Name: two-photon intravital imaging of leukocytes during the immune response in lipopolysaccharide-treated mouse liver
Uploaded: 2018-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
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이 연구는 교부 금에서 국가 연구 재단의 한국 (NRF) (MSIP; 보조금 번호 2016R1A2B4008199 Y-m 한국 정부에 의해 자금에 의해 지원 되었다. H.)와 사역의 건강 및 복지, 한국 (번호 부여: HI14C1324).

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 연 세 대학의과 대학교의 지침에 따라 실시 했다. LysM-녹색 형광 단백질 (GFP; gfp / +) 마우스8 및 CX3Cr1 GFP (gfp / +) 나이의 8 ~ 12 주에9 마우스 intravital 이미징 사용 되었다. 모든 수술 도구 압력가 마로 소독 하 고 70% 알코올로 소독 했다.
1. 맞춤형 마우스 간 이미징 지원 도구와 챔버
<ol><li>마우스 간 이미징 챔버 디자인<ol>
<li>마우스 간 (그림 1) 이미징에 대 한 다음과 같은 크기의 방 만들기: 내부 챔버 (120 m m 길이 × 폭 160 m m × 30 m m 높이), 외부 챔버 (100 m m 길이 × 폭 100 m m × 24 m m 높이), 볼트 (Ф 높이 3 m m × 30 m m), 너트 (Ф 4 m m) 그리고 날개 모양의 너트 (Ф 4 m m).</li>
		<li>실리콘의 120 g의 총 수 있도록 경화 에이전트 및 1:9 비율에 탄성 중합체를 측정 합니다.</li>
		<li>250 mL 삼각 플라스 크에에서 액체 실리콘 혼합물을 넣고 잘 섞는다. 다음은 desiccator에 플라스 크를 넣어 고 펌프를 통해 진공에서 약 1 시간에 대 한 기포를 제거 합니다.</li>
		<li>높이 10 m m로 높은 맞춤형 마우스 챔버에 액체 실리콘 믹스를 부 어 하 고 며칠 (그림 1A)에 대 한 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표지 슬라이드와 침대 고정 간의 준비<ol>
<li>금속 프레임에서 실리콘 접착제를 사용 하 여 덮개 유리를 첨부 합니다. 1 일 (그림 1B)에 대 한 건조 하자.</li>
		<li>효과적으로 물 침수 렌즈에 대 한 증류수 보전, 반영구적 물 차단 구조는 필수적 이다. 1 m m 실리콘 접착제를 반올림 하 고 밤새 그것을 강화.</li>
		<li>경화 에이전트 및 기본 고무를 혼합 하 고에 부 어 그것은 높이 약 8-10 m m. 수행 6 잘 플레이트 강화 과정 1.1.2-1.1.4에 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. LPS의 준비
<ol><li>살 균 1 × 인산 염 버퍼 식 염 수 희석 살 모 넬 라 enterica serotype enteritidis에서 LPS 분말 (PBS)를 준비 합니다. (1 × PBS: 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4).</li>
	<li>미리 37 ° C에 물 목욕에 PBS가 열 하 고 신중 하 게 LPS 분말 병 (25 mg)를 엽니다.</li>
	<li>피펫으로 원조를 사용 하 여, LPS 분말 병에 무 균 PBS (5 mL)을 부 어 부드럽게 저 어 하거나 재고 솔루션을 준비 하는 솔루션을 일시 중단 합니다. 참고: LPS 분말 액 화 후 가혹한 vortexing 거품을 일으킬 수 있습니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots를 만들 때 손실을 최소화 하기 위해 거품을 만드는 하지 마십시오.</li>
	<li>−20 ° C, 재고 LPS 솔루션을 저장 하 고 주입을 위해 1 mg/mL LPS 솔루션으로 그것을 희석.</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여 비 취 마우스의 복 막에 1 mg/mL LPS 솔루션 (20 mg/kg)를 삽입할. 제어 동물에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 주입.</li>
	<li>충분 한 염증 반응에 대 한 2 시간을 기다립니다.</li>
</ol>3. 혈관 얼룩 텍사스 레드 Dextran의 준비
<ol><li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브 및 살 균 PBS의 10 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>텍사스 레드 Dextran 분말 (25 밀리 그램) 3 ml PBS의 묽 게 하십시오와 잘 섞는다. 빈 15 mL 원뿔 튜브에 혼합물을 전송.</li>
	<li>Dextran 혼합물 (3 mL)를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 PBS (7 mL)를 전송 합니다.</li>
	<li>10 mL 주사기의 끝에 0.45 μ m 주사기 필터를 연결 합니다. 필터 주사기는 바늘을 교체 해야 합니다.</li>
	<li>Dextran 혼합물 (10 mL) 필터링. 흘리 고 피하기 위해 주사기를 균등 하 게 누르십시오.</li>
	<li>빛 차단 1.5 mL 튜브에 2.5 mg/mL dextran 솔루션의 500 µ L를 분배 하 고 −20 ° c.에 그것을 저장합니다 일단 해 동, 4 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
