작품 (1) 유 방 암 프로젝트 장학금 (2014-2016) 유방암 재단 및 연구, 혁신 및 개발 신뢰 (RIDT) 몰타의 대학, (2)의 학부의 통해 살아 2013에 대 한 작업에 의해 자금에 의해 지원 되었다 & 수술, 몰타의 대학 및 과학 기술 융합 통해 몰타 위원회에 의해 자금 법 (3) 프로젝트:의 연구 나 기술 개발 프로그램 2016. 이 원고 출판 지원 정돈 Luminex 보조금.

이 연구에서 유 방 조직 자료의 사용에 대 한 윤리적인 승인을 얻은에서 대학 연구 윤리 위원회 (UREC) 몰타의 대학 (Ref: 22/2012).
1. 조직 준비
<ol><li>적절 한 H & E 절차14를 사용 하 여 조직 섹션 스테인드 참조를 준비 하 고 디지털 기정 동안 참조에 대 한 슬라이드를 스캔.</li>
	<li>40 ° c.에 있는 RNAse 무료 물 탕에 20 µ m 조직 섹션을 잘라는 톰을 사용 하 여 깨끗 한, RNase 소독 장비 및 재료를 사용 하 여 레이저 기정에 대 한 막 슬라이드에 섹션을 수집 합니다.</li>
	<li>하룻밤 건조 인큐베이터에서 37 ° C에서 막 슬라이드를 건조. 되며 착 시간 6 분을 증가 하 고 분자 생물학 학년 솔루션은 적절 한 H & E 절차15 를 사용 하 여 얼룩. 필요한 경우 적절 한 immunohistochemical 프로토콜16막 슬라이드 얼룩.</li>
</ol>2. 레이저 기정
<ol><li>슬라이드 한계를 설정 하 고 단계 움직임 보정.<ol>
<li>레이저 보기 막 슬라이드의 빈 영역으로 이동 합니다. 레이저는 세포 막을 통해 피어스 시작 때까지 초점 간격 (5%) 증가 레이저를 발사 하 여 레이저 초점 보정. 그리기 및 microdissect 어떤 모양 및 세부적 레이저 절 개 동안 레이저 효율을 극대화 하기 위해 레이저 초점.</li>
		<li>레이저 절 개 효율 손상 되지 지점으로 무대 이동 속도 증가. 선택한 목표 렌즈에 레이저를 보정 하 고 다시 4 X 목표를 사용 하는 경우 (1-15%에서 레이저 속도), 70-75%, 포커스와 90-100% 전원 목표를 변경 하는 경우 보정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 X 목표를 사용 하 여 스테인드 막 슬라이드를 검사 합니다.</li>
	<li>선택 하 고 서 막 슬라이드에 대 한 대상 영역을 둘러싸 자. 레이저는 42 m m2의 최소 면적을 해 부. 기록 영역 사용 될 샘플 균질 화 버퍼의 볼륨을 결정 하기 위해 해 부.</li>
	<li>모자 리프트 메커니즘을 사용 하 여 적절 한 돌출부에 연결 된 레이블이 튜브의 기관총 모자에 해 부 섹션 검색. 뚜껑에는 해 부 섹션 검색 되지 않으면, 반복 영역의 레이저 절 개 합니다.</li>
</ol>3. 조직 세포
참고: 여러 솔루션 및 자료 테이블의 자료에 언급 된 키트와 함께 제공 됩니다.
<ol><li>후 60: 1 비율에서 균질 화 솔루션 및 가수분해 K 사용 하 여 샘플 세포에 대 한 필요한 균질 화 혼합 볼륨을 준비 합니다.</li>
	<li>조직 영역, 10에 대 한 소용돌이의 각 1 m m2 에 대 한 각 관으로 솔루션을 균질의 2.4 µ L 플라스틱 최대 속도와 5에 대 한 상 온에서 원심 분리기 s 2500 x g에서 s.</li>
	<li>600 rpm에서 떨고와 함께 12-18 h 65 ° C에서 난방 블록에서 품 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 21000 x g에서 lysates 원심</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 맑은 상쾌한 발음 하 고 레이블이 신선한 관으로 분배. 이 결과의 품질을 줄일 수 있습니다 조직/막 파편을 발음 하지 마십시오.</li>
	<li>명확한 상쾌한-80 ° C 냉동 실에 저장 합니다.</li>
</ol>4. 교 잡-기반 분석 결과
<ol><li>다음과 같은 준비를 수행 합니다.<ol>
<li>전 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 시 약 병을 배치 하 여 세포 혼합물을 따뜻하게 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합.</li>
		<li>조직 homogenates, 냉동 실 온에서 해 동 하 고 최대 속도 부 화 다음에 샘플 30 분 소용돌이 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>54 ° C에서 떨고 인큐베이터를 설정 하 고 96 잘 접시의 빈 잘에서 온도 유효성 검사 키트의 프로브를 배치. 2 시간 후 디지털 온도계에 온도 확인 하 고 떨고 어떤 온도 차이 대 한 해결 하기 위해 인큐베이터의 델타 온도 설정 합니다.</li>
		<li>눈 녹은 물 및 소용돌이 프로브를 설정 하 고 10 시 차단 s, 5에 대 한 상 온에서 원심 분리기 g, 그리고 얼음에 계속 x 2500에서 s.</li>
		<li>사용 하는 동안 얼음에 가수분해 K 유리병을 유지.</li>
		<li>3 분, 또 다른 3 분 최대 속도로 다음 소용돌이 46 KHz에서 캡처 구슬 sonicate</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 약을 적절 하 게 확장 하 여 잘 당 25 µ L 작업 구슬 믹스를 준비: Nuclease 무료 물, 세포 혼합물의 16.65 µ L, 차단 시 약, 가수분해 K의 0.10 µ L, 캡처 구슬의 0.50 µ L, 프로브 세트의 2.50 µ L의 1.00 µ L의 4.25 µ L.</li>
	<li>소용돌이 작업 구슬 믹스 10에 대 한 최대 속도, s는 다음 자석 분리 판으로 25 µ L/잘 플라스틱.</li>
