이 작품은 관대 한 캘리포니아 대학, 리버 사이드 (UCR) 실험실 시작 기금 O.S.A, 미국 농 무부 식품과 농업 (NIFA) 해치 프로젝트 (1009509) O.S.A.에 의해 지원 되었다

1. 북 아 일 Vitripennis 식민지 양육
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	<li>여러 식민지를 설정 (~ 3-5) 버그 기숙사 장에 200-500 북 아 일 vitripennis 성인 (여자: 남자의 3:1 비율)을 배치 하 여. 참고: 버그 기숙사, 말 벌을 사용 하도 여러 개의 작은 유리 시험관 약 15-20 말 벌/유리병으로 목화와 함께 연결에서 전파 수 있습니다.<ol>
		<li>25 ± 1 ℃ 30% 상대 습도, 12시 12분 빛 어두운 주기에, 1:10 (v/v)의 작은 물방울으로 매일 그들을 먹이에 말 벌을 유지 자당/물 솔루션. 주: 말 벌 식민지 및 전파 제어 습도; 없이 실내 온도에 지휘 될 수 있다 또한 그러나, 온도 25 ° C는 배아의 발달 타이밍을 낮출 것 이다 약간 보다 낮은.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>말 벌 주사 전에 적어도 4 일 동안 친구를 허용 합니다.<ol>
		<li>처음 2 일 동안 신선한 먹이를 성관계 여성 수 1:10 (v/v)의 작은 방울으로 서 S. bullata pupae, 자당/물 솔루션.</li>
		<li>다음 2 일에 대 한 산란 사이트, 그들을 아주 벗 만들기의 여성 말 벌을 박탈 하 blowfly 번데기를 제거 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 수집 및 북 아 일 Vitripennis 전 blastoderm 단계 배아의 맞춤
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	<li>Parasitize에 여성 말 벌 허용 (배아 oviposit) 젊은 주인 (S. bullata pupae)으로. 유지 하기 위해 호스트 신선한, 즉시 그들을 취득 후 4 ° C에서 호스트를 저장 하 고 필요할 때만 제거. 참고: 젊은 호스트 이전 호스트 어두운 컬러 puparium (그림 1A) 반면 빨간 색된 puparium를 함으로써 확인할 수 있습니다.<ol>
		<li>개별 신선한 S. bullata 장소 번데기 크기의 구멍을 가진 거품 스 토퍼에 pupae 중심으로 잘라. 노출만 ~ parasitization와 쉽게 태아 컬렉션의 최대 농도 대 한 호스트의 앞쪽 끝 (선호 산란 사이트)의 0.2 cm. 참고: 앞쪽 끝은 반올림, 후부 끝은 두꺼운 ' 분화구 같은 ' 오프닝 (그림 1B)를 포함 하는 동안.</li>
		<li>으로이 배열에서 호스트 번데기 (100 벌 당 대략 5 호스트 pupae)을 놓고 말 벌 그들 (그림 2- ii) parasitize을 허용 하도록 대략 45 분을 기다려야 합니다. 참고: 그것은 매우 중요 하다는 배아, 어린 이상적으로, 사전 blastoderm 단계에 다는 것을 보장 하기 위해 oviposited의 첫 번째 시간. 오래 된 배아 (&#62; 1.5 h) 주입 수 없습니다.</li>
		<li>손으로 고 부드럽게 칫 솔 질/외면 어떤 거주 말 벌 들을 검색 하 여 개미의 호스트를 제거 합니다. 후 신선한 호스트와 함께 그들을 대체 모든 ~ 15 분 일찍 주사 하는 동안 계란을 개최 수집 계속.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>케이지에서 손으로 갓 parasitized 호스트를 제거 합니다. 현미경으로 해, 겸 자를 사용 하 여 신중 하 게 멀리 명. vitripennis 계란 (그림 2- 3 세) 노출 외부 puparium (번데기 껍질)의 후부 끝 (0.4 cm) 껍질. 참고: 합니다 주의 번데기 피부; puncturing 방지 이 경우는 hemolymph microinjection에 대 한 제거 하기 매우 어려울 것입니다 말 벌 배아 축 축 하 게 됩니다.</li>
	<li>액체 접착제를 사용 하 여 태아 맞춤 슬라이드 (그림 3)를 준비 하는 깨끗 한 유리 슬라이드에 coverslip 접착제. 그러나 참고: 높은 성능 인스턴트 접착제 본드 강도 높이기 위해 사용 되 고 건조 속도,에서 슬라이드에 주위를 움직이고는 coverslip 유지할 수 있는 어떤 접착제는 허용.</li>
