저자 조 및 과학적인 토론을 위한 Tessem 및 핸 콕 연구소의 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다. 저자 코코아 파생된 epicatechin 단위체 분수를 제공 하는 앤드류 Neilson, 박사 (버지니아 공대) 감사 합니다. 이 연구는 JST에 당뇨병 액션 연구 및 교육 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 세포 배양
<ol><li>문화 기능-1 파생 832/13 베타 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린-스, 10 mM HEPES, 2mm 글루타민, 1 mM 나트륨 Pyruvate, 0.05 m m 2-mercaptoethanol9,10,11 보충 RPMI 1640 ,,1213.</li>
	<li>완전 한 RPMI 1640 미디어의 8 mL을 추가 하 여 10 분 중화 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하는 0.25 %trypsin 2 개 mL를 사용 하 여 T75 플라스 크에서 832/13 셀을 제거 합니다.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 1.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.</li>
	<li>2 x 106 6에서 셀/mL의 조밀도에 접시 832/13 셀 잘 요리.</li>
	<li>호흡 실험을 시작 하기 전에 셀에서 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에서 48 h에 대 한 문화.</li>
</ol>2입니다. 고해상도 Respirometry에 대 한 셀의 준비
<ol><li>
코코아 파생된 epicatechin 단위체와 832/13 세포 치료.
	<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금 후 24 h에 대 한 832/13 셀 문화.</li>
		<li>도금, 후 미디어 24 h 변경 하 고 차량 통제 (3 정) 또는 100 nM 코코아 단위체 (3 정), 37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에는 추가적인 24 h (총 48 h)에 대 한 문화 뒤 832/13 세포 치료.</li>
		<li>낮은 포도 당 분 비 분석 결과 버퍼 (SAB) 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 x 1에 832/13 세포를 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.<ol>
<li>게 10 x SAB 33.32 g의 NaCl, KCl, KH2포4, MgSO4 의 0.7 g의 0.82 g 1.73 g H2O 500 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.</li>
			<li>만들기 1 낮은 포도 SAB SAB, 100 µ L의 45% 포도 당, 1 M HEPES, 1 mL의 2 mL x 10의 10 mL와 함께 x 0.25 M CaCl2, 35 %BSA 솔루션, NaHCO3 의 0.21 g의 0.57 mL의 H2O 100 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Curcumin와 832/13 세포 치료.
	<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금 후 48 h에 대 한 832/13 셀 문화.</li>
		<li>832/13 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 있는 셀을 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.</li>
		<li>낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 외피의 2.5 h, 후 버퍼를 발음 하 고 낮은 포도 당 SAB 차량 제어 또는 30 분 동안 40 µ M curcumin x 1에 있는 셀을 품 어. 부 화, 다음 버퍼 발음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수확 하는 고해상도 respirometry에 대 한 트립 신 셀
	<ol>
<li>낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 부 화 후 잘 당 0.25 %trypsin 250 µ L로 접시에서 셀을 제거 합니다.</li>
		<li>차량 제어 또는 15 mL 원뿔 튜브에 SAB의 4 mL와의 복합 치료 3 우물에서 트립 신에 셀 결합.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 2.3.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.</li>
		<li>낮은 포도 SAB 각 챔버에 대 한 적절 한 농도에서 3 mL을 x 1에 있는 셀의 적절 한 수를 희석. 데이터 1 x 106 셀/mL의 농도 가장 효과적인 방법을 보여 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
고해상도 respirometry에 대 한 기계적 분리 된 세포를 수확
	<ol>
<li>1 x에서 3 h 부 화 후 낮은 포도 SAB, 1 x 각 낮은 포도 당 SAB 잘하고 부드럽게 1000 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 기계적 분리와 접시에서 셀 타격의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>차량 통제로 또는 호흡에 대 한 15 mL 원뿔 튜브 3 mL SAB의 총에 대 한 관심의 복합 치료 3 우물에서 세포를 결합 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 고해상도 Respirometry
<ol><li>고해상도 respirometer의 준비입니다.
	<ol>
<li>켜고 고해상도 respirometer respirometer 분석 프로그램을 실행 하 여 바탕 화면에 연결.</li>
		<li>두 약 실 전부에서 70% 에탄올 발음 이 약 실은 45 분의 최소 70% 에탄올에 담근 다.</li>
		<li>각 단계 후 발음 70% 에탄올으로 두 번 챔버 세척.</li>
		<li>DdH2O, 각 단계 후 발음과 세 번 챔버 세척.</li>
		<li>DdH2오 챔버 plungers 린스 이 plungers와 티타늄 포트에서 잔여 에탄올을 정리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Polarographic 산소 센서의 구경 측정입니다.
	<ol>
<li>지속적으로 사용 하 여 자기 볶음 바 데이터 기록 간격 750 rpm 고 37 ° C에서 약 실에 있는 2.0에서 버퍼를 교 반 각 oxygraph 챔버에 낮은 포도 당 SAB 버퍼 x 1의 2.4 mL을 추가 F7 버튼을 탭 열기 s 분류 "시스템". Plungers를 밀어 모든 방법에서 후 렌치 폭 설정에 철회 하 고. 안정적인 산소 유량을 얻을 때까지 1 시간 최소 equilibrate 기계를 하자.</li>
		<li>37 ° C에 실험의 기간에 대 한 기계를 설정 합니다. 800 분극 전압 설정 F7 버튼을 "산소, O2"탭을 열고 2의 이득을 mV. 산소 농도 변화는 안정 되어 있는 하는 동안 적어도 30 분 동안 SAB 버퍼의 산소 농도 equilibrate (2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>산소 농도 안정화에 따라 산소 농도의 변화는 안정 산소 농도 변화의 배경 측정을 설정 하는 영역을 선택 합니다.<ol>
<li>Shift 키를 누른 다, 왼쪽 마우스를 클릭 하 고 선택된 영역에서 마우스를 드래그 하 여 영역을 선택 합니다. 두 챔버의 각각에 해당 하는 각 추적에 대 한 선택한 지역 및 변경 "r1"와 관련 된 문자를 클릭 하십시오.</li>
			<li>왼쪽 하단에 있는 "O2 교정" 상자를 두 번 클릭 하 고 스크린의 모서리를 마우스 오른쪽, r 1으로 "공기 교정"에 대 한 "선택 표시" 버튼을 클릭 고 두 약 실 전부에 대 한 "보정 하 고 클립보드에 복사"를 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>2.1.5 또는 2.2.5 832/13 베타 세포의 호흡의 평가 단계에서 준비.
	<ol>
<li>1 x 낮은 포도 당 SAB.에 각 약 실 (한 실 제어 차량 취급 셀, 복합 치료 세포 한 챔버)에 샘플의 2.4 mL 로드 기계적 분리 방식 (-20 ° C에서 측정 후 동결)를 사용 하 여 경우 BCA (Bicinchoninic 산) 분석 결과 의해 단백질 정량에 대 한 셀 샘플의 0.5 mL를 유지 합니다.<ol>
<li>모든 방법으로 플런저를 밀어 하 고 잔류 볼륨 발음. 750 rpm 및 모든 후속 단계에 대 한 37 ° C에서 실험을 통해 지속적으로 세포를 저 어. F 4를 클릭 하 여 샘플 로드 되 면 "세포"로 라벨 표시를 확인 합니다.</li>