</ol>4. 수술 과정
<ol><li>치료 수술 테이블 및 수술 하기 전에 70% 알코올을 사용 하 여 모든 악기. 다음, 간 수술 도구를 설정 하 고 (그림 2A, B) 37 ° C에 난방 격판덮개를 조정 합니다.</li>
	<li>마 취에 대 한 intraperitoneally에 30 mg/kg tiletamine/zolazepam와 xylazine의 10 mg/kg는 쥐 주사. 이러한 솔루션은 혼합 고 동시 주입에 대 한 PBS에 희석 수 있습니다. 마우스의 발가락을 부드럽게 눌러 anesthetization를 확인 합니다.  아니 반사 때 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>마우스의 망막의 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고의 작은 금액을 적용 합니다.</li>
	<li>제 모 크림 (그림 2C)를 사용 하 여 복 부 주변 몸 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>꼬리 정 맥 또는 인슐린 주사기 (그림 2D)를 사용 하 여 역 궤도 주입을 통해 텍사스 레드 Dextran 솔루션 (2.5 mg/mL의 농도)의 200 µ L을 주입.</li>
	<li>표시와 함께 바로 subcostal 영역을 표시 합니다. 라인은 갈비뼈의 끝에 칼 과정에서 그려야 한다. 집게와가 위 (그림 2E, F) 표 피를 잘라.</li>
	<li>마이크로-가 위, 집게를 사용 하 여 복 부 구멍 열고 간 신중 하 게 노출 합니다. 왼쪽된 측면 엽 면봉 (그림 2G, H)를 사용 하 여 밖으로 굴러 될 해야 합니다.</li>
	<li>간 건조를 방지 하기 위해 복 부 구멍에 살 균 PBS의 500 µ L를 붓는 다.</li>
	<li>사용자 정의 설계 실에서 오른쪽 decubitus 위치에 마우스를 놓고 실리콘 침대에 조직 접착제의 작은 금액을 적용 합니다. 그럼, 신중 하 게 간 면봉 (그림 2I)를 사용 하 여 연결 합니다. 참고: 간 조직 매우 어렵다면 있기 때문에, 기계적으로 당기지 마십시오 간 밖으로. 부드럽게 롤 그것 밖으로 면봉으로.</li>
	<li>몇 초 후, 젖은 간 밖으로 건조 하지 않도록 하는 살 균 PBS의 500 µ L로 다시 간. 간장에 금속 프레임을 놓고 너트 (그림 2J)와 그것을 단단히 고정 합니다.</li>
</ol>5. intravital 영상 2 광자 현미경으로 간
<ol><li>880 nm, 그리고 녹색, 세트에 선 소프트웨어 (Carl Zeiss) 레이저에 설정, 파장을 설정 실행 및 빨간색 채널. 레이저 파워 형광 강도 (그림 3A)에 따라 조정 합니다. 배기 필터 정보는 다음과 같습니다: 그린/Alexa488, 500-550 nm와 적색/알 렉 사 555, 575-610 nm.</li>
	<li>이미징 단계에 챔버를 놓고 물 침수 렌즈 커버 유리에 가까운 X 20를 배치 합니다.</li>
	<li>실리콘 고무 히터의 온도 (그림 3B)를 유지 하기 위해 마우스 몸 아래의 수정.</li>
	<li>금속 프레임에 증류수 500 µ L를 삭제 하 고 (그림 3C) 간 가까운 대물 렌즈를 당겨.</li>
	<li>초점을 조정 하 고 깊이 이미지 영역의 시간 확인.</li>
	<li>행위 이미지입니다.</li>
	<li>장기적인 이미징, 이미징 동안 각 시간 tiletamine/zolazepam 및 xylazine 혼합물의 절반 복용량 주입. 이 단계 동안 37 ° C에서 쥐의 체온을 유지 필수적 이다. 항상 계속 눈에 마우스, 모든 마우스에서 anesthetization 시간 차이가 있기 때문. 참고:이 방법은 아니다 복구에 대 한 적절 한 수술 및 이미징 후. 우리는 윤리적으로 수술 후 즉시 마우스를 희생.</li>
	<li>안정적인 anesthetization에 대 일 분 마다 페달 반사를 확인 하십시오.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>데이터 분석 소프트웨어 Volocity를 연 다음 소프트웨어 라이브러리에서 원시 데이터를 가져올 합니다.</li>
	<li>상황에 맞게 하 고 스냅숏을 이미지에서 노이즈를 제거 합니다. 참고: 부드러운 이미지를 얻기 위해 '벌금' 또는 '중간' 필터를 사용 합니다. 또한, '콘트라스트 향상' 기능을 사용 하 여 어둡거나 흐린 이미지를 선명 하 게.</li>
	<li>스냅숏 이미지를 JPEG 또는 TIFF 파일 및 AVI 파일 영화에 대 한 수출을 100% 편집된 항목에 맞게.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuels,+hormones,+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat.">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li><li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection:+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics.">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303 (2015).</li><li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment.">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

