이 연구는 망막 퇴행 성 질병 기초 싸우는 장 님에 대 한 방지 실명, 뉴욕, www.rpbusa.org, 및 더 큰 뉴욕 센터 연구에 의해 지원 됩니다 www.blindness.org. 저자는 Luanna 바르 톨 로메 오, 박사,이 원고에의 그녀의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다.

다음 프로토콜은 헬싱키의 선언 및 예일 대학 인간 연구 윤리 위원회 지침의 신조를 준수에서 수행 됩니다.
1. 인간 기증자 눈 소싱
<ol><li>국가 질병 연구 교환 (NDRI, 필라델피아, 펜 실바 니 아)에서 인간 기증자 글로브를 얻습니다. 프로젝트에 따라 각 실험 그룹 기증자 눈의 이상 3 쌍을 준비 합니다.</li>
	<li>10 h 이내 기증자 눈 및 48 h 사후내 배 enucleate. 그런 다음 눈 살 균 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) 문화 매체 얼음에 있는 실험실을 전송 합니다. 이전 보고 연구 기증자 눈 수확 및 생물 학적 기능 및 Bruch의 막25,,2629의 활동이 패션 보존에 이송 증명 하고있다.</li>
</ol>2. 인간의 Bruch 막의 수확 Explants
<ol><li>1.5 x 1.5 인치 거 즈에 각 눈 적셔 100mm 문화 접시에 후부는 limbus sclera 3mm 통해 절 개를 만들기 위해 사용 잘 블레이드가 위 이산화탄소 독립적인 DMEM 미디어와 원주 어느 방향으로 확장 하는 장소.</li>
	<li>확인 또는 참나무에 전체 두께 원주 절 개 (유리를 관통) 1mm 후부. 제거 하 고 이전 세그먼트 (각 막, 렌즈, 및 홍 채), 유리 체 및 망막을 삭제.</li>
	<li>미세 수술가 위 공 막 엔, 맥락 막, 사이 4 개의 방사형 절 개를 사용 하 여 하 고을 피하기 위해 복잡 한 맥락 막/Bruch 막 끊어지고 돌보는 동안 시 신경에 주변에서 공 막 엔 껍질.</li>
	<li>다음, ora 참나무 따라 suprachoroidal 공간을 통해 완곡 한 절 개를 확인 하 고는 sclera에서 뒤로 RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한 껍질.</li>
	<li>0.02 M Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 DPBS (그림 1)에서 3 시간을 세척 하 여 다음 실 온에서 20 분 페 트리 접시에에서 수산화 암모늄을 explant 목욕 여 네이티브 RPE 세포를 제거 합니다.</li>
	<li>Unlaminated, 소수 성 65 µ m 두께 소계 막 막 직면 각 explant의 기저 lamina 레이어와 0.2 µ m 숨 구멍을 통해 이산화 탄소 자유로운 매체에 Bruch의 막 복잡 한 explant 부동.</li>
	<li>유리 microanalysis 진공 필터 홀더 시스템에 Bruch의 막 explant와 소계 막을 유리 fritted 지원에 놓습니다.</li>
	<li>미세 집게를 Bruch의 막 기저 laminin 측면을 건드리지 않도록 돌보는 테플론으로 코팅을 안 쪽에서 컬된 가장자리를 평평.</li>
	<li>Agarose DPBS (4%)의 15 mL를 열 및 다음 37 ° c 냉각 그럼는 explant 평면 유지 됩니다 보장 하기 위해 부드러운 흡입을 적용 하는 동안 안 쪽에서 Bruch의 막-맥락 막의 복잡 한에 liquidized 젤의 15 mL를 붓는 다. 2-3 분 하는 agarose를 공고히 하 고 다음 소계 막 떨어져 껍질 4 ° C에서 조직 유지.</li>
