다 그리고 3 h 반응 남아 있습니다.</li>
	<li>Arora 외 에 설명 된 대로 카이 저 또는 chloranil 테스트를 사용 하 여 펩 티 드 합성 진행률 모니터링 36 이러한 테스트 무료 1 차 및 이차 아민의 유무는 존재의 질적 평가 제공합니다. 또는, 펩 티 드의 약 2-3 mg 수 지에서 죽 습 하 고 LC MS에 의해 분석 될 수 있습니다.</li>
</ol>5. thiol-ene Hydrothiolation 및 Thiol-yne Cyclization
<ol><li>수 지에 cyclization (그림 3)를 통해 thioether 링커를 구성 합니다.<ol>
<li>Trt deprotection 솔루션 (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0)의 약 50 mL를 준비 합니다. Cys-및 mS5치료-수 지 베어링 [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-수 지, 50 mg] 10 mL 열에서 Trt deprotection 솔루션의 1-2 mL와 함께. 부드럽게 N2를 사용 하 여 10 분 동안 해결책을 교 반 하십시오. 마지막으로, DCM로 그것을 씻어 (1-2 mL) x 3의 총. 참고: MS5 나타냅니다 alkylene 베어링 빌딩 블록 펩 티 드 결합 및 thio-ene cyclization38사용 (참조 그림 6에 묘사 된 구조).</li>
		<li>약 6 x 총 솔루션 색상은 노란색이 더 이상 때까지 시스테인, trityl 보호 그룹을 제거 하려면 위에서 설명한 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>R-mS5-A-A-A-Cys(-SH)-R을 씻어 N2버블링 '-수 지 [무료 thio와 시스테인 (-SH)] 그 순서 대로 (1-2 mL) DCM와 DMF (1-2 mL). 2 분 동안 메탄올 (1-2 mL)을 사용 하 여 수 지를 축소 한 다음 용 매 여과 사용 하 여 제거. 그런 다음 순차적으로 열에 약 5 분에 대 한 N2 가스의 증기에서 수 지 건조.</li>
		<li>준비 degassed DMF 미리 입 플라스 크 내의 용 매에 기지개 했다 긴 바늘을 통해 약 1 시간에 대 한 버블링 질소 가스에 의해.</li>
		<li>무게 종이 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스 크에 수 지를 전송 합니다. 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone photoinitiator의 추가 의해 따라 degassed DMF의 2 mL에 수 지를 중단 (MMP; 1 equiv., 5.6 밀리 그램), 4-methoxyacetophenone (지도; 1 equiv., 3.8 mg).</li>
		<li>저 어 추가 (0.3 cm) 플라스 크로 바와 적당 한 고무 플러그 플라스 크 모자 다음 플라스 크에 어 오일 펌프를 사용 하는 질소 가스로 치환. 참고: 불활성 분위기 필요 하지 않습니다 엄격 하 게 효과적인 thio-ene photoreaction에 대 한 단단한 단계에. 그러나, 그것이 그림5에서 솔루션 단계에서 thio-yne photoreaction에 대 한 매우 필요 합니다. 그렇지 않으면, 유황 UV 방사선 조사 동안 산화 됩니다.</li>
		<li>반응 플라스 크를 photoreactor로 설정 하 고 실내 온도 (그림 2)에서 UV 방사선에서 1 시간에 대 한 수 지를 저 어. 주의: photoreactor UV 램프를 켜는, 사전 확인 하십시오 경우에 UV 빛에서 유해한 방사선 photoreactor 문이 닫혀 있다. 참고: 선형 펩 티 드 선구자는 제품의 동일한 분자량으로 새로운 시퀀스 좋습니다 자주는 photoreactions 동안 반응 혼합물을 샘플링. 일반적으로, 선형 및 주기적인 펩 티 드 크게 다른 화란을 표시합니다. 이 HPLC를 사용 하 여 쉽게 구별 될 수 있습니다. 또는, 5, 5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic 산) (DTNB) 시 약 무료 thiol37의 존재를 공부 하는 데 사용 또한 수.</li>