	<li>피 펫 25 µ L 조직 homogenate 자력 분리 96 잘 접시와 25 µ L 공란으로 3 웰 스 솔루션을 조직.</li>
	<li>투명 한 플라스틱 압력 물개를 사용 하 여 자력 분리 접시를 봉인 하 고 600 rpm에서 떨고 있는 동안 18-22 h 54 ± 1 ° C에 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>세척의 0.1 mL RNase 무료의 31.5 mL 물 혼합 하 여 24 웰 스 워시 버퍼 구성 요소 2 구성 요소 1 및 1.67 mL 버퍼 워시 버퍼 솔루션 X 1 준비.</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 제거 합니다. 50 ± 떨고 인큐베이터의 온도 설정 1 ° c.</li>
	<li>휴대용 자석 접시 세탁기에 자력 분리 접시를 탑재 하 고 장소에 잠금. 압력 인감을 제거 하 고 정착 자성 구슬에 대 일 분 기다립니다.</li>
	<li>세척 단계: 자력 분리 플레이트에 장착 플레이트 싱크 및 오 점 부드럽게 잔여 솔루션을 제거 하는 티슈 페이퍼에 반전. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 100 µ L 워시 버퍼 솔루션 X 1의 각 음에 더하고 대기 15 미 세척 접시 3 번을이 단계를 반복.</li>
	<li>각 우물에 프리 앰프 시 약의 50 µ L 플라스틱 알루미늄 플레이트 도장 접시를 봉인 하 고 실 온에서 1 분 동안 800 rpm에서 접시를 흔들어. 50 ± 1 ℃에서 1 h 동안 600 rpm에서 떨고 품 어.</li>
	<li>4.9 (세척 단계) 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>각 음을 앰프 시 약의 50 µ L 플라스틱 알루미늄 플레이트 도장 접시를 봉인 하 고 단계 4.10에서 접시를 흔들어.</li>
	<li>4.9 (세척 단계) 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>소용돌이 10 라벨 프로브 최대 속도에서 s. 각 우물에 레이블 프로브의 50 µ L를 추가 합니다. 봉인 하 고 흔들 플레이트 (단계 4.10).</li>
	<li>단계 4.9 (세척 단계)를 반복 합니다.</li>
	<li>소용돌이 Streptavidin phycoerythrin (SAPE) 10에 대 한 최대 속도에서 s. 각 우물에 SAPE의 50 µ L를 추가 합니다. 봉인 하 고 흔들 플레이트 (단계 4.10).</li>
	<li>워시 버퍼 솔루션 대신 SAPE 워시 버퍼를 사용 하 여 제외 하 고 단계 4.9 (세척 단계)를 반복 합니다.</li>
	<li>알루미늄 플레이트 도장 각 우물 및 격판덮개에 SAPE 워시 버퍼의 130 µ L를 추가 합니다. 3 분 동안 실 온에서 800 rpm에서 접시를 흔들어.</li>
	<li>마그네틱 비드 분석기 시작입니다. 제조업체의 지침에 따라 교정 및 검증 루틴을 수행 합니다.</li>
	<li>다음 매개 변수를 사용 하 여 자석 구슬 분석기에서 프로토콜 설정: 샘플 크기: 100 µ L; DD 게이트: 5000-25000; 시간 초과: 90 s; 구슬 이벤트/구슬 지역: 100; 그리고을 클릭 합니다. 패널에서 각 구슬 숫자를 선택 하 고 제조 업체에 의해 표시 된 대로 해당 대상 유전자와 구슬 영역을 정의.</li>
	<li>일괄 처리 탭에서 "생성 일괄 처리를 사용 하 여 기존 프로토콜"을 선택 하 여 새 분석을 추가 합니다. 플레이트 레이아웃 에서 우물으로 지정 하거나 알 수 없거나 빈각각 고 [ 견본 ] 패널에서 각 샘플에 대 한 레이블을 제공 합니다.</li>
	<li>96-잘 반응 판에서 알루미늄 플레이트 물개를 제거 합니다. 플레이트 트레이 꺼내기 단추를 클릭 하 여 추출, 자석 구슬 분석기에 접시를 로드 합니다. 취소를 클릭 하십시오 | 일괄 처리 실행 분석기를 시작 하입니다. 읽기 후에, 추출 하 고 96 잘 접시를 제거 합니다. 깨끗 하 고 제조업체에서 권장 하는 대로 자기 비드 분석기 종료.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>일괄 처리에서 | 결과 탭을 각각 분석 파일을 선택 하 고 to.csv 내보내기 버튼을 클릭 합니다. 오픈 the.csv 파일 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여입니다.</li>
	<li>구슬 개수를 확인 하 고 < 40 구슬/지역에 대 한 어떤 결과 든 지 생략.</li>
	<li>빈 우물의 값을 평균 하 고 표준 편차 (SD) 및 검출 한계 (LOD) (평균 빈 + (3xSD)) 대상 유전자 당. LOD 보다 들 키 지로 값을 설정 합니다. 참고: 정규화 표현식 값은 감지, 부적절 한 예제 데이터를 간주 한다. 식 값으로 20000 이상 위 감도 제한을 고려 합니다. 이 샘플의 lysates 희석 하 고 다시 분석 해야 합니다.</li>
	<li>유전자 당 원시 데이터에서 빈 평균을 뺍니다.</li>
	<li>샘플 당 선택한 정규화 유전자의 기 평균을 계산 합니다. 각각은 개별 샘플 데이터를 정상화.</li>
	<li>데이터 과학 플랫폼 또는 정의 된 알고리즘을 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.<ol>
<li>데이터 과학 플랫폼에 데이터 추가클릭 하 여 데이터를 가져옵니다. 데이터 파일 프로세스 작업 영역 으로 끌어서 연결 [속성 선택] 연산자 다음에 주 구성 요소 분석 (PCA) 연산자, 그리고 result 포트에 다음.</li>