			<li>30 분에 대 한 샘플을 측정 합니다. 신호 안정화 후 3.2.3에 설명 된 대로 낮은 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 해당 하는 산소 농도 변화의 영역을 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 주사기를 사용 하 여 포트 로드 티타늄 통해 각 챔버에 45% 살 균 포도 당 솔루션 (16.7 m m 최종 농도)의 12.5 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 치료 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "포도". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 산소 농도 변화는이 영역을 선택 합니다. 이것은 16.7 m m 포도 당 독서 하 고 물질로 조건7해당 합니다.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 5mm oligomycin (2.5 최종 농도) 각 챔버로 로딩 포트를 통해의 1 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "OligoA". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. Oligomycin A 억제 ATP synthase 이며 따라서 발생 하는 유일한 산소 유량 전자와 아닌 산화 인 산화7의 누설을 통해.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 최대 호흡 율 설정 될 때까지 1 µ L 단위로 1mm FCCP 추가 합니다. 이 최대한 uncoupled 호흡을 나타냅니다. 3-4 µ L 사이 FCCP 충분 한 (1.5-2.0 µ M 최종 농도) 기능-1 832/13 셀의 최대 uncoupled 호흡을 유도 하는 것 이다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "FCCP" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. FCCP 연결을 푸는 에이전트입니다. 이 uncoupled 호흡7을 측정할 수 있습니다.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 로드 포트를 통해 각 실에 1 µ L 5mm Antimycin A (2.5 최종 농도)를 추가 합니다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "AntiA" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. 참고: Antimycin A 시 토 크롬 C 환 원 효소, ubiquinone 산화를 억제 한다 모든 호흡을 차단. 호흡7을 완전히 막을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 베타 세포 단백질 농도 호흡 정규화에 대 한 측정.
	<ol>
<li>샘플 측정 단백질 샘플13BCA 메서드 사용 하 여 로드 시 유지의 0.5 mL를 사용 하 여.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 희석 하지 않고 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>trypsinized 셀에서 832/13 베타 세포 호흡 계산.<ol>
<li>Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 분석 결과에 mL 사용 당 셀의 수를 입력 합니다. 단위 셀/mL를 변경 세포 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경</li>
		<li>선택 하 고 O2 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.</li>
		<li>2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.</li>
		<li>Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O2 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.</li>
		<li>자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 베타 세포 호흡 계산에서 기계적으로 해리 셀.<ol>
<li>Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 BCA 분석 결과에서 단백질 계산을 입력 합니다. 밀리 그램 단위 변경, BCA 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경</li>
		<li>선택 하 고 O2 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.</li>
		<li>2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.</li>
		<li>Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O2 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.</li>
		<li>자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC2+(GLUT)+family+of+membrane+transporters.">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li><li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders.">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li><li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+cocoa+catechins+enhance+&#946;-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration.">Monomeric cocoa catechins enhance &#946;-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li><li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells.">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion.">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li><li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells:+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia.">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).</li><li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos.">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors.">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li><li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway.">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854 (2015).</li><li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation.">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).</li><li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity.">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities,+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction.">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li><li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db/db+mice.">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).</li><li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver.">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li><li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential.">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li><li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-Activated+Mitochondrial+Phospholipase+iPLAgamma+Prevents+Lipotoxic+Oxidative+Stress+in+Synergy+with+UCP2,+Amplifies+Signaling+via+G-Protein-Coupled+Receptor+GPR40,+and+Regulates+Insulin+Secretion+in+Pancreatic+beta-Cells.">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li><li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets.">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 목적은 그대로 췌 장 베타 세포에서 호흡 속도 측정에 고해상도 respirometry를 사용 하는 것입니다. 이 메서드는 증가 된 포도 당 수준으로 베타 세포 반응의 측정을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자연스럽 게 발생 단위체 epicatechin 또는 curcumin4,5에서 같이 프로토콜 또한 다양 한 화합물과 전처리에 대 한 수 있습니다. ...