	<li>箱 호스트 로부터 신중 하 게 젖은 미세 팁 붓 호스트의 부드러운 번데기 피부를 손상 하지 않도록 만드는 배아. 참고: ' 배아를 선택,'는 본질적으로 ultrafine 집게의 쌍의 절반을 붓 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>전송 ~ 20 배아 하나 하나에 슬라이드, 젖은 붓으로 coverslip의 측면에 인접 한. 태아의 뒤 끝은 같은 방향으로 (그림 2- 4) 지적을 커버 슬라이드의 가장자리에 대 한 배아의 앞쪽 끝을 방향을 정하십시오. 이것은 모든 배아 중 동일한 위치에 주입의 높은 정밀도 대 한 허용. 참고:이 향상 된 기술은 배아21,22위에서 설명한 대로 슬라이드를 해결 하기 위해 이중 면 끈끈한 테이프를 필요 하지 않습니다. 또한, 태아만 하거나 마십시오 주입 명. vitripennis 태아 microinjection22위에서 설명한 대로 동안 halocarbon 기름으로 계란을 커버.</li>
</ol>
3. 바늘 준비 Microinjections
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	<li>장소에 바늘 끌어당기는 aluminosilicate 모 세관 유리. 참고: 좋은 바늘은 성공적인 명. vitripennis 에 대 한 중요 한 태아 주사. 주사 바늘은 샤 프와는 chorion 통해 쉽게 침투 수 있도록 미세 팁 있어야 합니다. 석 영 및 붕 규 산 모 세관 바늘은 또한 일 수 있다 (그림 4)를 사용.</li>
	<li>605 하 열 , 속도 130, 80 지연 , 당겨 70, 및 500 압력 바늘 끌어당기는 사람에 설정 합니다. 참고: 추가 바늘 끌어당기는 설정 석 영 및 붕 바늘을 당기는 표 1;에서 볼 수 있습니다. 매개 변수는 다른 pullers 및 필 라 멘 트에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>활성화를 만드는 올바른 바늘 바늘 끌어당기는 사람. 여러 개의 바늘의 생산을 위해 필요에 따라 반복 합니다. 참고: 가져온된 바늘 여러 병렬 상업 모델러 클레이의 롤을 포함 하는 배양 접시에 그들을 배치 하 여 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>다이아몬드 연마 플레이트 약 10에 팁으로 약간 바늘 팁을 경사 25 ° c (그림 2- 3 세) s. 참고: 주사 바늘 동시에 바늘을 통해 regents의 흐름을 강화 하면서 최소한의 피해와 배아로 항목을 홍보 하 여 빗면에서 혜택.</li>
</ol>
4. 태아 Microinjection
<ol>
	<li>게놈 수정 시 약 (예: transposon + 도우미 transposase, 또는 CRIPSR 시 약 등),구성 된 주입 혼합물을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>Microloader 팁을 사용 하 여 주입 바늘 주입 혼합물의 2 µ L와 함께 로드 합니다. 참고: 프로토콜에서 주입 혼합 단일 가이드 RNA (sgRNA) (s) 및 H2o.에서에서 혼합 재조합 Cas9 단백질의 구성</li>
	<li>복합 현미경의 무대에 줄지어 배아와 유리 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>조심 스럽게 25-35 °의 각도 수직으로 태아의 뒤 끝에 바늘을 삽입 합니다.</li></ol>주사 주입 혼합물 (배아의 볼륨의 약 2-10%)의 1-5 pL 고 태아 혼합물 (그림 2- 4) 주입으로 약간 팽창에 나타나는지 확인 합니다. 참고: 너무 많은 주입 혼합 배아에 주입 하는 경우 그것은 수 있습니다 버스트 배아에서 세포질을 밝혀. 또한, 잘못 경사지 또는 바늘의 너무 큰 깨진 여 배아 파열을 일으킬 수 있습니다.<ol>
		<li>막힘 발생 하는 경우 다시 경사지 바늘을 보십시오. 명. vitripennis 배아의 세포질은 비정상적으로 점성 및 스티커, 자주 바늘 (1/25 주사) 막힘에 이르게. 참고: 그것은 드 이온된 수는 붓을 사용 하 여 정기적으로 추가 하 여 주입 기간 동안 태아를 축축한 유지 하는 것이 중요입니다. 브러시에 물 양은 배아를 이동 및 쉽게 정렬 키입니다. 너무 많은 물을 부동 및 너무 작은 물 그들 어려운 주위에 이동 하 게 하는 배아 발생 합니다.</li>
		<li>주사 ~ (약 10 분 소요 한다) 한 번에 20-40 알 다음 중지. 주입 된 달걀을 가볍게 만져 젖은 붓으로 주입 된 달걀을 전송 하 고 호스트에 그들을 배치. 달걀의 배치를 계획 사용 하 여 다시 신선한 새로 주입 계속 (&#62; 1 시간 이전). 참고: 이상적으로이 프로토콜은 가장 효과적인, 한 사람이 지속적으로 수집 하 고 달걀을 줄 경우 다른 사람 주입 게놈 수정 구성 요소 이며 호스트 pupae에 주입 된 배아를 이식 하는 동안.</li>
	</ol>
	

