원고 편집 도움에 감사 클레어 Prendergast 하 고. DKN 지원 연구 러닝 재단에서 (#2095) 부여 및 TM는 건강의 국가 학회 (R01HL056643 및 R01HL092514)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. DKN는 방법을 개발 하 고 연구를 설계 하 고, 쓴 원고; OM 지원 동물 연구와 임상 샘플 조달; SB 지원 흐름 cytometric 분석 및 세포 분류; TM 연구를 감독 하 고 원고를 검토.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 세인트 조셉의 병원 및 의료 센터에서 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다.
1. 절연 Murine Bronchoalveolar 게 (BAL) 액체에서 AMs의
<ol><li>케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.</li>
	<li>복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 준비 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.</li>
	<li>부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.</li>
	<li>열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.</li>
	<li>순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL 버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)를 삽입할. 흡수 성 목화 패드와 함께 혈액의 흐름을 흡수. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 게에 대 한 준비가 다음 blanched 표시 됩니다.</li>
	<li>부드럽게 피부를 자르면 고 기도 폭로 목에 근육. 신중 하 게 소비 세는 인접 근육, 연골, 및 지방 조직 기관 손상 없이.</li>
	<li>작은 절 개를 만들기 (< 2 m m) 후 두 후부 기관에. 이 절 기도 여전히 후 두에 연결 되어 있는 동안에 카 테 터 삽입에 충분 해야 합니다. 폐 쪽으로 기관지에 바늘 없이 1 인치 22 G 카 테 터를 삽입 합니다. 실크 꼰된 봉합으로 카 테 터를 확보 (4-0; 비 흡수) 광장 매듭. 참고: 카 테 터는 마우스 크기에 따라 모든 트림을 하 게 해야 합니다. 매우 짧은 또는 긴 카는 누설 하 게 동안 기도 찢 어 경향이 있습니다. 카 테 터 길이 등을 해야 그 때 완전히 삽입 팁 남아 기도 내 고 주 기관지에 도달 하지.</li>
	<li>카 테 터를 얼음 처럼 차가운 발 버퍼 (캘리포니아2 + , Mg2 + 무료 PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산, EDTA)으로 가득 1 mL 주사기를 연결 하 고 천천히 폐에 버퍼 되지 않도록. 이 폐를 부 풀 려 것입니다. 5 초에 대 한 카 테 터에 부착 된 주사기를 유지 하 고 게 액체 피스톤을 부드럽게 당겨서 발음. 이 폐 폐의 것입니다. 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 액체를 수집 합니다.</li>
	<li>9 번에 대 한 단계 1.10을 반복 하 고 게 액체 수영장. 폐 용량을 초과 하 고 그것의 파열으로 이어질 수 있습니다 그 플러시, 당 1 mL 버퍼를 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.</li>
	<li>10 분간 4 ° C에서 250 x g에 10 mL 발 유체 원심. 셀 펠 릿 발 셀을 포함합니다. 주의: 펠 릿 매우 작을 수 있습니다, 그리고 그래서 주의 상쾌한 발음 하는 경우.</li>
	<li>흐름/정렬 버퍼 (PBS 2% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1 mM EDTA + + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES))의 100 μ에 발 셀 resuspend</li>
	<li>Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.</li>
	<li>항 체 형광에서 1 (FMO)을 뺀 함께 얼룩을 수행 하 고 단일-얼룩 컨트롤11,25. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 흐름 cytometry 분석 하 여 적절 한 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조) ( 재료의 표참조).</li>
	<li>AMs 격리 형광 활성화 된 세포에 의해 정렬 ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 정렬 AMs 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>2. 마우스 폐, 단일 세포 현 탁 액에서에서 AMs의 격리
<ol><li>케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.</li>
	<li>복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.</li>
	<li>부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.</li>
	<li>열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.</li>
	<li>순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 삽입할. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 수확에 대 한 준비가 blanched 표시 됩니다.</li>
	<li>추위의 5 mL 15 mL 원뿔 튜브로 기관, 혈관, 인 대를 절단 하 여 폐 밖으로 해 부 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM). 다음 단계까지 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.</li>
	<li>Perfused 폐 3 mL DMEM와 멸 균 및 pyrogen 무료 60 m m 문화 접시에 전송 합니다. 있는 경우 집게 해 부의 도움으로 기도와 다른 하드 비 폐 조직 소재, 애타게. 하 메스와 폐 조직 말하다 < 1 m m 크기.</li>
	<li>300 µ g/mL Liberase TL과 5 U/mL을 추가 DNase I, pipetting으로 혼합 하 고 25 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어. 부드럽게 한 번 10 분 후 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>50 mL 원뿔 튜브에 설치 된 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 천연된 폐를 전달 합니다. 1 mL 주사기에서 플런저의 뒷면을 사용 하 여 필터에 세포 덩어리를 매 시. 20 mL 워시 버퍼 필터 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>4 ° C에서 500 x g에서 5 분간 원심. 삭제는 상쾌한 고 셀 펠 릿 20 mL 워시 버퍼에서 resuspend.</li>
	<li>단계 반복 2.12 2.13 두 번 필터와 튜브 각 시간을 변경 합니다. 전 5 분 이상 워시 버퍼에 필터를 몸을 담글 오전 수확량을 증가 합니다. 100을 추가 하 여 단일 세포 현 탁 액을 준비 μ 흐름/정렬 셀 펠 릿에 버퍼.</li>