췌 장 베타 세포의 주된 목적은 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 시스템 normoglycemia를 유지 하는 것입니다. 베타 세포 느낄 회람 포도 당 크게 낮은 선호도, 고용량 포도 당 운송업 자 GLUT2 때문에 생리 적 변화 (포도 당 운송업 자 2, Km 16.7 m m)1. 순환 포도 당 수준을 증가,이 높은-용량 낮은 선호도 전송 셀 내에 베타 세포내 포도 당에 있는 비례 증가 촉진 합니다. 포도 당 분해, TCA 사이클 (tricarboxylic 산 주기) 및 높은 세포질 ATP (아데노신 3 인산 염) 수준에서 발생 하는 미토 콘 드리 아 호흡 대사입니다. 높은 ATP 농도 ATP 민감한 K+ 채널, 막 도발은 결과 차단 합니다. 막 도발은 전압 Ca2 + 채널 개방 원인과 기의 후속 릴리스 바인딩된 인슐린과 립2. 베타 세포 기능 장애 제 2 형 당뇨병 (T2D), 각 인 이며, 감소 하 고 가난 하 게 통제 하는 인슐린 분 비 및 궁극적으로 베타 세포 죽음3. 유지 하거나 베타 세포 기능을 개선 하는 메커니즘 T2D에 대 한 치료로 사용 될 수 있습니다.
학문은 자연스럽 게 발생의 유익한 효과 설명 했다 췌 장 beta 세포4공장 기반 화합물. 이 화합물은 증가 베타 세포 증식, 생존, 또는 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 그들의 효과 할 수 있습니다. 예를 들어, 최근 연구는 단위체 epicatechin 미토 콘 드리 아 호흡 증가 통해 포도 당 자극 인슐린 분 비를 강화 하 고5레벨 셀룰러 ATP를 증가 증명 하고있다. 따라서, 이러한 화합물 기능 베타 셀을 어떻게 증가할 수 있는지 이해 질량 잠재적인 치료로 이러한 화합물을 활용 하는 것이 중요 하다.
세포 호흡은 여러 가지 도구를 통해 측정할 수 있습니다. 고해상도 respirometer의 사용 permeabilized 또는 그대로 셀 인구6화학 변조기의 적정에 대 한 수 있습니다. 이 도구에 따라서 다양 한 정보를 제공 하는 다양 한 농도, 다양 한 화합물의 추가 허용 합니다.
포도 당 대사 및 베타 세포 기능 사이 친밀 한 연결을 감안할 때, 세포 호흡의 측정은 중요 합니다. 세포 호흡의 측정을 수행할 수 있습니다 갖는 각 고유한 장점과 단점7,8permeabilized 또는 그대로 베타 세포를 사용 하 여. 베타 세포의 permeabilization 전자 전송 체인의 다양 한 측면을 측정 한 수, 하는 동안 그것은 beta 세포 포도 당 통풍 관, 신진 대사 호흡을 유도 하는 메커니즘에 관계 없이 이렇게 한다. 따라서, unpermeabilized 베타 세포 호흡의 사용 다양 한 포도 당 수준, 판독으로 산소 소비를 사용 하 여 베타 세포 응답을 결정 하는 매우 유용한 기술입니다.
이 기법의 목적은 그대로 기능-1에서 산소 소비량을 측정 하 832/13 베타 세포 파생입니다. 이 기술은 수 있습니다 unstimulatory 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 대 한 베타 세포의 응답 결정 물질로 포도 당 조건 (16.7 m m 포도 당) 뿐만 아니라. Unpermeabilized 셀 개별적으로 복잡 한 테스트를 허용 하지 않는 하는 동안 I, II 또는 III의 전자 수송 체인, 기술을 다루는 복잡 한 IV 억제 (Oligomycin A) 상태로 호흡 (FCCP 카보닐기 시안-측정 허용 않는다 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), 호흡 (Antimycin A) 완전히 저해. 이 연구에서는 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 뿐 아니라 그대로 unpermeabilized 췌 장 베타 세포, 호흡 측정의 효능을 보여 줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>O2k Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>Instrument for high-resolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 6 Program</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>27141-01</td>
			<td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INS-1 832/13 cell line</td>
			<td>Duke University Medical Center</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7727</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocoa epicatechin monomer</td>
			<td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>832/13 beta cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>GLL01</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7979</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anitmycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determining protein concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