		<li>열에 플라스 크에서 수 지를 전송 하 고 진공 여과 사용 하 여 용 매를 제거 합니다. 세척 하 고 단계 5.1.3에서에서 설명 된 대로 수 지를 건조.</li>
		<li>분열 칵테일 (TFA/팁/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) 증기 두건에서의 약 10 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>2 mL 폴 리 프로필 렌 용기에 수 지를 전송, 컨테이너, 분열 칵테일 (TFA/팁/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5)의 1 mL을 추가 하 고 밀접 하 게 나사 모자를 사용 하 여 컨테이너를 봉인. 다음,로 교 반 1.5-2 h에 대 한 증기 두건에서 60 rpm의 속도로 궤도 통에 컨테이너를 부드럽게 하십시오. 주의: TFA 매우 부식성입니다. 보호복을 착용 하 고 효율적인 증기 두건에서 작동. 동부 서머 타임은 매우 악취를 풍기는 물질 하 고 효율적인 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>증발 증기 두건에는 N2 가스 스트림 아래 여 TFA 칵테일을 제거 합니다. 다음, 30 s 및 격리에 대 한 차가운 diethyl 에테르 (1 mL)을 사용 하 여 잔류물을 침전 2 분 12000 x g에서 원심 분리를 통해. 원심 분리, 다음 조심 스럽게 부 어 에테르 구성 요소를 줄. 2x 대 한 침전과 원심 분리 단계를 반복 합니다. 증발 건조에 잔류물.</li>
		<li>마지막으로, 1 mL H2O/이기 (2:1)에 찌 꺼 기를 녹이 고 HPLC C18 분석 열을 사용 하 여 정화 (4.6 x 250 m m 흐름 속도 1.0 mL/min). 사용 H2O (포함 하는 0.1 %TFA)와 UV 280 nm와 220 nm 파장 (표 2)를 사용 하 여 25 분 모니터 HPLC 스펙트럼을 통해 70% 이기에 20%에서 2%/min 선형 그라데이션에서 용 매로 순수한 이기.</li>
	</ol></li>
	<li>Macrolactamization (그림 4)에 의해 intermolecular thio-ene 반응, 그리고 cyclize 펩 티 드를 통해 thioether 링커를 구성 합니다.<ol>
<li>선형 펩 티 드 H2N-A-A-A-mS5베어링 alkylene 잔류물을 합성 (2-R ')-R'-수 지 (50mg) 사용 하 여 표준 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)에 설명 된 대로 단계 2-4. 다음, 세척 하 고 단계 5.1.3에서에서 설명 된 대로 수 지를 건조.</li>
		<li>10 mL 둥근 바닥 플라스 크 5.1.4 단계에서 설명한 대로 degassed DMF의 2 개 mL를 포함 하는 수 지를 일시 중단 합니다.</li>
		<li>추가 photoinitiator MMP와 지도 (MMP: 1 equiv., 5.6 밀리 그램; 지도: 1 equiv., 3.8 m g), Fmoc-Cys-오 (3 equiv., 25.7 m g), 그리고 저 어 (0.3 cm) 플라스 크로 바. 적당 한 고무 플러그를 사용 하 여 플라스 크 모자 고 오일 펌프를 사용 하 여 플라스 크에 공기를 질소 바꿉니다.</li>
		<li>반응 플라스 크를 photoreactor로 설정 합니다. 실내 온도 (그림 2)에서 UV 방사선에서 1-2 시간 저 어.</li>