5. Injected G0 명. vitripennis Pre-stung 호스트에 배아 이식
<ol>
	<li>이전 쏘 이다 S. bullata 에 주입 된 G0 배아를 신중 하 게 배치 microinjection 후 젖은 붓으로 번데기 (그림 2- 6). 참고: microinjection에 대 한 배아를 수집 하는 데 사용 하는 호스트 pupae이이 목적을 위해 작동 합니다. 또한, 상당한 노력에도 불구 하 고 현재는 사용된22수 있는 사용할 수 있는 인공 다이어트입니다.<ol>
		<li>인구 과잉과 애벌레 경쟁을 피하기 위해 단일 미리 쏘 호스트에 한 번에 40까지 주입 된 배아 하나를 놓습니다. 참고: 주입은에 손상을 태아; 호스트 pupae에 주입 된 배아의 부주의 이식 주입 된 컴포넌트나, 노른자위를 짜 내 고 배아의 죽음으로 이어질 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>호스트 pupae 젖은 필터 종이와 면봉, 페 트리 접시에 놓고 주입된 태아 (대략 1-2 일)이 부 화까지 약 70%의 습도와 25 ° C에서 그들을 품 어 (그림 2- 7 세). 참고: 중요 한 것은, 호스트 남아 있을 수 있습니다는 벗 겨와 함께 puparium 고 명 vitripennis 계란 개발할 것입니다 일반적으로 너무 오랫동안 그들은 건조를 방지 하기 위해 습도 챔버 (젖은 필터 종이와 면봉 배양 접시)에서 알을 품는. 습도 제어할 수 없는 경우에 약화 면봉에서 습도 실 온에서 배양 하는 것은 충분 합니다.</li>
	<li>G0 배아 해치 후 70%의 습도 25°C에서 새로운 배양 접시에 호스트 pupae를 전송.<ol>
		<li>호스트 pupae와 주입된 G0 애벌레를 매일 모니터링 합니다. 만약 호스트 pupae 파울 냄새, 새로운 건강 pupae를 주입된 애벌레를 전송.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 게놈 수정에 대 한 심사
<ol>
	<li>좋은 붓 또는 배아 선택을 사용 하 여 호스트에서 각 명. vitripennis pupae를 제거 합니다. 주입 된 G0 애벌레 약 8 일 포스트 주입을 pupate 한다.</li>
	<li>목화와 함께 연결 된 격리 된 유리 유리병으로 각 제거 번데기를 배치 하 고 G0 성인, 빗금된 여성 된다는 것 처녀 다운스트림 유전 십자가 함께 도움이 될 것입니다 보장으로 등장 하도록 허용. 참고: 여성 정렬할 수 있습니다 남성에서 날개 길이: 암컷 몸 프로필 옆에 설정 과거를 확장 하는 긴 날개를가지고. 모든 microinjected 여성 pupae 연결된 유리병에 함께 놓일 수 있다 그리고 같은 남성 pupae에 적용 됩니다.</li>
	<li>일수로, 어느 PCR 또는 시각적으로 후 화면 G0 개인 (phenotypic 유전자를 방해) 하는 경우. 예를 들어 CRISPR는 삭제 특정된 유전자에 방해 유전자 표시 형 수 여 하는 경우 다음 정렬 하 고 영향을 받는 형 (그림 2- 8 세)의 돌연변이 체 버전 개인 유지21. 그러나, 영향을 받는 유전자는 필수적인 유전자의 돌연변이 등 보이지 않는 표현 형에 대 한 인코딩 하는 경우 복구에 대 한 화면을 횡단 체계 (크로스 G0 와 야생 타입 여성, 남성 또는 교차 G0 에서 야생 유형으로 여성) 수행 시 금 치 또는 무 균을 통해 상속 돌연변이입니다. 참고: D. melanogaster, N. vitripennis 성인과 유사한 CO2 간단 조작에 대 한 허용에 노출에 의해 움직일 수 있다. 또한, unmated 여성 줄 것 이다 상승 100% 단일 남성 broods, 따라서 돌연변이 unmated 여성 후속 분석을 위해 사용 될 수 있는 돌연변이 남성의 많은 수를 야기할 수 있는. 노트: 필수 유전자에 돌연변이 살아남은 G0 주입 여성 (아마도 heterozygous 돌연변이 대 한) 야생 타입 남성;에 짝짓기에 의해 유지 되어야 할 것 이다 G1 여성 자손의의 치명적인 것이 특정 한 경우 G1 남성 자손의 절반 치명적인 돌연변이의 상속으로 인해 죽을 한다.</li>
	<li>Outcross G0 성인과 화면 G1 자손 transgene 삽입 경우 목표는 transgenesis transgenesis 마커를 사용 하 여에 대 한. 현재 transgenesis 명. vitripennis에 설명 될 남아 있습니다.</li>
</ol>