		<li>선택 특성 연산자에서 정규화 된 유전자 데이터의 하위 집합 및 유 방 암 하위 같은 명목 변수를 선택 합니다. 재생을 클릭 하 여 프로세스를 실행 합니다. 차트 탭에는 "3D 컬러 분산형" 차트 스타일에서 및 색 필드에 명목 변수를 선택 합니다. 3 차원 플롯에 PCA 데이터 변화를 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction:+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients.">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li><li>Macabeo-Ong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+duration+of+fixation+on+quantitative+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+analyses.">Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses.</a> Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+gene+expression+in+homogenates+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).</li><li>Flagella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+branched+DNA+assay+for+parallel+quantitative+gene+expression+profiling.">A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling.</a> Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).</li><li>Goldhirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+subtypes--dealing+with+the+diversity+of+breast+cancer:+highlights+of+the+St.+Gallen+International+Expert+Consensus+on+the+Primary+Therapy+of+Early+Breast+Cancer+2011.">Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.</a> Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).</li><li>Schnitt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prognosis+of+invasive+breast+cancer:+from+morphology+to+molecular+taxonomy.">Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy.</a> Mod Pathol. 23, S60-S64 (2010).</li><li>Bae, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+in+carcinoma+cells+correlates+with+tumor+aggressiveness+and+poor+clinical+outcome+in+patients+with+invasive+breast+cancer.">Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).</li><li>Park, J., Schwarzbauer, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+risk+predictor+of+breast+cancer+based+on+intrinsic+subtypes.">Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes.</a> J Clin Oncol. 27, (2009).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+the+PAM50-based+Prosigna+Breast+Cancer+Prognostic+Gene+Signature+Assay+and+nCounter+Analysis+System+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+tumor+specimens.">Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens.</a> BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+Eosin+Staining+of+Tissue+and+Cell+Sections.">Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li><li>Lin, F., Prichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , (2011).</li><li>Grech, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Classification+of+Breast+Cancer+Patients+Using+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Derived+RNA+Samples.">Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples.</a> Journal of Molecular Biomarkers &amp; Diagnosis. 7 (S8), (2016).</li></ol>