간은 많은 그룹3,10, 그것의 기능의 중요성 때문에 의해 적극적으로 연구 되었습니다. 예를 들어, Heymann 외. agarose를 사용 하 여 섬세 한 방법을 제안 했다. 이 메서드는 매우 정확 하 게 발견 되었다, agarose 설정 시간이 걸립니다. 그러나, 우리의 방법론으로 모든 절차 수 실행 될 다른 혼동 요인을 최소화 하는 30 분 이내. 하트 비트 비디오를 방해 할 수 있?...

간은 포유류; 주요 대사 기관 그것은 에너지, 호르몬, 및 해독1에 대 한 컨트롤 타워 역할을 합니다. 그 중요성으로 인해 연구팀은 염증 동안에 변화를 명료 하 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 실시 했습니다. Intravital 현미경 검사 법은 간2 에서 라이브 이미지를 캡처하는 데 사용 되었습니다. 실제로, 다양 한 간 이미징 방법 되었습니다 도입2,,34,,56. 그러나, 더 단순화 된 외과 접근을 개발 하 고 대상 기관 및 면역 세포의 안정화를 달성, 우리는 intravital 이미징에 대 한 그들의 노력을 최소화 하기 위해 연구원 안내 하는 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.
이 연구에서 우리는 안정적이 고 새로운 이미징 챔버 및 출혈 및 가능한 감염을 최소화 하기 위해 사용 될 수 있는 수술 기법 도입. 우리는 간 이상 2 시간에 대 한 온전 하 게 남아 확인 했다. 이 방법으로, 우리는 성공적으로 LCMs7 및 부패 시키는 조건 하에서 호 중구의 형태학 식별. 이 방법에 대 한 응답에서에 면역 세포의 급성 반응을 관찰 하 사용 될 수 있기 때문에이 방법은 수술 중 떨림과 예기치 않은 염증 등 물리적 및 생물학적 혼동 요인 최소화, 기대 시 약 같은 LPS.

<table><tbody><tr><td>Custom designed chamber</td><td>Live Cell Instruments</td><td></td><td>Custom-designed size</td></tr><tr><td>Metal cover slide</td><td>Live Cell Instruments</td><td></td><td>Custom-designed size</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#72204-03</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask</td><td>DURAN</td><td>21 216 36</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate (Flat type)</td><td>HYUNDAI Micro Co.</td><td>H31006</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>ADARSH</td><td>55204</td><td></td></tr><tr><td>High Q BOND SE 5 mL</td><td>BJM LAB</td><td></td><td>To make semi-permanent dam</td></tr><tr><td>Flexible Silicone Rubber Heaters</td><td>Omega</td><td>SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800</td><td></td></tr><tr><td>DC power supply</td><td>Toyotech</td><td>DP30-03A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td></td><td></td><td>Home-made</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6011</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>15 mL High-clarity polypropylene&lt;br/&gt; conical tube</td><td>FALCON</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m filter (Minisart Syringe Filter)</td><td>Sartorius</td><td>16555k</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Micro Tube, Amber</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-X</td><td>For light-blocking</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S01</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S03</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Korea Vaccine</td><td>KV-S10</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mL insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>324900</td><td></td></tr><tr><td>Hair removal cream 100 mL</td><td>Body natur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>ABDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 5 mL</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun 10 mL</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating plate</td><td>Live Cell Instruments</td><td>PH-S-10</td><td>Custom-designed size</td></tr><tr><td>DC controller</td><td>Live Cell Instruments</td><td>CU-301</td><td></td></tr><tr><td>Microdessection Scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-5418</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Vet bond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ZEN software (Black Edition)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Program for LSM 7 MP</td></tr><tr><td>LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Analysis program</td></tr></tbody></table>

