이 연구는 미국의 암 사회 연구 학술 상 (RSG-13-383-MPC)와 건강의 국가 학회 교부 금 (R01-DE025985)에 의해 지원 되었다. 이 작품 또한 지원 되었다 미국 농 무부 (2015-67015-23268 및 2014-67015-21787) 및 캘리포니아 대학에서에서 새로운 연구 이니셔티브 부여에서 교부 금에 의해 데이비스.

주의:이 절차에 사용 된 셀 라인 전염 성 바이러스를 포함, 조심 하 고만 레벨 2 BSL 시설 이상 진행.
1. 세포 준비 및 유지 보수
<ol><li>문화 체육-K-RTA BCBL-1 셀 (또는 다른 KSHV 감염 PEL 셀 라인) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린 스 글루타민 솔루션 보충 RPMI1640 매체에.</li>
	<li>지속적으로 성장 하 고 2-4 일 마다 1: 4의 비율에 의해 셀을 분할 하려면 확인 하 고 5% 이산화탄소 (CO2), 37 ° C에서 세포 성장.</li>
	<li>모니터 셀 문화는 가벼운 현미경으로 매일 좋은 세포 성장 및 형태학, 그렇지 않으면 것이 좋습니다 세포 배양을 다시 시작 하거나 셀 문화 조건에 따라 조정할 것인지.</li>
</ol>2. 티 미 딘 동기화 및 용균성 유도
<ol><li>10 cm 배양 접시, 접시 TREx-K-Rta BCBL-1 셀에 갓 준비 미디어 (미디어의 1 x 106 셀/2 mL)</li>
	<li>200mm 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM) 요리, 혼합 하 고 18 h에 품 어.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.</li>
	<li>8 h S-단계를 종료를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM), 혼합 및 16 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.</li>
	<li>바이러스 재 활성화를 유도, 세포 배양에 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, 최종 농도 20 ng/mL)와 아목시실린과 (DOX, 최종 농도가 100 ng/mL)을 추가 하 고 혼합 4 h에 대 한 품 어. K-Rta 유도할 수 있는 카세트 없이 셀 라인, TPA (최종 농도 20 ng/mL 및 나트륨 낙 산 염 (1mm))를 사용 하 여 다시 활성화 자극.</li>
	<li>원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 완전 한 문화 미디어에 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 완전 한 문화 미디어에 resuspend.</li>
	<li>24 h에 대 한 성장 하는 세포 수 있습니다.</li>
</ol>3. 고정 및 Permeabilization
참고: 계속 하기 전에 확인 고정 솔루션 (DEPC 처리 PBS에 3.7% 포름알데히드), diethyl pyrocarbonate 처리 인산 염 버퍼 식 염 수 (DEPC-PBS), 글리신 DEPC PBS (글리신의 최종 농도: 100 m m) permeabilizating 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) 준비 된다. 일반적으로, 각 슬라이드 필요 적어도 0.5 백만 셀, 필요한 경우 증식 되며 포함 다시 추가 셀 위 세포가 건강 한 경우에 특히.
<ol><li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.</li>
	<li>원심 200 x g. 세척에서 2 분 동안 셀 셀 3 번 살 균 DEPC PBS의 1 mL. DEPC PBS의 1.2 ml에서 resuspend.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 바닥에 coverslips (실험적인 체제에 의해 결정)의 적절 한 수를 놓습니다.</li>