The Invitrogen™ QuantiGene™ 플렉스 분석 결과 과학 열 피셔의 독점 이다.

멀티플렉스 bDNA 구슬 기반 분석 결과 FFPE 유방암 조직 및 정상적인 유 방 덕트에서 파생 된 저하 RNA에 유전자 발현을 계량에 최적화 되었다. 최적화 분석 결과, 유전자 정상화 luminal 및 기저 하위 8 잘 알려진 biomarkers 및 5 잠재적인 활용에 유방암 종양을 분류 하는 알고리즘을 개발 하는 관련 된. 데이터 정규화 이루어졌다 정규화 유전자의 순열을 사용 하 여. 정상화 유전자의 선택 Luminal/기초 분류자 유전자를 사용 하 여 수용 체 상태의 최고의 예측에 근거 했다. FFPE 직물에서 Luminal/기초 하위 분류 선택 정규화 유전자 베타-말라 (ACTB), Glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH)와 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) 했다.
메서드는 다른 진단에 사용 및 연구 분야 정상화 유전자 세트의 적절 한 선택에 따라 적용할 수 있습니다. 연구 분야에서이 방법의 한 가지 중요 한 응용 프로그램 아카이브 자료 잘 임상 결과와 주석에서 바이오 마커의 측정입니다. 이 신속 하 고 정확 하 게, 회고전 연구에 잠재적인 예측 마커를 확인 하 고 장기 잠재 연구 질병-무료 생존 및 전반적인 생존 데이터 기다리는 피할 수 있습니다. 현재 우리의 그룹은 데이터 정규화에 대 한 유전자를 정상화 대체 사용 하 여 새로운 알고리즘의 개발을 필요로 하는 수용 체-양성 exosomes를 검색 하는 분석 결과의 사용을 조사 하 고 있다. 액체 biopsies을 강력한 유전자 표정 분석 실험을 사용 하 여 높은 처리량 다중 분석 치료, 중 환자 관리에 대 한 적응을 허용 하 고 따라 치료 효능, 잠재적인 타락 때문에 치료에 저항 하는 수단을 제공 하 고는 전이성 종양의 용량입니다.
이 메서드는 또한 종양의 진단에 가능한 응용 프로그램의 넓은 범위를가지고 하 고 현재 진단 워크플로에 적응. 진단 분야에서이 방법의 주요 이점은 포함 한다: (1) 구현 (2) 제외 주관 및 확실치 않은 결과 이미지 기반 측정에서 발생 하는 높은 처리량 분석 실험의 여러 대상 (3) 정확한 탐지 동시에,는 정확도 강화 하 고 고도로 전문화 된 시설 및 인적 자원 필요 없음 소중한 환자 샘플, 및 (4)의 사용을 최소화. 구슬-기반 다중 분석에 필요한 재료의 낮은 입력 함께 최적화 된 샘플링 과정 수 추가 조사 종양이; 를 사용 하 여 레이저 기정을 정확 하 게 같은 환자 섹션에서 악성 조직의 여러 foci 일치 정상 조직 (그림 4) 뿐만 아니라 그들 사이 여러 유전자 발현을 비교 가능 하다. 낮은 재료 입력은 제한 된 종양 조직을 종양 생 검에서 진단 응용 프로그램에 대 한 중요 합니다. 저하 RNA 샘플에서 유전자 발현을 측정 하는 분석 결과의 용량 분석 기관 내 또는 실험실 서비스에 대 한 샘플의 쉬운 수송을 허용 한다. 또한, 전체 섹션 분석 H & E 스테인드 소재 (그림 1)를 사용 하 여 또한 이었다.
이 프로토콜의 성공을 위해 필수적입니다: (1) 보장 분석 결과 대 한 lysed 고 (2) 잘 개발 s/종양 사이트의 적절 한 샘플링 최적화 및 데이터 정규화 알고리즘, 각 유전자 식 패널 및/또는 개별 전조에 대 한 유효성 검사 또는 예측 생체입니다. 전 기술자/과학자는 샘플링을 수행의 기술 경험에 따라 다릅니다. 추가 코어는 다중 마그네틱 비드 분석 결과 (96-잘 형식)의 동일한 형태로 조직 microarray (TMA)을 준비 하는 것이 좋습니다. 이 RNA 기반 분석 결과 대 한 사용 하는 샘플의 복제본으로 종양 사이트의 아카이브를 제공 합니다. TMAs 또한 후속 연구 또는 결과의 유효성 검사에 대 한 다른 기술로 평가 될 수 있습니다. 정규화 알고리즘의 개발 조사 자료 및 정규화 유전자 정규화에 대 한 선택에 따라 달라 집니다. 정상화 유전자의 다른 패널 수준 및 샘플 분석에 표현의 다양성에 따라 선택 하 고이 다른 기원에서 암 조직, 플라즈마, 또는 순환 종양 세포에서 exosomes 사이 변화 한다. 분석 결과의 유효성 검사 샘플 처리 때문에 다양 한 준비 또한 다른 정규화 알고리즘 귀 착될 것입니다 포함 되어 있습니다.
요약 하면, bDNA 기술과 마그네틱 비드 기술 함께 사용 하 고 대상 유전자의 적절 한 패널의 선택 조직 lysates의 작은 금액에서 파생 된에 직접 유전자 발현 측정의 추가 된 이점을 제공할 것입니다. 환자 자료, microdissected, exosomes, 및 순환 종양 세포. 종양이 성분의 검출, 뿐만 아니라 패널의 적절 한 사용 파생 종양 exosomes 조기 진단 및 relapses의 조기 발견에 대 한 검색 가능성이 있다. 비드 기반 멀티 플렉스와 결합 하는 bDNA 기술을 사용 하 여 신호 증폭 임상 주석 아카이브 자료에 여러 유전자 발현을 측정 하 고이 제공 하는 리소스에 대 한 핵 산 증폭 단계에 대 한 필요가 없습니다 있기 때문에, 바이오 마커 검증입니다.