two-photon intravital imaging of leukocytes during the immune response in lipopolysaccharide-treated mouse liver

패 혈 증은 조직 기관 실패를 일으킬 수 있는 심각한 감염의 유형을 손상. 패 혈 증과 관련 된 사망률과 병 적 속도 매우 높은, 아니 직접 치료 이나 기관 관련 메커니즘을 실시간으로 자세히 검사 합니다. 간 독 소 및 인체에 감염을 관리 하는 핵심 기관 이다. 여기, 우리 면역 세포, 호 중구 등 간 capsular 세포 (LCMs)의 운동 성을 추적 endotoxemia의 유도 후 마우스 간 intravital 이미징 수행 목적입니다. 따라서, 우리는 최소 침 습 수술으로 간의 노출에 대 한 새로운 수술 방법 설계 되었습니다. 마우스 intraperitoneally lipopolysaccharide (LPS), 일반적인도로 주입 했다. 노출 및 LPS 처리 LysM-녹색 형광 단백질 (GFP)에 마우스 간, 우리는 그 neutrophil 발견 채용의 intravital 이미징에 대 한 우리의 새로운 외과 접근을 사용 하 여 마우스 간 그 인산 염 버퍼에 비해 증가 했다 염 분 처리 간입니다. LPS 치료 후, 호 중구 수 시간 크게 증가. 또한, 우리가 성공적으로 간 상주 대 식 세포 라는 LCMs 시각 CX3Cr1 GFP 마우스를 사용 하 여. 따라서, vivo에서면역 이동성 제어를 새로운 시 약의 효능을 조사, 운동 성 및 간에서 호 중구 및 LCMs의 형태 결정 수 기관 실패 및 조직 손상으로 인 한 치료 효과 확인 하 패 혈 증에 백혈구 활성화입니다.

간단 하 고 매우 안정적인 이미징 챔버 고안 되었다. 챔버의 하단 마우스 몸과 장기의 미 끄 러 방지 실리콘으로 덮여 있었다. 또한, 실리콘 탄성의 적절 한 금액을가지고, 때문에 그것은 커버 슬라이드 (그림 1A, C)의 압력에 의해 유도 된 예상된 피해를 막을 수 있습니다. 두 번째, 조직 안전한 접착제 (본드 수 의사)는 원 모양의 실리콘 침...

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Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K 조회수.  Yonsei University College of Medicine. 우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

생체공학

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

의학

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

<meta charset="utf8"></head><body>생쥐 폐 이식에서 세포 역학의 실시간 모니터링

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by crosstalk between donor and recipient cells. A better understanding of these processes relies on the use of preclinical animal models and is aided by an ability to study intra-graft immune cell trafficking in real-time. Intravital two-photon microscopy can be used to image tissues and organs for depths up to several hundred microns with minimal photodamage, which affords a great advantage over single-photon confocal microscopy. Selective use of transgenic mice with promoter-specific fluorescent protein expression and/or adoptive transfer of fluorescent dye-labeled cells during intravital two-photon microscopy allows for the dynamic study of single cells within their physiologic environment. Our group has developed a technique to stabilize mouse lungs, which has enabled us to image cellular dynamics in na&#239;ve lungs and orthotopically transplanted pulmonary grafts. This technique allows for detailed assessment of cellular behavior within the vasculature and in the interstitium, as well as for examination of interactions between various cell populations. This procedure can be readily learned and adapted to study immune mechanisms that regulate inflammatory and tolerogenic responses after lung transplantation. It can also be expanded to the study of other pathogenic pulmonary conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 생체 내 이미징을 통한 폐 이식 면역학의 발전

Here, we present a protocol to intravitally image the transplanted mouse left lung using two-photon microscopy. This represents a valuable tool for studying cellular dynamics and interactions in real-time following murine lung transplantation.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

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백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에