	<li>플라스틱 셀에 각 coverslip DEPC PBS 혼합물의 200 µ L, 각 슬라이드에 적어도 0.5 백만 셀 인지 확인 합니다. 2 분 해결 하기 위해 세포를 허용 하 고 발음만 세포의 얇은 층을 떠나 초과 DEPC PBS. 그것은이 과정에서 제거 되 고 셀에 대 한 정상입니다. 주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.</li>
	<li>신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (DEPC PBS에 3.7% 포름알데히드) 해결의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
	<li>Coverslips DEPC PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>글리신 DEPC PBS의 1 mL를 신중 하 게 추가 (글리신의 최종 농도: 100 mM) 각 커버 슬립. 5 분 동안 담금질 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
	<li>1 분 Aspirate 초과 DEPC PBS에 단단히 하지만 부드럽게 손을 흔들 또는 5 분 통에 DEPC PBS와 어느 곳의 1.5 mL를 추가 합니다. 수 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) permeabilizing의 1 mL를 추가 합니다. 15 분 동안 permeabilize를 셀 수 있습니다. 참고:이 시점에서 coverslips는 더 이상 일주일에 보다는-20 ° C 냉장고에 저장할 수 없습니다. 동결 방지 하거나 이미지 품질을 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 냉동 실에서 보낸 시간을 최소화 합니다. 있는지 확인 그 때 셀 남아 냉장고에에서 젖은 고는 그들이 제대로 리하이드레이션 DEPC PBS를 가진 후 냉장고에서 제거 하 고 메탄올/아세톤에 덮여.</li>
	<li>5 분 통에 어느 장소와 DEPC PBS의 1.5 mL를 추가 또는 단단히 악수 하지만 손에 부드럽게 1 분에 대 한 발음 초과 DEPC PBS, 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 아일랜드와 RNA-물고기
참고: RNA 물고기 프로브 라벨 및 준비에 관한: 대는 K-Rta 959 기본적인 쌍, 31 다른 프로브 intron 했다 생성 약 50%의 콘텐츠 20 기본적인 쌍 각, GC를 포함 했다. 프로브 및 재고 솔루션 각각 100 µ M와 2.5 µ M 농도, aliquoted 했다.
<ol><li>필요한 실험 정보 레이블 현미경 슬라이드 또는 구별할 수 라벨의 일종.</li>
	<li>축축한 종이 수건으로 sealable 플라스틱 컨테이너의 하단 라인.</li>
	<li>
1 차적인 항 체 솔루션을 준비 (1.5 µ L 라 나 항 체, RNA Pol II 항 체의 0.75 µ L, 베이커의 3 µ L의 tRNA, 30 µ L까지 DEPC PBS 효 모), 각 coverslip 존재에 대 한 제조 법을 곱하면. 각에 1 차적인 항 체 솔루션의 장소 30 µ L 현미경 슬라이드 표시.
	<ol>
<li>처음 관심의 1 차적인 항 체를 적정 하 고 최적의 금액을 사용 합니다. 반드시 사용 순화 IgG, 세럼 (ascites 액체) RNase의 다량을 포함할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이블이 지정 된 현미경 슬라이드에 coverslip (셀 솔루션을 직면 하 고)를 놓고 축축한 종이 수건으로 컨테이너에 슬라이드를 이동 합니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다. 커버 플라스틱 랩으로 컨테이너의 외관. 1 시간 동안 37 ° C로 설정 하는 인큐베이터에 컨테이너를 이동 합니다.</li>
	<li>준비 물고기 워시 버퍼 (2 x 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) (최종), 10 %formamide, 90% DEPC dH2O).</li>
	<li>준비 하는 교 잡 버퍼 x 2 (4 x SSC, 20 %dextran 황산).</li>