아카이브 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 자료를 사용 하 여 RNA 기반 분석 실험의 최적화는 가변성 수술 조직 처리와 포 르 말린 조직 무결성 보존1, 사용에 의해 발생 하는 RNA의 저하에 따른 도전 2. 아카이브 자료에서 정확한 유전자 표현 연구 수행의 한계를 극복 하기 위해 우리의 그룹 bDNA 멀티플렉스 마그네틱 비드 분석 결과 사용 합니다. 대상 서식 파일의 효소 증폭, 대신 bDNA 기술은 특정 프로브의 교 잡 및 기자 신호3의 증폭을 사용합니다. 캡처 및 감지 프로브의 짧은 인식 시퀀스는 대상 RNA4의 짧은 조각에 교배 하도록 설계 되었습니다. 또한,이 분석 결과에서 직접 시작 물자로 조직 homogenates 사용 하 여 이전 RNA 추출 및 정화를 요구 하는 분석 실험의 결과 RNA의 불가 피한 손실을 극복. 신호 증폭, 짧은 인식 시퀀스의 사용과 정화 단계 배제 분석 결과의 기술 변화에 감소에 기여. 기술 분석 결과 (최대 80 RNA 대상) 다중화 및 낮은 자료 입력에서 대상의 패널의 식 측정 가능성을 제공 합니다. 이 프로토콜 준비 하 고 서 레이저에 대 한 조직 샘플의 얼룩에 대해 설명 합니다. 조직학 아키텍처 정확한 선택을 제공 하 고 종양의 이미징 및의 프로 파일링을 용이 하 게 막 슬라이드에 얼룩: 악성 세포를 다른 유형의 종양 내 복제 (1) 종양 및 유 방 조직에서 일반 덕트 및 (2).
유방암의 분자 분류는 환자의 종양 3 분자 클래스, 즉, luminal, 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)를 분류 하는 분자 마커를 심문 하는 과정-풍부한, 그리고 기저 하위. HER2 농축 하위 잘 정의 되어, 낮은 또는 에스트로겐 수용 체 (ER) 황 체 호르몬 수용 체 (PgR)에 결 석과 결합 ERBB2 유전자 증폭 때문에 HER2 수용 체의 높은 표현 이다. 3 수용 체 (HER2, 응급실, PgR), 그리고 크게 3 배 부정적인 유방암 암 (TNBC) 진단 하위5,6오버랩에 대 한 일반적인 부정에는 응급실과 기저 하위 luminal 하위 일반적으로 긍정적 이다. 다른 마커는 상피와 중간 엽 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다. Fibronectin (FN1) 유 방 조직 엽 구획의 주요 구성 요소입니다. 증가 FN1 식 높은 Ki67 동반 하는 얼룩, 그리고 더 침략 적인 종양7,8 에 대 한 시그니처 이며 전이9와 관련. 흥미롭게도, FN1 mitogenic 신호 받는 사람 fibroblasts10의 활성화를 유발 하는 종양 세포에서 발생 하는 microvesicles에 발견 되었다. 따라서,와 같은 exosomes 조기 발견 또는 전이의 잠재적인 마커는 재발11microvesicles를 순환.
유 방 암 transcriptional 동등에 대 한 종양 영역 선택 recurrently macrodissection12,13에 의해 수행 되었습니다. 조직이 극복 하 고 감도 증가, 우리는 안정적으로 클래식 조직 멀티플렉스 분자 프로 파일링 방법으로 얼룩을 결합 했습니다. 원리의 증거로 두 가지 유 방 암 클론 그들의 상피 엽 서명 및 전이성 잠재력에 의해 정의 되고있다. 설명된 프로토콜의 워크플로 쉽게 현재 임상 설정 번역 하 고 선택적으로 분리 하 고 타겟 mRNA 프로 파일링을 사용 하 여 조직 하위를 특성화 하는 데 사용 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatoxylin Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS16-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Aquaeous solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT110216-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Monosan</td>
			<td>MONX10963</td>
			<td>Working dilution: 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rabbit anti-mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0354</td>
			<td>Working dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER antibody (6F11)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>VPE614</td>
			<td>Working dilution: 1/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2 antibody (CB11)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>CB11-L-CE</td>
			<td>Working dilution: 1/325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody (MIB-1)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7240</td>
			<td>Working dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin Biotin Complex kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>4x, 10x, 20x and 40x objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection membranes</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>S0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi CellCamera 1.4</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>MX4285c-ACK07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Cellcut Plus</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffuser caps</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>50210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Vortemp 56 Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>52056A-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX200 100/200</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic bead analyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermaseal RTS Sealing Film</td>
			<td>Thermaseal</td>
			<td>765246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Magnetic Plate Washer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit</td>
			<td>Affymetrix/Panomics</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (50&#181;g/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Speed Vortex</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>MSV-3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Silvercrest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASEZAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium 96-well plate seal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z721549-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Validation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidMiner Studio Community 7.1.001</td>
			<td>RapidMiner</td>
			<td></td>
			<td>Data Science Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation oven</td>
			<td>Hybaid (Thermo Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material