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	<li>Rivers, D. B., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+of+the+flesh+fly,+Sarcophaga+bullata,+envenomated+by+the+pupal+ectoparasitoid,+Nasonia+vitripennis.">Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis.</a> J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).</li><li>Whiting, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+the+Parasitic+Wasp+Mormoniella+vitripennis+[=Nasonia+brevicornis]+(Walker).">The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker).</a> Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).</li><li>Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterium+targets+maternally+inherited+centrosomes+to+kill+males+in+Nasonia.">A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia.</a> Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).</li><li>Hurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-Killing+Bacteria+in+Insects:+Mechanisms,+Incidence,+and+Implications.">Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications.</a> Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).</li><li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausi&#972;, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selfish&amp;#34;+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis.">A &amp;#34;selfish&amp;#34; B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Sci Rep. 7, 42551 (2017).</li><li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li><li>Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;selfish&amp;#34;+B+chromosome+that+enhances+its+transmission+by+eliminating+the+paternal+genome.">A &amp;#34;selfish&amp;#34; B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome.</a> Science. 240 (4851), 512-514 (1988).</li><li>Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+Proteins+of+the+Parasitoid+Wasp+Nasonia+vitripennis:+Recent+Discovery+of+an+Untapped+Pharmacopee.">Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee.</a> Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).</li><li>de Graaf, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+venom+composition+of+the+ectoparasitoid+wasp+Nasonia+vitripennis+from+bioinformatic+and+proteomic+studies.">Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies.</a> Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).</li><li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia.">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li><li>Grillenberger, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+structure+of+natural+Nasonia+vitripennis+populations:+validating+assumptions+of+sex-ratio+theory.">Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory.</a> Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).</li><li>Pultz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+zygotic+hunchback+in+patterning+the+Nasonia+embryo.">A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo.</a> Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).</li><li>Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+maternal+orthodenticle+patterns+anterior+and+posterior+in+the+long+germ+wasp+Nasonia.">Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia.</a> Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).</li><li>Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+tailless+in+the+long+germ+wasp+Nasonia+vitripennis.">Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis.</a> Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).</li><li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species.">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Genes+Uniquely+Expressed+in+the+Germ-Line+Tissues+of+the+Jewel+Wasp+Nasonia+vitripennis.">Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis.</a> G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).</li><li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome,+paternal+sex+ratio.">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li><li>Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+infection-induced+transcriptome+of+Nasonia+vitripennis+reveals+a+preponderance+of+taxonomically-restricted+immune+genes.">Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes.</a> PloS one. 8 (12), e83984 (2013).</li><li>Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Nasonia+(parasitoid+wasp).">Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp).</a> Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).</li><li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis.">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).</li><li>Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+microinjection+protocol+for+the+parasitoid+Nasonia+vitripennis.">Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis.</a> Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).</li><li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species.">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