	<li>이차 항 체와 물고기 intron 프로브 버퍼 준비 (2 교 잡 버퍼 (최종 1 Hyb 버퍼 x) x의 20 µ L, 베이커의 효 모의 4 µ L tRNA (최종 10%), formamide (마지막 10%), K-Rta intron 프로브의 4 µ L (최종 125 nM), 0.8 µ g의 이차 항 체, DEPC dH2 최대 40 µ L O)입니다. 필요한 모든 슬라이드에 대 한 제조 법을 곱하면 됩니다.</li>
	<li>부 화, 후 3 번 5 분 6 잘 플레이트에서 DEPC PBS로 세포 세척.</li>
	<li>3 시간 5 분 대 한 물고기 워시 버퍼 씻어. 물고기 세척까지 버퍼에 유지 coverslip 혼합물의 둘째 항 체와 intron 프로브 (단계 4.7) 준비 완료.</li>
	<li>깨끗 한 유리 슬라이드 교 잡에 대 한 1 차적인 항 체 외피에 대 한 사용.</li>
	<li>이차 항 체와 물고기 intron 프로브 솔루션 각 유리 슬라이드에 포함 된 40 µ L를 배치 합니다.</li>
	<li>거품을 소개를 하지 않도록 주의 수 버퍼, 위에 셀 면 슬라이드에 세포와 coverslips을 놓습니다.</li>
	<li>하단에 축축한 종이 수건으로 플라스틱 용기에 슬라이드를 놓습니다. 최초의 플라스틱 포장 및 알루미늄 호 일 플라스틱 용기 포장.</li>
	<li>16-24 h에 대 한 37 ° C에서 슬라이드와 컨테이너를 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 신중 하 게는 coverslip 유리 슬라이드 가장자리에서 슬라이드 다시 위로 향하도록 6 잘 플레이트에 넣어 그리고 물고기 워시 버퍼 3 회에서 5 분 동안 6 잘 플레이트 세포를 씻어.</li>
	<li>2 번 2와 셀 세척 x SSC.</li>
	<li>2로 DAPI (1:1, 000)를 추가 x SSC 및 실 온에서 5 분 동안 앉아 있게.</li>
	<li>2 번 2와 셀 세척 x SSC.</li>
	<li>교 잡, 사용 유리 슬라이드를 청소 하 고 유리 슬라이드에 솔루션 설치 10 µ L을 추가.</li>
	<li>장착 솔루션에 coverslips 뒤집어를 놓습니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다.</li>
	<li>연구소 조직으로 부드럽게 셀 스쿼시 주의 초과 설치 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>매니큐어를 사용 하는 coverslips의 가장자리 주위에 충분 한 레이어를 적용 하 고 건조를 허용.</li>
	<li>형광 현미경 검사 법 수행을 계속 진행 합니다.</li>
</ol>5. 3D 형광 현미경 검사 법
참고: 프로토콜 사용 하는 형광 현미경 시스템의 유형을 변화할 것 이다, 하는 동안 다음 단계 정량 분석에 대 한 최적의 이미지 데이터의 수집을 위해 도움이 됩니다.
<ol><li>고정된 샘플을 pretreat 고 형광 photobleaching 이미징 동안 지연 방지 페이드 미디어에 탑재.</li>
	<li>모든 셀 (또는 셀 핵)을 캡처할 수 있습니다 (예: 60 X 1.42 한다 기름 침수 렌즈), 높은 품질 목표를 사용 하 여 보기의 필드에.</li>
	<li>노출 매개 변수 (예를 들어, 전원을, 노출 시간 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 각 형광 색 채널에 대 한) 설정 합니다. 형광 이미지를 취득 합니다. 참고: 하나의 형광 라벨을 포함 하는 긍정적인 컨트롤 샘플도 색상 채널 사이 "누화"의 레벨을 사용 해야 합니다. 이미지 고정된 셀 표본에 대 한 형광 전원을 줄일 수 있습니다 (약간 더 긴 노출 시간)와 photobleaching를 최소화 하기 위해.</li>
	<li>이미징 프로토콜 설정 된 후 유지 동일한 노출 매개 변수 연구에서 모든 샘플에 대 한 일관성 있는-이미지 데이터를 정확 하 게 분석 하 고 비교할 수 있도록.</li>
	<li>사후 수집 이미지 처리 및 3 차원 재구성을 수행 합니다. 식별 RNA 물고기 신호 (적색)에 의해 K-Rta 사본, 면역 형광 (녹색), 및 핵 chromatin 라 나 분자 (해당 되는 경우) DAPI (파란색)으로 물. 참고: 있는 K-Rta와 라 나 공동 클러스터는 세포 핵의 지역 따라서 바이러스 성 녹음 방송 공장 및 복잡 한 복제와 관련 된 것으로 믿어진다.</li>
</ol>