핵 산 저하 보관 조직, 종양이, 그리고 신선한 냉동된 조직 표본의 부족 병 리 실험실 전세계에 암 진단 서비스를 저하 수 있습니다. 유전자 증폭 및 아카이브 자료 또는 교통 연구실, 서비스를 요구 하는 자료를 사용 하 여 테스트 진단 식 보다 강력 하 고 정확한 시험 현재 임상을 적응 해야 합니다. 우리의 연구 팀 Invitrogen™ QuantiGene™ 플렉스 (열 피셔 과학) Luminex xMAP® 자석 구슬에 분기 DNA (bDNA) 기술을 사용 하 여 아카이브 자료에서 RNA를 계량 분석 결과 사용 하 여를 최적화 합니다. 이 원고에 설명 된 유전자 표정 분석 결과 정확 하 게 다른 분자 하위, 이미징 기술에 내재 된 해석의 주관 생략으로 유방암을 분류할 수는 소설, 빠르고 다중 방법입니다. 또한, 필요한 재료의 낮은 입력으로 인해 다른 유형의 종양 사용 되며 레이저 microdissected 수 하 고 오신 (H & E) 스테인드 섹션 키를 누릅니다. 이 방법은 더 나은 환자 관리 및 질병 모니터링 허용 액체 biopsies에 종양 분류 진단 잠재력 및 생체의 측정을 포함 하는 가능한 응용 프로그램의 넓은 범위를 하고있다. 아카이브 자료에 생체의 양적 측정 회고전 연구 잠재적인 biomarkers 및 그들의 임상 결과 확인할 수 있는 임상 주석 소재의 라이브러리에 액세스할 수 있는 종양학 연구에 유용 또한, 상관 관계입니다.