	<li>Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.</li>
	<li>항 체 단일 얼룩 컨트롤11,25FMO와 얼룩을 수행 합니다. 평가 하는 폐 세포 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 1 mL 세포의 용 해 버퍼 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충으로 AMs를 정렬 합니다.</li>
</ol>3. 인간의 발 액체에서 AMs의 격리
<ol><li>4 ° c.에 실험실을 병원에서 인간의 발 액체의 이동 정렬</li>
	<li>10 분 동안 발 유체 (10-50 mL) 4 ° C에서 250 x g에서 원심. 셀 펠 릿 발 셀11포함 되어 있습니다.</li>
	<li>20 mL 워시 버퍼와 펠 릿을 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA)와 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.</li>
	<li>발 셀 흐름/정렬 버퍼의 100 μ에는 resuspend (PBS + 2% 열 사 FBS 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>인간의 Fc 블록 (클론 Fc1.3070, 25 μ g/mL)을 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 배양 하 여 Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 차단.</li>
	<li>항 체 단일 얼룩 컨트롤11,24FMO와 얼룩을 수행 합니다. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 인간의 오전 문화 매체 또는 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 보충 10 μ/mL β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>4. 문화 체 외에서 AMs에의
<ol><li>셀 정렬, 다음 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g에서 centrifuging 여 세포를 수확.</li>
	<li>1 mL 인간의 오전 문화 매체 [로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 보충 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF), 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 인간의 AMs resuspend 1mm 나트륨 pyruvate, 10 m m N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES), 및 (옵션) 1 x 페니실린/스]. 마찬가지로, 마우스 AMs 1 mL 마우스 오전 문화 매체 [DMEM 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 M-CSF, 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 1mm 나트륨 Pyruvate, 10 mM HEPES, 및 (선택 사항 1 x 페니실린/스 보충을 resuspend합니다 )].</li>
	<li>Trypan 블루 제외 가능한 셀 셀 카운터로 열거 하 고 1 x 106/mL에서 실행 가능한 세포 농도 조정 합니다. 참고: 이상적으로, 최대 5 x 105 AMs 수 발 유체는 8 10 주 오래 된 C57BL/6 남성 마우스에서 수집 으로부터 격리. 마우스 폐 다이제스트에서 오전 항복 변수 이며 마우스 발 액체의 보다 약간 덜 수 있습니다. 인간의 발 액체에서 오전 항복 발 액, 게, 그리고 환자의 임상 상태에 사용 하는 염 분의 총 볼륨의 볼륨에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>수율과 실험 필요성에 따라, 챔버 슬라이드, 문화 요리 또는 문화 플라스 크에 세포 씨앗. 이상적으로, 1 x 105/mL T25 조직 배양 플라스 크에 10 mL 매체에 AMs 씨앗.</li>
	<li>셀 5% CO2 분위기 37 ° C 습도 인큐베이터에 품 어. 참고: AMs 부착 세포로 성장할 것입니다 그리고 매우 느린-성장 하는 (시간을 두 배로 > 7 일).</li>
	<li>24 시간 후 시드, AMs 되어야 점착 및 문화 매체의 부드러운 변화에 의해 분리 되지 것입니다. 한쪽에서 포부에 의해 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 신선한 매체와 보충 참고: 셀 이제 오전 생리학 또는 자극의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. AMs 성장 챔버 슬라이드에 적절 한 항 체와 편리 하 게 얼룩이 질 수 있다 고 현미경 시각화에 이상적입니다. 흐름 cytometric 평가, AMs 비 효소 셀 솔루션 해리 외피에 의해 수확.</li>
	<li>문화 매체를 발음 하 고 문화 표면 (T25 플라스 크 당 약 2 mL)와 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어 충분히 출신과 솔루션을 추가 합니다. 아니 된다고 해야 합니다, 그리고 세포를 기계적으로 긁어 권장 되지 않습니다. 부드럽게 양쪽, 1-2 mL 흐름/정렬 버퍼 추가 누르고 부드럽게 위아래로 분리 부착 세포의 대부분을 플라스틱.</li>
	<li>RNA 연구에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 여 문화 접시에 직접 세포를 lyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity.">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. 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A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung.">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection.">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).</li><li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development.">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li><li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease.">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li><li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li><li>Nayak, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung.">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction.">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection.">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients.">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li><li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li></ol>