<ol>
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이 문서의 저자는 금융 관계 또는 관심사의 경쟁 충돌 있다.

특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.
PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 ?...

그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로1특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간1방법으로 생성 합니다.
그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급2를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ' 점프 '를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵2수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.
생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB) 여전히 존재. 그것은 탠덤 DNA 반복 (핵소체), rRNA (핵소체) 및 coilin (Cajal 몸) 또는 PML 등 구조 단백질 같은 메커니즘의 다양 한 통해 단백질 (PML-NB)는 이러한 구문을 함께3,4,5 . 이러한 구조와 전사 공장 등 다른 교회 역할 뿐만 아니라 필수 구성 요소의 현지 농도 증가 하지만 단백질 및 궁극적으로 만들 그들 내에서 핵 산의 구성 조절 건설 기계는 효율적인 세포 기능6중앙 사이트입니다.
머릿속으로 하는 핵 구조 형태 epigenetics 공부 하는 연구원에 게 풍부한 정보를 제공 언제, 어디. 바이러스학의 관점에서 KSHV, 같은 latently 감염된 바이러스의 재 활성화 크게 변경 핵의 풍경과 전사 세포 유전자에서 주로 바이러스 성 유전자, 궁극적으로 이동 핵 효소의 분포를 완전 한 기능 바이러스 자손7,8생산. KSHV는 바이러스 성 유전자 발현을 촉진 하기 위하여 세포 유전자 식 기계를 어떻게 조작 합니까? 이러한 정보에는 일시적인 세포 유전자 규제 메커니즘에 빛 창 고 수 있습니다.
다른 모든 herpesviruses KSHV는 용균성 복제 및 지연 시간 이라는 두 개의 라이프 사이클. KSHV는 주로 대기 시간 관련 유전자9,10를 제외 하 고는 대부분의 바이러스 성 유전자의 식 입 막 음, 대기 시간 단계에 상주 합니다. KSHV 생산 대기 시간 동안 대기 핵 항 원 (라 나), constitutively 바이러스 성 게놈을 결속 하 고 인간 염색체11에 바이러스 chromatin tethers 관련. 바이러스 성 게놈과 라 나의 친밀 한 관계 때문에 IFA와 DAPI를 사용 하 여 얼룩을 바이러스 성 episomes 호스트 chromatin 관계 했다 찾을 수 있다.
공부 하 고 단일 episome 수준과 감염 된 세포에 바이러스 성 다른 episomes와 협회에 KSHV 재 활성화, 적극적으로 베 끼 기 바이러스 chromatin에 제자리에 찾을 전략 설립 되었습니다. 따라서, 라 나 및 RNAPII IFA intron RNA-물고기와 결합 했다, KSHV K Rta는 주요 바이러스 성 단백질의 intron 지역 (정확한 프로브 시퀀스 이즈미 야 연구소의 최신 간행물8에서 찾을 수 있습니다)에 바인딩되는 RNA-물고기 프로브를 생성 하 여 필수 고 KSHV 다시 활성화-그것은 식별 가능한 충분 한 전사 찍고 실제로 어디 장소8,11,12,,1314,15 . 이 intron RNA-물고기 기술 연구원을 어디 mRNA 접합 이며 세포질16,17수출 직전 변하게 되는 시각화 수 있습니다.
KSHV phorbol 에스테 르 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) 등을 포함 한 다양 한 화학적 자극에 의해 활성화 될 수 있습니다 및 또한 KSHV 낙 산 염 나트륨 같은 히스톤 deacetylase 억제 물의 overexpression에 의해 활성화 유도 될 수 있다 바이러스 성 녹음 방송 인수, K-Rta19입니다. 연구원은 성공적으로 다시 활성화18유도 전에 셀의 사이클을 동기화 하 여 KSHV 재 활성화의 효율성 증가. 따라서, 이러한 특정 연구에 대 한 셀 더블 티 미 딘 블록 (아래에 설명 된 프로토콜)를 사용 하 여 및 짧은 시간에 대 한 TPA와 아목시실린과 (Dox) 알을 품을 동기화 했다. Doxycyline는 이러한 실험에 활용 셀 라인 doxycycline 유도할 수 있는 K-Rta 카세트 cDNA에서 복제 했다 하 고 K-Rta의 intron 지역에 포함 되지 않습니다 때문에 사용 되었다. 다시 활성화할 수 있지만 K-Rta 식 유도 KSHV 사용 하 여, 그것은 입증 된 다른 연구자는 다양 한 다른 생 화 확 적인 요인으로 인해 K-Rta 식 혼자 판명 미약한 재 자극20. 이들의 모두를 결합 하 여, 시간의 짧은 기간에 마약 외피를 제한 하 여 강력한 하지만 지나치게 인공 KSHV 재 이미징 달성 되었다.