설명된 방법 H & E (그림 1) 스테인드 40 증명서의 동시 측정을 위해 적용 된, microdissected (그림 2) 매우 저하 FFPE 소재. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 보여 수용 체 상태 (그림 3A), luminal 및 기초 분자 하위17에 종양의 분류 및 엽 마커의 FN1, 차동 식의 정확한 특성화 종양을 비교할 때 그리고 일치 제어 조직 (그림 3B), 다양 한 수용 체 양수와 음수 하위에서.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> 그림 1: H & E를 사용 하 여 유전자 발현 자료 스테인드. 식 프로필 간의 상관 관계가 얼룩진된 종양 섹션에 비해 흠 없는 종양 섹션에서 파생 된. [피어슨 상관 관계 p-값 = 5.34E-26]. 허가17재현. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> 그림 2: FFPE 직물의 레이저 기정. (A) H & E 스테인드 슬라이드; (B) Immunohistochemical 응급실 식; 얼룩 (C) HER2 immunohistochemical 얼룩이 지기; (D) 흠 없는 20 µ m 레이저 서 막 슬라이드에 섹션. 노란색 화살표는 명확 하 게 인해 얼룩이 지기의 부족으로 구분 하지는 침략 적인 종양의 영역을 나타냅니다. (E) A 20 µ m 섹션 관심 분야의 더 나은 묘사를 위한 H & E와 스테인드. 흰색 화살표는 빨간색 화살표 해 부 동안 레이저 초점을 표시 하는 동안 레이저 절 개 흔적을 나타냅니다. 모든 삽화는 10 배 확대에 점령 했다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> 그림 3: (A) 수용 체 상태 및 (B) 엽 마커 FN1, 유 방 종양에 비해 표현의 일치 정상. 고전적인 진단 유 방 암 하위 immunohistochemistry 및 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 HER2 애매 immunohistochemical 얼룩에 대 한 진단 결과 따라 정의 됩니다. (A) HER2과 응급실, (B) FN1 교 잡 기반 분석 결과 의해 측정의 표준화 된 표현은 HER2 긍정적인, 긍정적인, 응급실 그리고 환자에 비해 TNBC 경우 일치 정상 유 방 조직에에서 나와 있습니다. Kruskal 월리스 테스트 통계 (K-W χ2) 보여주는 HER2의 식을 크게 (p < 0.05) 및 크게 TNBC 일대에 HER2 긍정적인 일대에 일치 정상 조직의 반대로 종양 조직에 더 높은. 어 식 어 긍정에 TNBC 동료 일치 정상 반대로 종양 조직에 크게 높은 것으로 찾을 수 없습니다. FN1은 HER2 및 응급실 긍정적인 하위에 종양 조직에서 상당히 높은 이며 또한 TNBC 일대에 종양 조직에 크게 상승 되 고 향해 추세를 보여줍니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> 그림 4: 사례 연구: 종양이. 형태학 상으로 뚜렷한 종양 microdissected 그리고 다른 샘플으로 취급. (A) 마스터 H & E 섹션의 스캔. (B, C) 10 배 및 40 배 확대, 각각 식별 각 종양 형태에 대 한. (D) Immunohistochemical 응급실에 대 한 10 배 확대에 얼룩. (E) Immunohistochemical Ki67에 대 한 종양 1에서에서 높은 mitotic 활동을 보여 주는 10 배 확대에 얼룩. (F) 식 수준 ESR1 유전자 immunohistochemical 결과에서 예상 대로 상대적으로 높고 동등한 식 종양 사이 보여주는 각 종양에 대 한 정규화 된. (G) 식 수준의 FN1, 엽 마커 증가 FN1 식 높은 Ki67를 동반 정규화 더 침략 적인 종양에 대 한 서명을 보여주는 얼룩. 역은 느리게 proliferating 종양 낮은 악성 잠재력 감소 FN1 식으로 표현 된 것 처럼 보인다 종양 2에서에서 관찰 됩니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