		<li>LC MS 분석 아래 반응 모니터링: 분열 칵테일을 사용 하 여 수 지의 2-3 mg을 쪼개 다. 다음 찬 diethyl 에테르 (300 µ L)으로 찌 꺼 기를 침전, 원심 분리, 여 찌 꺼 기를 분리 하 고 5.1.11 단계에서 설명한 대로 건조에 잔류물을 증발. 그 후, H2O/이기 (2:1) 100 µ L에서 잔류물을 디졸브. 펩 티 드 솔루션 0.22 μ m 미소 한 구멍이 있는 필름을 사용 하 여 여과 하 고 분무 이온화 (ESI)에서 이온화 하 고 긍정적인 모드에서 운영 하는 화합물과 LC-MS를 사용 하 여 분석.</li>
		<li>경우에 필요한, 반복 단계 5.2.2-반응 되도록 5.2.4 완료 수행 됩니다.</li>
		<li>사진-반응의 완료 다음 열에 플라스 크에서 수 지를 전송 하 고 진공 여과 사용 하 여 용 매를 제거 합니다. 세척 하 고 단계 5.1.3에서에서 설명 된 대로 수 지를 건조.</li>
		<li>Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate의 DMF 솔루션 추가 (PyBob; 2.4 equiv., 31.2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2.4 equiv., 8.1 m g), 및 NMM (4 equiv., 11 µ L)는 macrolactamization에 대 한 열 수 지에. 버블 2 h N2 이 솔루션.<ol>
<li>또한,이 커플링 반응 단계 5.2.3에에서 설명 된 대로 LC-MS를 사용 하 여 모니터링 합니다. 필요한 경우 반복 반응 되도록이 단계 완료를 수행 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3, 4 단계에 설명 된 대로 표준 Fmoc 기반 SPPS를 사용 하 여 펩 티 드 연장</li>
		<li>모든 아미노산 잔류물의 어셈블리 단계 5.1.10 5.1.11에에서 설명 된 대로 수 지에서 펩 티 드를 쪼개 고 5.1.12 단계에서 설명한 대로 그것을 정화.</li>
	</ol></li>
	<li>솔루션 단계 (그림 5)에서 비닐 황화 링커를 구성 합니다.<ol>
<li>2-4 단계에 설명 된 대로 표준 Fmoc 기반 SPPS를 사용 하 여 선형 펩 티 드 베어링 alkyne 잔류물을 음성 합성. 이전 연구20에 설명 된 대로 잘 설립 된 프로토콜에 따라 아미노산을 베어링 alkyne 음성 합성.</li>
		<li>수 지에서 펩 티 드를 쪼개 고 5.1.11 5.1.9-단계에 설명 된 대로 찬 diethyl 에테르를 사용 하 여 침전. 절단, 수 지의 강 수에 따라 2 분 12000 x g에서 원심 분리를 사용 하 여 펩 티 드를 수집 합니다.</li>
		<li>진공 상태에서 결과 잔류물을 건조. 0.5 m m의 최종 농도 도달 하기 위해서는 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 degassed DMF (50 mL)에 찌 꺼 기를 분해 (수 지, 0.025 m m o l의 로드에 따라 (1000 mL/L / 0.5 mmol/L) 50 mL =).<ol>
<li>Photoinitiator DMPA (0.5 equiv., 3.2 밀리 그램)를 추가 하 고 솔루션으로 뻗어 긴 바늘을 통해 N2 를 사용 하 여 10 분 동안 반응 솔루션을 드. 다음, 0.5-동요 없이 1 시간에 대 한 상 온에서 자외선 아래 샘플 비추는.</li>
		</ol>
</li>
		<li>높은 진공 아래 DMF를 제거 하 고 그것의 유기 부산물을 분해 하려면 diethyl 에테르를 추가 하 여 원유 찌 꺼 기를 침전. 그런 다음 2 분 동안 12000 x g에서 원심 분리를 사용 하 여 찌 꺼 기 분리. 원심 분리, 다음 조심 스럽게 부 어 에테르 구성 요소를 줄. 증발 건조에 잔류물. 마지막으로, H2O/이기 (2:1) 1 mL에 찌 꺼 기를 녹이 고 정화 단계 5.1.7에에서 설명 된 대로 HPLC를 사용 하 여.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 없다.