명. vitripennis 게놈의 최근 시퀀싱은 기능적으로 하이 종23내 알 수 없는 유전자 분자 도구에 대 한 중요 한 필요를 나 가길 기다립니다. CRISPR-Cas9 시스템, 그리고 많은 다른 유전자 편집 도구, 다양 한 유기 체24에 대 한 유전자 기능 조사에 도움이 될을 입증 했다. 그러나, 상속 돌연변이 생성 하려면이 도구 태아 microinjections 수행 필요. 따라서, 여기는 효율적인 허용 하는 혁신의 번호를 포함 하는 자세한 시각적 기술 시연 명. vitripennis 태아 microinjections.
전반적으로,이 상세한 기술은 기존 방법23에 관하여 중요 한 혁신의 번호를 제공 하는 수 있도록 효율적인 명. vitripennis 태아 microinjections. 예를 들어 태아의 급속 한 컬렉션을 촉진 하기 위하여 산란 도구 (거품 스 토퍼) 만들어지고 크게 내 수많은 배아의 수집을 용이 하 게 하는 호스트 (그림 1)의 후부 끝에 완전히 누워 계란을 제한 하는 데 사용 시간의 짧은 기간. 계란의 더 큰 숫자를 수집 하는 큰 숫자와 함께 말 벌 식민지를 양육에 대 한 기술도 개선 하 고 정의 된. 또한, 태아 맞춤 가속, 배아를 효율적으로 조정 하 고 이중 면 끈끈한 테이프를 사용 하 여 장소 (그림 3)에서 태아를 보호 하지 않고 주입을 허용 하는 배아 줄 맞춤 장치 개발 된다.
또한, 그것은 배아를 주입 하지 desiccating 배아 또는 기름으로 그들을 취재 하는 동안 물으로 촉촉한 유지 하 여 생존 율 향상을 발견. 또한, 여러 가지 모 세관 유리 종류는 시험 고 명 vitripennis microinjection (표 1, 그림 4)에 대 한 완벽 한 바늘을 구성 하는 매개 변수 결정 됩니다. 또한, 다음과 같은 microinjection, 배아 생존 요금은 미리 쏘 호스트에 주입 된 달걀 잠복기로 인해 증가할 수 높은 습도 (70%) 챔버에 배치. 이러한 혁신 명. vitripennis에 대 한 더 간소 하 고 성공적인 microinjection 절차에 대 한 수 있습니다.
주입 장치 및 절차를 양육 사소한 수정 사용자 환경 설정에 따라,이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계를 성공적으로 명. vitripennis에 돌연변이 생성 하기 위한 필수적인 것입니다. 예를 들어 작업 신속 하 게 삽입 된 배아는 &#62; 1 h와 주사 바늘이 태아에 손상을 최소화 하기 위해 충분히 샤 프 둘 다 필수적인 것입니다. 이 프로토콜은 많은 (그렇지 않으면 모두) 유전자에 돌연변이 생성 하기 위한 효과적 이어야 한다, 하는 동안 한 가지 주요 한계는 대상 시퀀스를 쓰게 됩니다 팸 (NGG) 시퀀스를 대상으로 CRIPSR/Cas9 요구 사항입니다.
결론적으로,이 향상 된 기술은 게놈 수정, 삭제, 돌연변이 등의 많은 종류를 생성 하 고 어쩌면 유전자 변형 생성 하 CRIPSR/Cas9 기술21또는 심지어 transgene 삽입을 사용 하 여 삽입을 사용할 수 있습니다. 명. vitripennis는 크게이 유기 체 기능 연구를 가속 한다.