	<li>Bruch의 막 explant (응고 agarose 젤에서 직경에 있는 1.5 인치) 60 x 15 m m 폴리스 티 렌 셀 문화 접시에 (Bruch의 막 위로 향하도록)으로 늘어서 되었습니다 따뜻한 액체 agarose Bruch의 멤브레인을 해결 하기 위해 접시의 하단에 있는 장소 향하도록 explant 기저 laminin 레이어와 explant 우물의 바닥에.</li>
	<li>agarose Bruch의 막 explants 문화 접시에 안정화를 위해 상 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. Bruch의 막 문화에서 explants 커버 DPBS와 접시와 미래 사용을 위한 4 ° C에서 접시를 저장 합니다. 그림 2A 격리 Bruch 막 explants는 60 x 15 m m 문화 접시에 보여 줍니다.</li>
	<li>96 잘 접시에 원하는 문화 시스템 있으면 최대 Bruch의 막 explant (1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤) laminin 사이드와 평면 테 플 론 시트에 놓습니다.</li>
	<li>5 또는 6, 인하는 판형을 사용 하 여 복잡 한 Bruch의 막에서 6 mm 원형 버튼 explant 고 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 각각 4 %agarose 장소. agarose 각 우물의 바닥에 Bruch의 막 explants (버튼)를 해결 하기 위해 실 온에서 2-3 분 안에 응고 됩니다. 참고: 그림 2B 는 96 잘 접시 trephined Bruch 막 단추를 보여 줍니다. 일반적으로 9-11 단추 또는 explants 각 눈에서 수확 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 인간의 Bruch 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 배양 Explants
<ol><li>기증자 눈을 접수 한 후, 청소와 DPBS extraocular 조직. 완곡 한 절 개를 아이리스 sclera 아래 5mm subretinal 공간에 포인트 (동위 플) 터치를 확인 합니다. 이전 세그먼트, 유리 체 및 망막을 삭제 합니다.</li>
	<li>Bruch의 막과 차가운 DPBS RPE 시트 포함 아이피 워시. 각 눈 샘플 10 분 보다는 더 이상에 대 한 0.25 %trypsin 5 mL와 RPE 세포 분열 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 50 mL 튜브에 37 ° C에서 예 열 된 DMEM 완전 한 매체의 25 mL로 trypsin 반응을 끄다.</li>
	<li>24 ° C에서 10 분 동안 200 × g에서 세포를 원심과 DMEM 완전 한 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (15 %FBS).</li>
	<li>셀을 계산 하 고 각 다양 한 세 Bruch 막 explants (버튼) 혈 청 무료 최소 필수 미디어 (MEM)의 200 µ L에서 96 잘 접시에 항생제를 포함의 기저 lamina 에 15000 가능한 RPE 세포 씨앗 (100 IU/mL 페니실린 G, 100 mg / mL 스, 5 mg/mL gentamicin, 그리고 2.5 mg/mL 암포 B). 가정 셀 직경 20 µ m,이 밀도에서 도금의 도금 면적의 약 15%를 커버 하는 RPE 세포 수 있습니다.</li>
	<li>그것에 의하여 셀 밀도 수 있습니다 다음까지 증가 시킬 stepwise 셀 동작에 각 매개 변수의 영향에 따라 100% 합류 하는 버튼에 셀 접시</li>
	<li>37 ° c.에 95% air/5% CO2 의 습도 분위기에서 24 h explant 연결할 셀 허용 부드럽게 따뜻한 완벽 한 DMEM과 매체를 변경 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