핵 산 저하 보관 조직, 종양이, 그리고 신선한 냉동된 조직 표본의 부족 병 리 실험실 전세계에 암 진단 서비스를 저하 수 있습니다. 이 원고 멀티플렉스 마그네틱 비드 분석 결과 사용 하 여 유방암을 분류 하는 마커의 패널의 최적화를 설명 합니다.

유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

optimization-multiplex-rna-based-expression-assay-using-breast-cancer

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K 조회수.  University of Malta. 핵 산 저하 보관 조직, 종양이, 그리고 신선한 냉동된 조직 표본의 부족 병 리 실험실 전세계에 암 진단 서비스를 저하 수 있습니다. 이 원고 멀티플렉스 마그네틱 비드 분석 결과 사용 하 여 유방암을 분류 하는 마커의 패널의 최적화를 설명 합니다.

비디오: Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

연구

생체공학

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect &#8220;self-fitting.&#8221; In this way, following exposure to warm saline (~60 &#186;C), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 &#186;C) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

생리 활성, PCL 기반 &quot;셀프 피팅&quot;형상 기억 폴리머 비계의 제작

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential to establish an ex vivo model that can evaluate SIM performance accurately, for developing high-performance SIMs. In our previous study, we developed a new ex vivo model that can be used to evaluate the performance of various SIMs in detail by applying constant tension to the specimen&#39;s ends. We also confirmed that the proposed new ex vivo model allows accurate submucosal elevation height (SEH) measurement under uniform conditions and detailed comparisons of the performances of various types of SIMs. Here, we describe the new ex vivo model and explain the detailed setup methodology of this model. Since all parts of the new model were easy to obtain, the setup of the new model could be completed quickly. SEH of various SIMs could be measured more accurately by using the new model. The critical factor that determines SIM performance can be identified using the new model. SIM development speed will drastically increase after the factor has been identified.

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

We developed a new ex vivo model that applies constant tension to the porcine gastric specimen. This development made it possible to evaluate the performance (the height and duration of the submucosal elevation) of various SIMs accurately.&#160; The detailed setup methodology of this new model is explained.

내 시경 Submucosal 주입 재료 성능 평가 대 한 새로운 Ex Vivo 모델

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system has facilitated advanced genetic modification of Saccharomyces cerevisiae, a model organism and workhorse in industrial biotechnology. CRISPR-associated protein 12a (Cas12a), an RNA-guided endonuclease with features distinguishable from Cas9 is applied in this work, further extending the molecular toolbox for genome editing purposes. A benefit of the CRISPR/Cas12a system is that it can be used in multiplex genome editing with multiple guide RNAs expressed from a single transcriptional unit (single CRISPR RNA (crRNA) array). We present a protocol for multiplex integration of multiple heterologous genes into independent loci of the S. cerevisiae genome using the CRISPR/Cas12a system with multiple crRNAs expressed from a single crRNA array construct. The proposed method exploits the ability of S. cerevisiae to perform in vivo recombination of DNA fragments to assemble the single crRNA array into a plasmid that can be used for transformant selection, as well as the assembly of donor DNA sequences that integrate into the genome at intended positions. Cas12a is pre-expressed constitutively, facilitating cleavage of the S.&#160;cerevisiae genome at the intended positions upon expression of the single crRNA array. The protocol includes the design and construction of a single crRNA array and donor DNA expression cassettes, and exploits an integration approach making use of unique 50-bp DNA connectors sequences and separate integration flank DNA sequences, which simplifies experimental design through standardization and modularization and extends the range of applications. Finally, we demonstrate a straightforward technique for creating yeast pixel art with an acoustic liquid handler using differently colored carotenoid producing yeast strains that were constructed.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

The CRISPR/Cas12a system in combination with a single crRNA array enables efficient multiplex editing of the S.&#160;cerevisiae genome at multiple loci simultaneously. This is demonstrated by constructing carotenoid producing yeast strains which are subsequently used to create yeast pixel art.

CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...