보석 말 벌 명. vitripennis, Sarcophaga bullata1등 파리를 먹고 육체의 ectoparasitoids는 Nasonia 속 내의 4 종 중 하나입니다. 그들의 빠른 세대 기간, 실험실, 그리고 독특하고 중요 한 생물 학적 특성의 범위에서 양육의 용이성으로 인해 명. vitripennis 전통적인 모형 유기 체에서 발견 하는 여러 실험 도구 개발에 대 한 집중 되었습니다. . 예를 들어 일부 독특한 생물 학적 특성 등 haplo-2 중 복제 시스템2, 미생물 및 유전자 기생충3,4, 관계는 supernumary (B) 염색체5,6 ,7. 함께 찍은,이 게 명. vitripennis 독 생산8, 를 포함 한 다른 사람 뿐만 아니라이 프로세스의 분자와 세포질 측면 elucidating 겨냥 하는 실험에 대 한 중요 한 실험 시스템 9, 섹스 결정10,11, 그리고 진화 그리고 개발 축 패턴 형성12,,1314의. 또한, N의 생물학 연구 유전 툴키트. vitripennis 지난 10 년 동안 극적으로 증가 했다 또는 그래서,15고해상도 게놈 시퀀싱과 여러 유전자 발현 연구16,,1718, 그리고 기능적으로 의존 하는 RNA 간섭 (RNAi)19,20을 함께 향상 추적성 및 반전 유전학이 유기이 체에서 수행의 기능 하는 유전자 발현을 방해 하는 능력.
많은 중요 한 과학적인 전진 및 확장 된 툴킷이 유기이 체에,에 불구 하 고 현재의 지식으로 한 그룹은 성공적으로 수행 상속 게놈 수정21생성 하 미 발달 microinjections. 이것은 그들은 매우 연 약하고 작은, 되 고 ~2/3 초파리 melanogaster 태아, 그들 일반적으로 어렵게 조작할 수의 크기 명. vitripennis 의 배아를 사용의 어려움 때문에 주로 이다. 또한, 명 vitripennis 여성 embryogenesis, 애벌레, 번데기 개발의 전체 발생을 미리 쏘 blowfly pupae로 그들의 계란을 입금. 따라서, 성공적인 microinjections, 사전 blastoderm 단계에 대 한 배아 해야 효율적으로 수집 호스트 pupae, 신속 하 게 microinjected, 그리고 즉시 개발에 대 한 그들의 호스트에 다시 이식에서. 이 단계 정밀 및 microinjected 배아 또는 예외적으로 도전 하는 기술을 만드는 번데기 호스트의 손상을 방지 하려면 손 재주가 필요 합니다. 도 불구 하 고, 북 아 일 vitripennis 태아 microinjection22를 설명 하는 10 년 전 동안 출판 한 짧은 프로토콜입니다. 그러나,이 절차 갓 누워 배아 포장해 될 필요, 그것은 microinjection를 위한 계란 앵커를 끈적끈적한 테이프를 사용 하 여 기술의 시각적 데모를 포함 하지 않습니다. 따라서, 상속 게놈을 생성 하기 위해 어떤 기본적인 연구소에 의해 따라 할 수 있는 북 아 일 vitripennis 태아 microinjections에 대 한 향상 된 단계별 프로토콜을 상세하게 비주얼 절차를 포함 하는 업데이트 및 수정 된 프로토콜은 여기에 설명 된 이 중요 한 모델 곤충에 수정입니다.

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td><td>Insect Rearing Cage</td></tr><tr><td>Glass Test Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>Flesh fly pupae, &lt;em&gt;Sarcophaga bullata&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Insects</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kite R</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Leica DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Can also use Borosilicate or Quartz</td></tr><tr><td>Identi-Plugs</td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>Foam plugs</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover glass</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>For glueing coverslip onto microscope slide</td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-fine tip forcep</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

embryo microinjection and transplantation technique for nasonia vitripennis genome manipulation

보석 말 벌 Nasonia vitripennis 섹스 결정, haplo 2 중 섹스 결정, 독이 합성, 그리고 호스트 symbiont 상호 작용, 다른 사람의 사이에서 포함 하 여 프로세스의 연구에 대 한 효과적인 모델 시스템으로 떠오르고 있다. 이 유기 체와 협력의 주요 한계 감독된 게놈 수정 작업을 수행 하는 효과적인 프로토콜의 부족 이다. 게놈 수정의 중요 한 부분 시 약, CRISPR/Cas9 분자를 포함 하 여 microinjection 통해 배아로 편집의 배달입니다. Microinjection 많은 모형 유기 체에서 잘 설립,이 기술은 특히 도전 명. vitripennis 에서 그것의 작은 태아 크기 및 배아 개발이 완전히 내 발생 하는 사실 때문에 주로 수행 하는 개미의 blowfly 번데기입니다. 다음 절차는 호스트 pupae, 그들, microinjecting 개미의 말 벌 배아에서 효과적으로 제거 하기 위한 유선형, 영상 절차를 시연 하 고 호스트에 다시 신중 하 게 그들을 이식 하는 동안 이러한 중요 한 문제 극복 에 대 한 지속 개발. 이 프로토콜은 강하게이 유기 체에 있는 게놈 고급 수정 작업을 수행 하는 연구 그룹의 기능을 향상 시킵니다.