고해상도 respirometry 고립 된 미토 콘 드리 아, 세포와 조직에의 산소 소비량의 측정에 대 한 수 있습니다. 베타 세포는 높은 포도 당 농도에 대 한 응답에서 인슐린 분 비를 통해 통제 혈액 포도 당 수준에 의해 신체에 중요 한 역할을 한다. 인슐린 분 비는 포도 당 대사 및 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 제어 됩니다. 따라서, 본래 베타 세포 호흡 측정 당뇨병을 위한 치료로 베타 세포 기능을 향상 시킬 수 있을 필수적 이다. 그대로 832/13 기능-1을 사용 하 여 우리 세포 호흡에 포도 당 농도 증가의 효과 측정할 수 있는 베타 세포 파생. 이 프로토콜의 효과 결정 하는 하나를 수 있도록 다양 한 화합물의 유무에서 베타 세포 호흡 측정 수 있습니다 화합물 그대로 세포 호흡에 주어진. 여기 우리가 (2.5 m m) 낮은 또는 높은 혈당 (16.7 m m) 존재에서 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 보여줍니다. 이 기술은 다른 포도 당 농도 면 전에 서 그대로 베타 세포 호흡에 다양 한 화합물의 효과 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

기능 1 832/13 베타 세포 준비 프로토콜에 설명 된 대로 수확을 다양 한 화학 개입 (그림 1A)에 따라 산소 소비에 변조를 시연할 예정 이다. 호흡 증가 16.7 mM 포도 (그림 1B)에 포도 당 농도 증가 때 관찰 됩니다. 호흡은 그대로 셀 Oligomycin a 치료는 줄어 이 호흡은 기저, nonphosphorylating 호흡기 상태로 정의 되는 누설으로 알려져 있다. 최대한 호흡 때 베타 세포 ...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds at JoVE.com

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K 조회수.  Brigham Young University. 이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

비디오: High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

연구

생물학

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em&gt; 초파리</em&gt; 난소

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터