그림 3에 설명 된 수 지에 intramolecular thio-ene cyclization trityl 그룹의 시스테인 잔류물의 제거 이후 photoreaction에 대 한 중요 한 단계가 될 발견 되었습니다. 또한, 이전에 펩 티 드 분자 무게와 반응으로 동일한 것으로 밝혀졌다 다음 그림 6B에 그려져 있습니다. 따라서, HPLC id 또는 DTNB 분석 결과 사용 하 여 반응을 모니터 하기 위해 필요 합니다. Intermolecular t...

단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)를 변조 하는 ligands의 개발 현대 약물 발견에 대 한 매력적인 접근을 제공 합니다. 따라서, 많은 노력은 PPIs1,2,3변조 효율적으로 수 공부 소설 화학 형식으로 투자 되었다. PPIs는 일반적으로 얕은 크거나 단종 상호 작용 표면, 구성 하 고 작은 분자 PPIs4,5의 변조에 대 한 부적 절 한 ligands로 일반적으로 간주 됩니다. 적당 한 노출 상호 작용 표면 면적, 짧은 펩 티 드 단백질 인터페이스의 구조 기능을 모방 하는이 문제가6,7를 해결 하기 위해 이상적인 후보자를 나타냅니다. 그러나, 짧은 펩 티 드 일반적으로 수성 솔루션에 구조화 된 되지 않습니다. 이 물 분자의 펩 티 드 등뼈 및 잘 정의 된 conformations intramolecular 수소 결합 네트워크와 경쟁 하는 물8entropically 유리한는 사실 때문입니다. 또한, 펩 티 드의 본질적으로 낮은 안정성 및 세포 침투성 속성 주로 생물 학적 응용9,10에 그들의 사용을 제한. 단백질 데이터 은행 (PDB) 분석 > 짧은 α-나선 상호 작용11를 포함 하는 PPIs의 50%. 따라서, 다른 화학 방법 나선 안정화에 관한 개발 되었습니다. 이들은 이황화/thioether 유대 형성12,,1314, 반지-닫는 metathesis15, 락탐 반지 형성16를 포함, 화학17의 추가 "클릭" perfluoroarenes18,19, 그리고 비닐 황화 대형20.
안정된 헬리컬 펩 티 드 널리 p53, 등 다양 한 세포내 목표에 대 한 활용은 에스트로겐 수용 체, Ras, bcl-2 가족 단백질, 그리고 다른 사람21,22,,2324. ALRN-6924, 모든 탄화수소 MDM2 및 MDMX의 펩 티 드 이중 억제제를 붙인, 임상 조사25현재 사용 되 고. 지난 몇 년 동안, 우리의 그룹은 thiol ene와 thiol-yne 반응26,,2728를 사용 하 여 새로운 펩 티 드 안정화 방법의 개발에 집중 했다. 일반적으로, 우리는 자연스럽 게 풍부한 시스테인 사용 되 면 이러한 사진 시작 반응 온화한 조건 하에서 효율적인는 증명 하고있다. 또한, 우리가 이러한 반응 우수한 기능 그룹 허용 바이오 직교 고 펩 티 드 및 단백질 수정29적용할 수 입증 되었습니다 나타났습니다. 결과 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드 크게 제약 펩 티 드의 화학 공간을 개선 정한 밧줄에 수정 센터를 제공 하 고 수많은 생물 학적 응용 프로그램30 사용에 대 한 적용할 수 입증 ,3132. 날짜 하려면, 제한 된 보고서만 thiol-ene/thiol-yne 펩 티 드 cyclization에 관한 설명 했습니다. 2009 년 Anseth 그 외 여러분 에 의해 출판, 연구에는 수 지에 intramolecular thiol-ene 시스테인과 활성화 된 알 켄 사이 펩 티 드 cyclization에 대 한 반응은 시연된33. 2015 년에 chou의 외. 2 구성 요소 급진 시작된 thiol-ene 반응34 와 후속, 순차 thiol-yne/한 커플링 반응35스테이플링 펩 티 드에 대 한 설명. 최근에, 우리는 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드20,,2627에 따라 작품의 시리즈 설명. 이 프로토콜에는 광범위 한 연구 공동체에 대 한 도움이 될 것입니다 희망에서 위에서 언급 한 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드의 상세한 종합을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g)</td><td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>Standard Fmoc-protected amino acids</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-2-pyrrolidinone</td><td>Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.</td><td>3230</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Dimethyl formamide</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Energy</td><td>W330229</td><td>skin harmful</td></tr><tr><td>N,N-Diisoproylethylamine</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>J&amp;amp;K</td><td>101398</td><td>corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>J&amp;amp;K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>J&amp;amp;K</td><td>248897</td><td>Stench</td></tr><tr><td>2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate&amp;nbsp;</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>851012</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td>irritant</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>flammable</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicity</td></tr><tr><td>2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone</td><td>Energy</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-methoxyacetophenone</td><td>Energy</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone</td><td>Energy</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5&#039;-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)</td><td>J&amp;amp;K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate</td><td>Energy</td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazole</td><td>Energy</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylmorpholine</td><td>Energy</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Liquid Chromatography</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>Electrospray Ionization Mass</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentration system</td><td>Thermo</td><td>Savant</td><td></td></tr><tr><td>vacuum manifold</td><td>promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>three-way stopcocks</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>poly-prep chromatography columns&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