이 프로토콜 식민지 양육, 사전 blastoderm 배아 컬렉션, 정렬, microinjection, 및 주입 후 후속 이식에 대 한 자세한 지침을 제공 하 고 효율적인 게놈 엔지니어링 명. vitripennis에서 사용할 수 있습니다. 그림 2에서처럼 명. vitripennis 으로 성공적인 microinjection에 대 한 단계의 일반적인 순서 포함: (i) 남성과 여성의 성인 친구 허용 (~ 4 일)에 배치 (ii) 공급 신선한 호스트 비행 pupae (S. bullata)는 성관계 암컷과 산란에 대 한 허용 수정된 폼 플러그 (~ 45 분), (iii) 폭로 하 고 사전 blastoderm 단계 말 벌 배아를 수집 개미의 호스트 pupae 표 피 박 리 멀리 신중 하 게 (~ 15 분), 배아를 수집 (4) 정렬 (~ 15 분), (v) 배아로 microinjecting 게놈 수정 구성 요소 (~ 15 분), (vi) 신중 하 게 배치 주입된 태아 적절 한 개발을 위한 수 있도록 미리 쏘 호스트에 다시 (~ 15 분), (vii) 전송 하 여 주입된 태아/호스트의 탈수를 방지 하 고 약 70%의 상대 습도와 습도 챔버로 그들 (~ 15 분). 개미의 호스트 다음 명. vitripennis 배아의 완전 한 개발을 위한 수 있도록 약 14 일 동안 알을 품는. 일단 주입, 성인 (8 세) 호스트에서 등장, 격리, 친구, 고 예상된 돌연변이의 존재에 대 한 그들을 개별적으로 화면.
효과적인 바늘 침투와 북 아 일 vitripennis 배아로 microinjection에 대 한 여러 종류의 석 영, aluminosilicate, 그리고 붕 형식을 포함 하 여 필 라 멘 트와 모 세관 유리 바늘을 테스트 합니다. 그것은 바늘의 품질은 파손/주입, 동안 막힘 방지 및 두 배아 생존 및 변환 효율의 높은 속도 달성 하기 위한 중요 한 발견. 각 유리 유형에 대 한 효과적인 프로토콜 원하는 피하 같은 긴 팁 명. vitripennis 태아 microinjection 다른 micropipette pullers (P-1000, 및 P-2000)를 사용 하 여에 대 한 효과적인 위해서는 바늘을 개발 되었다 (표 1 그림 4).
절차를 최적화 하려면 생존 율 게놈 수정 부품의 다양 한 금액의 주입에 따라 측정 됩니다. 여기에 사용 된 게놈 수정 구성 요소 했다 혼합된 가이드 RNAs와 편집, CRISPR 중재 게놈에 대 한 Cas9 단백질 명. vitripennis21에서 잘 작동 하도록 이전 시연 했다. 무엇는 이전에 유사한 보고, 여기 단사 유전자 설계 및 합성 sgRNA 타겟팅. 대상으로이 유전자를 방해 함으로써, 쉽게 식별 phenotypic 변화 유기 체19,21의 눈 색깔에 볼 수 있다. 다양 한 sgRNA의 농도 결합 하는 주입 혼합물 (0, 20, 40, 80, 160, 그리고 320 ng / µ L) Cas9 단백질 (0, 20, 40, 80, 160, 그리고 320 ng / µ L) 야생 타입 명. vitripennis의 배아에 주입 되 고. 주입 된 배아의 생존 율은 복용량-의존 (표 2)21발견 된다. 감소 생존 율 (표 2), 아마도 첨가제 오프 대상 효과 때문에 sgRNA와 Cas9 단백질의 증가 농도. 높은 습도 (~ 70%)은 낮은 습도로 호스트, 이식 후 배아 생존을 위해 중요 한 것 또한 발견 (~ 10%) 모든 삽입 된 배아를 100% 죽음 귀착되 었 다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
그림 1 . 호스트 pupae의 준비 (S. bullata) 에 대 한 명. vitripennis 배아 산란. (A) 영 하 고 오래 된 S. bullata 번데기입니다. 반면 젊은 번데기는 그들의 표 피에 더 붉은 색조 이전 pupae 어두운 표 피가 있다. 젊은 pupae 산란을 극대화에 대 한 선호 됩니다. 번데기의 후부와 앞쪽 끝도는 "분화구 같은 오프닝 후부에, 앞쪽 끝 둥근된 포인트를 제공 하는 반면에 의해 구별 될 수 있다. (B) 북 아 일 vitripennis 배아 산란. 에 대 한 호스트 (S. bullata) 번데기 준비 호스트 번데기는 번데기 했다 거품 플러그에 삽입 구멍을 크기. 앞쪽 끝의 0.2 cm 앞쪽 영역으로 산란의 최대 농도 대 한 허용 노출 플러그 내부 호스트 pupae 얼굴의 후부 측면을가지고. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
그림 2 . 타임 라인을 만들기 위한 명. vitripennis microinjection에 의해 돌연변이. 명. vitripennis 배아 컬렉션, CRISPR/Cas9 microinjection, 및 포스트 주입 절차의 연대표 명. vitripennis 성인 산란 사이트의 부재에 (나)는 4 일에 대 한 친구 허용 되었다. 는 신선한, 육체 비행 호스트 pupae, S. bullata, 후부 끝의 0.5 c m만 노출로 거품 스 토퍼 안에 parasitization (ii) 수 있도록 45 분 벗 암컷에 도입 되었다. 동시에 microinjection 바늘 및 CRISPR/Cas9 구성 요소를 포함 하 여 주입 재료 (iii) 준비 되었다. 배아는 호스트 (iv)에서 수집, (v), 정렬 되었고 구성 요소 CRISPR/Cas9 (vi)와 주입. 주입 된 배아 신중 하 게 미리 쏘 호스트 (7 세)에 다시 전송 그리고 완전 개발된 (14 일) (8 세)까지 알을 품을. 성인 등장, 돌연변이 대상 유전자 (ix)의 예상된 CRISPR/Cas9 유발 돌연변이 들의 고기에 대 한 상영 했다. 전체 절차는 일반적으로 19 일 걸립니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