라 나, RNAPII, 라벨링 후 K-Rta introns 그리고 DNA로이 문서에 설명 된, 3D 형광 이미징 widefield deconvolution 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 이미징 소프트웨어와 처리 후 활성 바이러스 episomes의 공간적 분포는 제대로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 활성 chromatin 허브 및 다른 핵 구조 형성의 근본적인 성격에 관한 중앙 질문 공부 될 수 있다. 동일한 규제 요소를 처리 하는 단일 셀에 있는 동일한 바이러스 episomes spatiotemporal 유전자 규제 메커니즘의 이해를 깊게 하는 독특한 연구 도구를 나타낼 수 있습니다.
이미징 여러 세포 표본을 다른 시간 지점에서 고정 본질적으로 동적 분자 과정의 특성의 한계는 형광 분포에서 미묘한 또는 소규모 변화 감지 되지 않습니다 또는 하 찮은 것으로 간주. 희소 한 경우에 모든 세포 관찰 같은 미묘한 변화를 표시 하지 않는 한 이것은 사실 이다. 따라서, 활성 바이러스 성 전사 및 다른 핵 구조의 전체 spatiotemporal 관계 비판적으로 계산 해야 고정 된 이미지를 사용 하 여 합니다. 이러한 기술적 과제를 해결 하기 위해 가장 좋은 방법은 이미지 라이브 세포 바이러스 episomes을 표시 하 고 시간이 지남에 주요 세포질 효소의 위치에 따라입니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium 1650 GlutaMAX</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Needs to be warmed to 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Solution</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Butyrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>Corrosive, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-5758</td><td>Acute toxicity&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179124</td><td>Flammable, toxic</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>67-56-1</td><td>Flammable, toxic, health hazard</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td><td>EMD Milipore</td><td>05-623</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleic acid, transfer from baker&amp;rsquo;s yeast (S. cerevisiae)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9014-25-9</td><td></td></tr><tr><td>Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15557044</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>295876</td><td></td></tr><tr><td>Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td><td>EMD Milipore</td><td>1916C093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;rsquo;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>slowFade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22x22</td><td>Matsunami</td><td>C022221</td><td></td></tr><tr><td>VoloCITY</td><td></td><td>3D imaging software</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/Plus microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr></tbody></table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.

BCBL-1 셀 사용 되 고 라 나와 K-Rta RNA (그림 1) 스테인드 했다 약간 요약된 프로토콜 수행 되었다. 이 실험 검사 바이러스 episomes 적극적으로 베 끼고는 및 셀의 인구에 KSHV 재 자극에 응답의이를 수 있습니다. 그림 1에서 화살표로 표시 된 셀에 밀접 하 게 일치 (로 표시 라 나) 바이러스 episomes의 분포 지역에 고유 K Rta 형광 KSHV 게놈 ...

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Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K 조회수.  University of California, Davis. 바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

연구

면역학 및 감염병학

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

생물학

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...