constructing thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides via photo-induced thiol-ene/yne hydrothiolation

여기, 우리-수 지 intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation를 사용 하 여 thioether-곁에 펩 티 드의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한,이 프로토콜 난, 난 + 4 개의 위치에 알 켄/alkyne 사이드 체인을 소유 하는 amino acids 및 시스테인 잔류물 사이 솔루션 intramolecular thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여 비닐 황화 닿는 펩 티 드의 준비를 설명 합니다. 선형 펩 티 드 표준 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)을 사용 하 여 합성 했다. Thiol 한 hydrothiolation는 intramolecular thio-ene 반응 또는 펩 티 드의 길이 따라 intermolecular thio-ene 반응 중 하나를 사용 하 여 실시 됩니다. 이 연구에서 intramolecular thio-ene 반응 수 지에 따라 선형 펩 티 드의 완전 한 합성 시스테인 잔류물의 trityl 그룹의 deprotection를 사용 하 여 짧은 펩 티 드의 경우 수행 됩니다. 수 지 photoinitiator 4 methoxyacetophenone (지도) 및 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP)를 사용 하 여 UV 방사선을 설정 합니다. Intermolecular thiol-ene 반응 Fmoc Cys 오 N, N-dimethylformamide (DMF) 용 매에 용 해 하 여 수행 됩니다. 이 다음 수 지를 켄 베어링 잔류물을 사용 하 여 펩 티 드와 함께 반응. 그 후에, macrolactamization는 활성화 시 약 지에로 benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), 및 4-Methylmorpholine (NMM)를 사용 하 여 밖으로 수행 됩니다. Macrolactamization, 다음 펩 티 드 종합은 계속 표준 SPPS를 사용 하 여. Thio-yne hydrothiolation의 경우 선형 펩 티 드 수 지에서 죽 습, 건조, 이며 이후 degassed DMF에 녹아. 이것은 다음 photoinitiator 2, 2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA)와 UV 빛을 사용 하 여 반구. 반응에 따라 DMF 증발 하 고 원유 찌 꺼 기 침전은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용 하 여 정화. 이러한 방법은 수 세대 thioether 곁 순환 펩 티 드의 우수한 기능 그룹 허용 및 좋은 수확량을가지고 thio-ene 또는 yne 클릭 화학의 사용을 단순화 하기 위해 작동 합니다. 펩 티 드로 thioether의 소개의 시스테인 잔류물 및 자연의를 이황화 채권 기준으로 redox 불활성 이다.

펩 티 드 Ac YmS5AAAC NH2 와 그 cyclized 제품 Ac-Y-(쿠-1, 5)-[mS5AAAC]-의 HPLC 및 MS 스펙트럼 NH2 수 지에 intramolecular thiol-ene photoreaction를 사용 하 여 생성 된 그림에에서 묘사 6B. 주기적인 펩 티 드의 선형 전조를 기준으로 동일한 분자량을 발견. 그러나, HPLC 보존 시간이 약 2 분 같은 분리 조건 하에서 그것의 선구자 보다 이전 수 ?...