작가의 아무도 어떤 상업적인 공개 선언 하 있다.

세 인간 Bruch 막 (기질) AMD의 질병의 진행에 기여 하 고 따라서이 변경 된 매트릭스 RPE 세포 역 기능에 기여 하는 방법을 이해할 필요가 있다. AMD에서 연령과 관련 된 변화를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, ex vivo 모델 시스템 질병의 효과 모방 하는 이상 이해 하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 원고에 설명 된 방법론 일관 Bruch의 막 explants 및 문화 RPE 세포 주, 불멸 하 게, 또는 줄기 세포 유래 RPE 세포 라인을 포함 하 여 인간을 사용할 수 있습니다.
앞에서 설명 했 듯이, 인간의 Bruch 막 explants는 NDRI에서 공급 됩니다. 프로토콜 허용 되 기증자 눈에 대 한 설정 기준을 지정 NDRI로 설치 된다. 예를 들어 기증자도 없고 알려진된 망막 눈 질병, 눈/글로브가 죽음 후에 10 h 이내 검색 있고 글로브 (얼음에 숙박 패키지 배달)을 통해 죽음 후 48 h 이내 실험실에 도착. 적절 한 나이 범위와 연구, 예의 통계 분석에 필요한 눈의 수를 지정., 20-49 세 50-89 년의 세 사이의 기증자 로부터 5 글로브 쌍 사이 기증자에서 글로브의 5 쌍.
눈 글로브의 가용성, 일반적으로 평균 10 쌍 글로브 사용할 수의 매달 마다 다릅니다. 기본, 취소 확인 된 기증자 정보 눈 패키지 도착: 나이, 인종, 죽음, 죽음의 원인의 때, 과거의 병력 (질병 목록 또는 comorbidities) 간략 한.
가장 중요 한 것은, 인간의 Bruch 막 explants 수확 눈의 유리 체, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 한의 격리 수 있도록 앞쪽 세그먼트의 제거를 해야 합니다. 일단 Bruch의 막 분리, RPE 세포 다양 한 농도에서 acellular explants에 시드 고 다운스트림 실험에 대 한 양식 수 있습니다. 여기에 설명 된 대로 중요, 되도록 laminal 표면 이다 연결-최대 하지 기계적 손상을 방지 하려면 표면 감동 하는 동안 격리 Bruch 막의 방향에 주의 기울이고 준비 및 절차 처리는 기질 표면 구조입니다.
또한 주목 해야 한다 Bruch의 막 explant 시스템을 사용 하는 경우는 개별 기증자 게놈 배경 등 다운스트림 실험의 결과, Bruch의 막의 나이 또는 Bruch의의 사후 시간에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 변수 막, 그리고 Bruch의 막, 즉의 위치., 중앙 또는 주변 Bruch의 막 explants의 부분. 다른 인체 조직 연구와 마찬가지로 하나 필요한 통계적 인 힘을 일치 하는 기증자 눈 나이 적절 한 경우 적절 한 기증자 눈 샘플 번호를 모집 합니다. 안구 은행에서 눈을 수락에 대 한 엄격한 기준을 설정 하는 것은 중요 한 매개 변수입니다. 눈을 10 h 사후 enucleated는 그리고 Bruch의 막 준비 죽음 후 24-48 시간 이내에 수확 수 있습니다 허용 합니다. 시 신경 사이트 방향에 대 한 표식으로 사용할 수 있습니다와 같은 위치를 사용 하 여 실험 및 연구 그룹을 제어. 이러한 조치를 취 함으로써 한 실험적인 변화를 최소화할 수 있습니다.
요약 하자면, RPE Bruch 막 맥락 막 복잡 하 고 연령과 질병에 의해 영향의 이해가 AMD의는 이상에 그것의 기여를 이해 하는 데 중요 합니다. Ex vivo 기술을 사용 하는 모델 시스템 인간 직물을 사용 하 여 이러한 효과 조사 하기 위해 귀중 한 도구입니다. 여기는 인간 기증자 explants 세 Bruch 막의 관련 전 비보 모델로 사용 하는 방법에 설명 합니다. 이 기술은 구조 매트릭스 내에서 변경 하는 방법을 조사 하는 연구 도구 오버레이 RPE에 영향을 미칠 수 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 멤브레인을 사용 하 수 있도록 첨부 파일, 확산, 그리고 유전자 식25 셀 동작 , 27. 비슷한 ex vivo 모델 시스템의 성공적인 개발 AMD의 우리의 이해를 심화 하 고 새로운 치료 옵션의 개발을 촉진.