그림 3 . 안 감에 배아 수정된 현미경 슬라이드. (A) A coverslip입니다. (B) 현미경 슬라이드입니다. (C)는 배아 줄 맞춤 장치.coverslip 주입 선 배아에 사용 되는 현미경 슬라이드에 붙어 있을 수 있습니다. coverslip의 목적은 쉽게 조작 및 배아의 수 있도록 가장자리 역할 이다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
그림 4 . 주사 바늘 준비. 좋은 나쁜 aluminosilicate 유리 바늘의 (A) 예. (B) unbeveled, 올바르게 경사진 고 가난 하 게 경사진된 바늘의 팁. Aluminosilicate 유리 모 세관 튜브 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 뽑아 했다. 생산된 바늘 팁은 다음 부드럽게 열리고는 beveler를 사용 하 여 정제. 좋은 비스듬한 바늘은 매우 날카로운 팁, 그리고 나쁜 비스듬한 바늘은 무딘 팁. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>유리 모 세관 타입</td>
			<td>셔터 바늘 끌어당기는 모델</td>
			<td>열</td>
			<td>필 라 멘 트</td>
			<td>속도</td>
			<td>지연</td>
			<td>풀</td>
			<td>압력</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>석 영</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>붕 규 산</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. 바늘 끌어당기는 사람에 대 한 설정입니다. 주: 바늘 끌어당기는 설정이 다 기계에서 기계 각 실험실 그들의 자신의 바늘 끌어당기는 설정을 최적화 해야 합니다. 이 테이블 리 외 에서 수정 되었습니다. 21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">총 배아</td>
			<td>이식 (10% 습도)</td>
			<td colspan="4">이식 (70% 습도)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>애벌레 생존자</td>
			<td>애벌레 생존자</td>
			<td colspan="3">성인 생존자</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총 (%)</td>
			<td>총 (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>총 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아니 주입</td>
			<td>아니 주입</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>물</td>
			<td>물</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng / µ l</td>
			<td>20 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng / µ l</td>
			<td>40 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng / µ l</td>
			<td>80 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng / µ l</td>
			<td>160 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng / µ l</td>
			<td>320 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2입니다. 주입 및 이식 survivorship 및 mutagenesis 요금 sgRNA와 Cas9의 다른 농도의 주사에 따라. 이 테이블 리 외 에서 수정 되었습니다 21

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Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

embryo-microinjection-transplantation-technique-for-nasonia

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

12.2K 조회수.  University of California, Riverside. Microinjection Nasonia vitripennis 배아의 생성 상속 게놈 수정 하기 위한 필수적인 방법입니다. 여기에 설명 된 microinjection 그리고이 유기 체에서 미래 게놈 조작에 크게 용이 하 게 한다 Nasonia vitripennis 배아의 이식에 대 한 자세한 절차가입니다.

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

연구

유전학

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

발생학

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 Integrase-Mediated Embryo Transgenesis in Drosophila (초파리에서의 phiC31 인테그라제 매개 배아 형질전환)

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

저자 스포트라이트: Optimizing Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

생체공학

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

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