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Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K 조회수.  Peking University Shenzhen Graduate School. 선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

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A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

연구

생화학

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

이단 티올 레이트 반응을 이용하여 프로그래밍 주쇄 액정 엘라스토머의 합성

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

화학

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

생체공학

Self-assembling Morphologies Obtained from Helical Polycarbodiimide Copolymers and Their Triazole Derivatives

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous networks, ribbons, worm-like aggregates, toroidal structures, and spherical particles) is described. These aggregates are morphologically influenced by extensive hydrophobic side chain-side chain interactions of the singular polycarbodiimide strands, as inferred by atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) techniques. Polycarbodiimide-g-polystyrene copolymers (PS-PCDs) were prepared by a combination of synthetic methods, including coordination-insertion polymerization, copper(I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC) &#34;click&#34; chemistry, and atom transfer radical polymerization (ATRP). PS-PCDs were found to form specific toroidal architectures at low concentrations in CHCl3. To determine the influence of a more polar solvent medium (i.e., THF and THF/EtOH) on polymer aggregation behavior, a number of representative PS-PCD composites have been tested to show discrete concentration-dependent spherical particles. These fundamental studies are of practical interest to the development of experimental procedures for desirable architectures by directed self-assembly in thin film. These architectures may be exploited as drug carriers, whereas other morphological findings represent certain interest in the area of novel functional materials.

Here, we present a protocol to prepare and visualize secondary structures (e.g., fibers, toroidal architectures, and nano-spheres) derived from helical polycarbodiimides. The morphology characterized by both atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM) was shown to depend on molecular structure, concentration, and the solvent of choice.

나선형 폴리 카 보디이 미드 공중 합체 및 이들의 트리아 졸 유도체로부터 획득 자기 조립 모폴로지

A facile method for the preparation of polycarbodiimide-based secondary structures (e.g., nano-rings, &#34;craters,&#34; fibers, looped fibers, fibrous ...

Synthesis of a Thiol Building Block for the Crystallization of a Semiconducting Gyroidal Metal-sulfur Framework

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and porous metal-dithiolene network in the highly ordered single crystalline state. Unlike the highly reactive free-standing thiols, which tend to decompose and complicate the crystallization of metal-thiolate open frameworks, the thioester reacts in situ to provide the thiol species, serving to mitigate the reaction between the mercaptan units and the metal centers, and to improve crystallization consequently. Specifically, the thioester was synthesized in a one-pot procedure: an aromatic bromide (hexabromotriphenylene) reacted with excess sodium thiomethoxide under vigorous conditions to first form the thioether intermediate product. The thioether was then demethylated by the excess thiomethoxide to provide the thiolate anion that was acylated to form the thioester product. The thioester was conveniently purified by standard column chromatography, and then used directly in the framework synthesis, wherein NaOH and ethylenediamine serve to revert in situ the thioester to the thiol linker for assembling the single-crystalline Pb(II)-dithiolene network. Compared with other methods for thiol synthesis (e.g., by cleaving alkyl thioether using sodium metal and liquid ammonia), the thioester synthesis here uses simple conditions and economical reagents. Moreover, the thioester product is stable and can be conveniently handled and stored. More importantly, in contrast to the generic difficulty in accessing crystalline metal-thiolate open frameworks, we demonstrate that using the thioester for in situ formation of the thiol linker greatly improves the crystallinity of the solid-state product. We intend to encourage broader research efforts on the technologically important metal-sulfur frameworks by disclosing the synthetic protocol for the thioester as well as the crystalline framework solid.

Here, we present a one-pot, transition-metal-free synthesis of thiols and thioesters from aromatic halides and sodium thiomethoxide, followed by the preparation of single crystals of a metal-dithiolene network using thiol species generated in situ from the more stable and tractable thioester.

반도체 Gyroidal 금속-황 프레임 워크의 결정 화에 대 한 Thiol 빌딩 블록의 합성

We present a method for preparing thioester molecules as the masked form of the thiol linkers and their utilization for accessing a semiconducting and ...

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

합성 및 특성 1, 2-Dithiolane의 수정 자가 조립 펩 티 드

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

정보 베어링 펩토이드의 합성과 시퀀스 지향 동적 공유자 자체 조립

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

온테더 설포늄 중심을 사용한 순환 펩타이드 구성

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...