나이 관련 구조 변경 인간의 Bruch 막, nitrosative 및 산화 스트레스 등 많은 요인에 의해 발생에 미치는 망막 안료 상피 (RPE) 세포에 기여 하 고 기능에 여러 해로운 효과 연령 관련 황 반 변성 (AMD)1,2,3,,45,6,7,8,9의 병 리 . 고급 위축 AMD 또는 지리적 위축에 대 한 세포 대체 요법을 고려할 때 치료 RPE 세포 위축의 침대에 세포의 이식이 필요 합니다. 인간의 Bruch 막 내에서 나이 관련 변경 부정적인 기질6,9,,1011 에 피해를 주어 이식된 RPE 세포 이식의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch의 막 생물학과 매트릭스 내에서 구조를 변경 하는 방법을 AMD에 진행에 기여 하는 연구 인간 질병 병 리를 이해 하는 데 필수적 이다. 따라서, 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 수확 전 비보 를 설명 하는 프로토콜을 개발 하는 눈 나이 관련 분야에서 수 사관에 대 한 중요 한 필요가 있다.
역사적으로, 그것은 지리적 위축 등 동물23세 인간의 Bruch의 멤브레인 모델 나이 관련 무질서에 어렵게 되었습니다. 이 이러한은 설치류 및 질병 모델링, 뿐만 아니라 대부분 척추24에서 망막의 부족을 위해 자주 사용 하는 다른 종에 비해 인간의 장 수를 포함 한 여러 요소에서 발생 합니다. 여기에 설명 된 방법의 장점은 셀 세 또는 병에 걸린 개인의 게시물 부검 눈에서 추출한 Bruch의 막에 직접 테스트할 수 있습니다. 이 글의 전반적인 목표 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 ex vivo 모델에 대 한 상세한 방법론을 제공 하는, 인간의 Bruch의 격리를 포함 하 여 인간 기증자에서 막 explants 및 RPE의 시드 셀에 대 한 다운스트림 실험입니다. 이 모델 기질 손상 RPE 세포 기능과 병 리20,25,26,,2728에 기여를 조사 관련 모델 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Human donor globes</td><td>National Disease Research Interchange, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Carbon-dioxide independent media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>60-mm polystyrene petri dish</td><td>Corning Inc.</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic 65 &amp;micro;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &amp;micro;m pores</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10mm culture dish</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential media (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

비타민 및 항 산화 의학 눈 질병 연구에 의해 권장, "건조" 또는 위축 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 경우 90%를 나타내는 대 한 더 효과적인 치료가입니다. 치료는 느리게 하거나 지리적 위축 (GA)의 개발을 지체 필요 하 고이 과정의 일부인 Bruch의 막 병 리를 이해. 인간의 Bruch 막 변경 세포 망막 안료 상피 (RPE)의 손상에 기여 함으로써 AMD의 진행을 앞. AMD를 공부 하는 충분 한 동물 모델의 부족을 감안할 때, 세 인간의 Bruch 막의 ex vivo 모델 역할 RPE 세포에서의 동작을 연구 하는 유용한 도구 불후 및 RPE 라인으로 1 차 셀 라인 유도 만능 줄기에서 파생 된 셀 (Ipsc)입니다. 여기, 우리 인간 기증자, 첨부 파일, apoptosis, 확산, 포토 리셉터 외부 phagocytize 수 등에서 수확된 인간의 Bruch 막 explants에 시드 RPE 세포 행동의 효과 확인할 수 있도록 상세한 방법 제시 세그먼트, 극성, 및 유전자 발현의 설립. 이 분석 결과 세/손상 세포 외 기질에 시드 때 RPE 세포의 기능적 특성을 평가 하기 위해 세 Bruch 막의 비보 전 모델을 제공 합니다.