저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.

AMs는 출생 시 시작 및26의 전체 수명 동안 지속 폐를 채우는 긴-생활 폐 상주 세포. 폐 생리학7 과 병리학12 및 폐 면역24 의 그들의 잠재력에서 그들의 역할을 인정 받고 있다. AMs 폐11,27 에 있는 장기 존재와 그들이 활성화 및 면역 반응11,24...

폐 microenvironment 정교한 공기 도관, 맥 관 구조는 고유 하 게 복잡 한 생태계 이다. 흡입된 공기 혈액 공기 가스 교환 발생 하는 위치는 폐 포에 도달 하기 전에 기관 그리고 기관지 및 bronchioles의 수많은 분 지를 통해 여행. 분위기와 직접 상호 작용을 인해 호흡기 표면 공 수 입자와 오염 물질의 잠재적으로 유해한 영향 으로부터 보호를 요구 한다. 다양 한 물리, 화학, 및 면역학 장벽 폐를 보호합니다. 특히, 호흡기 표면에 phagocytes의 배포는 중요 한 첫 번째-라인 방어 시스템을 제공합니다. 치경 세포 (AMs)는 한 가지 유형의 폐 상주 식 세포, 그리고 그들은 폐 대 식 세포 수영장의 대부분을. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, AMs 주로 치경 루멘에 지역화 하 고 지속적으로 주변 분위기를 샘플 하 고 치경 상피1와 통신 하는 무 셀으로 발생 합니다. 정상 상태 폐에서 치조 공간에서 식 세포의 95%는 AMs2, 염증, 감염, 또는 오염 물질에 만성 노출의 구성을 변경할 수 있습니다.
AMs 폐에 로컬 될 수 있는 함수 및/또는 조직의 중요성의 광범위에 참가 한다. 예를 들어 AMs는 개발 및 폐;의 최적의 기능에 필수적 면역 감시; 그리고 세포 파편, 병원 균와 흡입된 입자3,,45,,67의. AMs의 타겟된 고갈 호흡기 바이러스 및 박테리아4,8의 손상으로 알려져 있다. 식 세포와 폐 항상성의 첫 줄 수비수로 서 자신의 역할, 외 AMs 알려져 있습니다 T 도출에 세포를 항 원 제시 세포 면역9, 작동 potentiating intranasal 백신10 의 효능과 폐 이식11,12후 폐 제한 면역에 영향을 미치는. 오전 기능 결핍 폐 치조 proteinosis (PAP), 유전자 변이, 악성 종양 또는 감염 폐 계면 활성 제13,14의 손상 발생 조건에 연결 되었습니다. AMs의 이식 PAP 15,16의 처리를 위한 치료 방법으로 탐험 되 고 지금입니다.
AMs는 embryogenesis 동안 발생 하 고 인생을 통해 폐 순환 백혈구2,17로 대체 되 고 없이 유지 알려져 있습니다. 오전 매출의 다양 한 수준의 인플루엔자 바이러스4, myeloablative 조사18도에 노출에 의해 감염을 포함 하 여 특정 임상 상황에 보고 되었습니다 비록, 오전 회전율 homeostatic 폐에서 감지, 19, 그리고 나이20. AMs는 낮은 확산17,21를 통해 자기 갱신으로 하지만 일부 최근 연구 monocytes 혈관 내 폐 세포22,23 아래에서 인구를 야기할 수 있는 주장 하지만 이러한 새로 변환 된 폐 세포의 기능 실험 조건, 폐 질환에 정의 하 아직 있다. 또한, 폐 염증 신호 및 immunoregulatory 기계 사이 균형을 유지 하는 시도 잠재적으로 흥미로운 영역입니다 오전 활성화의 맥락에서 자극의 임계값을 이해.
면역 규칙의 손실 생리 또는 pathologic 변경 다양 한 임상 설정 (예: 호흡기 감염, 염증 성 폐 질환과 거리 폐 질환)에서 평가에 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, AMs는 지표 또는 폐 건강11,24의 심지어 결정 요인으로 점점 인식 된다. 현재, 수확, 특성화, 또는 인간 및 전 임상 murine 모델에서 유지 AMs 사용할 수 없는 통합된 프로토콜 있습니다. 오전 선구자 및 고기, 합의의 부족 및 상세한 방법론의 부재 폐 건강 및 질병에 오전의 해독 역할에서 주요 장애물이 있었다. 다음 프로토콜 최종 식별, 격리 및 생체 외에서 문화 전략을 크게 오전 동작의 이해를 전진 하 고 오전 대상으로 진단 및 치료 연구를 용이 하 게 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Non-enzymatic cell dissociating solution</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Catheter&amp;nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Non-absorbable silk braided suture&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&amp;nbsp; (Ketathesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&amp;nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC,&amp;nbsp;CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Tissue culture flask</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>60 mm culture dish&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa cell analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Analysis Software</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Human)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Human)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td></tr></tbody></table>

isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages

치경 대 식 세포는 태아 근원의 말기 분화, 폐 상주 대 식 세포. 치경 대 식 세포는 그들의 긴 수명 및 폐 지역화 감염 및 염증 응답 뿐만 아니라 폐 개발 및 기능, 그들의 중요 한 역할에서 고유. 날짜 하려면, 식별, 격리, 및 인간과 쥐에서 치경 대 식 세포의 취급에 대 한 통합된 방법 존재 합니다. 이러한 메서드는 다양 한 실험 설정에서 이러한 중요 한 타고 난 면역 세포에 대 한 연구에 대 한 필요 하다. 쉽게 어떤 연구소에 의해 채택 될 수 있습니다, 여기에, 설명 하는 방법을 bronchoalveolar 게 액체 또는 폐 조직에서 치경 대 식 세포를 수확 하 고 그들 에 시험관을 유지 하는 간단한 접근 방법입니다. 치경 대 식 세포는 폐 포에 부착 세포로 주로 발생 하기 때문에이 방법의 초점은 수확 및 식별 하기 전에 그들을 dislodging에 있습니다. 폐는 매우 vascularized 기관 그리고 골수성과 림프 근원의 다양 한 셀 형식 서식, 상호 작용, 폐 microenvironment에 의해 좌우 된다. 여기 설명 된 표면 마커 집합을 사용 하 여 연구원 수를 쉽고 명확 하 게 다른 백혈구에서 치경 대 식 세포를 구별 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들을 정화. 여기 개발 문화 메서드 두 인간을 지원 하 고 치경 대 식 세포에 체 외 성장에 대 한 마우스 세포질이 고 분자 연구와 호환 됩니다.

흐름 cytometric 접근 마우스 AMs를 식별 하는 그림 1에 표시 됩니다. 이 표면 마커 다른 폐 상주 또는 폐에 침투 식 세포에서 AMs를 구별 하는 데 필요한 최소한의 분석을 포함 한다. 차동 분석은 긍정적으로 중간 세포, 수지상 세포, 호 중구, monocytes, 및 폐에서 발생 하는 monocyte 파생 된 폐 세포에서 AMs를 식별 해야 합니다. 표면 마커 다음 구성표 쉽게 구별...

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

23.6K 조회수.  St. Joseph's Hospital and Medical Center. 이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

비디오: Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

연구

면역학 및 감염병학

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

생체공학

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing bronchoalveolar lavage (BAL) fluid. The BAL fluid is rich in cells and can thus provide a 'snapshot' of the pulmonary immune milieu. CD4 T cells are the best characterized HIV reservoirs, while there is strong evidence to suggest that tissue macrophages, including alveolar macrophages (AMs), also serve as viral reservoirs. However, much is still unknown about the role of AMs in the context of HIV reservoir establishment and maintenance. Therefore, developing a protocol for processing BAL fluid to obtain cells that may be used in virological and immunological assays to characterize and evaluate the cell populations and subsets within the lung is relevant for understanding the role of the lungs as HIV reservoirs. Herein, we describe such a protocol, employing standard techniques such as simple centrifugation and flow cytometry. The CD4 T cells and AMs may then be used for subsequent applications, including immunophenotyping and HIV DNA and RNA quantification.

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

We describe a method for processing bronchoalveolar lavage fluid and matched peripheral blood from chronically HIV-infected individuals on antiretroviral therapy to assess pulmonary HIV reservoirs. These methods result in the acquisition of highly pure CD4 T cells and alveolar macrophages that may subsequently be used for immunophenotyping and HIV DNA/RNA quantifications by ultrasensitive polymerase chain reaction.

기관지 충혈 유체 및 폐포 대식세포 및 CD4+ T 세포 면역체노티핑 및 HIV 저수지 평가를 위한 일치하는 혈액 처리

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...