이 프로토콜 제대로 수행 되 면 하나 극성 및 외부 혈액 망막 방 벽의 설립, 성장 인자, cytokines의 편광된 분 비에 의해 RPE 세포 기능에 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 확인할 수 있습니다. 그리고 포토 리셉터 막대 외부 세그먼트의 식 균 작용입니다.
우리 세 인간의 Bruch 막에 질병 표현 형을 설명 하는 데이터를 생성 했습니다. 예를 들어 인간의 Bruch 막 explants 감소 RPE 세포 뚝 (그림 3) 세에 RPE 세포 배양. 세 인간의 Bruch 막에 경작 하는 RPE 세포 감소 수 이러한 세포의 phagocytize 막대 외부 세그먼트 (선생님), RPE는 중요 한 기능 (그림 4). 또한, apoptotic 세포 확인 하 고 이전 작업26에 설명 된 대로 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 얼룩을 사용 하 여 이러한 버튼 explants에 비교 될 수 있습니다. RPE 세포 유전자 표현 프로 파일에는 세 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막의 효과 microarray 기술을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 우리 젊은 개인 (그림 5)27explants에 비해 더 오래 된 개인에서 인간의 Bruch 막에 경작 하는 경우 RPE 세포 유전자 발현 변경 설명 했다. 통계 분석을 위해 적어도 3-5 인간 기증자에서 explants는 그룹 당 사용 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> 그림 1입니다. 기증자 눈에서 인간의 Bruch 막의 절연의 도식 대표. 인간의 Bruch 막 sclera, 앞쪽 세그먼트, 망막, 유리 체, 제거 하 여 수확 하 고 네이티브 망막 안료 상피 (RPE) 세포. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> 그림 2입니다. 인간의 Bruch 막 (BM) 문화 접시에 절연. (A) 인간의 Bruch 막 explants (각 1.5 인치 직경, 응고 agarose 젤)의 회로도에 배치 60 × 15 mm 폴리스 티 렌 셀 문화 접시 (BM 보여지는) 접시의 하단에 따뜻한 액체 agarose로 가득. 몇 가지 6mm 원형 단추 (explants)에 trephined은 (B)는 인간의 Bruch 막 explant 각 유량을 다음에 배치 되었다 96 잘 접시의 치료 비 폴리스 티 렌에서 37 ° C에서 4 %agarose. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> 그림 3입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 젊고 더 오래 된 인간의 Bruch 막 (BM)에 뚝 속도. 기본 RPE 세포 인간 Bruch의 막 영에서 explants에 시드 했다 (< 50 세, n = 3) 이상 (> 70 세, n = 5) 3 주 동안 기증자 눈. 세포 부착 속도 MTT 세포 생존 능력 분석 실험에 의해 측정 되었다. 더 오래 된 인간의 Bruch 막 RPE 세포 부착 속도 24% 감소 (젊은 BM 100 8.54 + 1.44 + 이전 BM 76.65 대 남동 남동). p < 0.05, 남동 표준 오류 =.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> 그림 4입니다. 망막 안료 상피 (RPE) 셀 먹어서 인간의 Bruch 막 (BM)의 나이 의해 영향을 받습니다. 기본 RPE 세포 이전 인간 Bruch의 막 explants에 경작 했다 감소 수 막대 외부 세그먼트 (선생님) phagocytize (9.3 + 젊은 BM 873 남동, n = 25.4 + 이전 BM 608 대 5 남동, n = 5). p < 0.01, 남동 표준 오류 =.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> 그림 5입니다. 수가 망막 안료 상피 (RPE) 셀 유전자 영에 경작 하는 각 샘플에 표현 또는 이전 인간의 Bruch 막 explants. 거기에 시드 기본 RPE 세포에 표현 된 유전자의 수에 더 많은 피해를 했다 젊은 인간의 Bruch 막 대 이전 (6201 ± 388 6439 ± 80, 대 각각); 5 explants는 각 연령 그룹에 대 한 테스트 되었습니다. Cai의 모든 작가의 전체 권한 함께 제시 H 외. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

10.2K 조회수.  Yale School of Medicine. 이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

비디오: Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

연구

신경과학

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of the center&#160;of the retina, called the macula, resulting in the loss of central vision. Early AMD is characterised by the presence of small, yellowish lesions called soft drusen that can progress onto late AMD such as geographic atrophy (dry AMD) or neovascularisation (wet AMD). Although the clinical changes are well described, and the understanding of genetic influences on conferring AMD risk are getting ever more detailed, one area lacking major progress is an understanding of the biochemical consequences of genetic risk. This is partly due to difficulties in understanding the biochemistry of Bruch&#8217;s membrane, a very thin extracellular matrix that acts as a biological filter of material from the blood supply and a scaffold on which the retinal pigment epithelial (RPE) cell monolayer resides. Drusen form within Bruch&#8217;s membrane and their presence disrupts nutrient flow to the RPE cells. Only by investigating the protein composition of Bruch&#8217;s membrane, and indeed how other proteins interact with it, can researchers hope to unravel the biochemical mechanisms underpinning drusen formation, development of AMD and subsequent vision loss. This paper details methodologies for enriching either whole Bruch&#8217;s membrane, or just from the macula region, so that it can be used for downstream biochemical analysis, and provide examples of how this is already changing the understanding of Bruch&#8217;s membrane biochemistry.

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

통가 경사진 마우스 망막의 장기, 세럼 없는 재배는 그대로 망막 색소 상피와 함께 익스처스

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

의학

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

배양된 1차 쥐 RPE의 특성화 및 형태학적 역학

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

저자 스포트라이트: 망막병증 연구를 위한 성인 마우스의 원발성 망막 색소 상피 세포의 효율적인 분리

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

생물학

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

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A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

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