이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.

1. 유도 PFV 대장균 에 식에서
<ol><li>
대장균 BL21(DE3) pLysS의 20 μ 1 μ PFV에 식 플라스 미드 (10 ng/μ)의 추가 (상업적으로 사용 가능한 셀의 20 μ 약 수는 > 2 x 106 CFU/μ g 플라스 미드) 1.5 mL 튜브에. 부드럽게 손가락 도청 또는 튜브를 터치 믹스. 품 어에 얼음 5 분.
	<ol>
<li>정확히 30 충격 열 42 ˚C에 s 물 목욕 한 후 바로 2 분 동안 얼음을 반환할.</li>
		<li>Catabolite 억제 (SOC) 미디어 실 온 슈퍼 최적의 국물의 80 μ를 추가 합니다. 1 h 225 분당 회전 (rpm) 떨고와 37 ˚C에서 품 어.</li>
		<li>접시는 100 m m x 15 m m Luria 국물 (파운드) agar의 25 mL를 포함 하는 배양 접시에 혼합물의 25 μ (1 L 파운드 agar: 10 g NaCl, 5 g 효 모 추출 물, bacto tryptone 10 g 15 g 천) 및 100 μ g/mL 암 피 실린 (100mg/mL 재고 솔루션).</li>
		<li>두 번째 동일한 접시에 변환 된 셀의 나머지 75 μ 접시 37 ° c.에 하룻밤 내려 뚜껑 접시를 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
검색의 판 변형 대장균. 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 3 mL 접종 (1 L 파운드: bacto tryptone, 10 g의 NaCl, 효 모 5 g의 10 g 추출) 14 mL 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 문화 관에서 100 μ g/mL 암 피 실린 보충. ~ 8 h 225 rpm 동요와 37 ˚C에서 품 어.
	<ol>
<li>50 mL 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린과 34 μ g/mL 페니 (34 mg/mL 재고 솔루션) 250 mL 삼각 플라스 크에에서 보충에 문화의 3 mL를 추가 합니다. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어.</li>
		<li>1 L 파운드, 100 μ g/mL 암 피 실린, 그리고 4 L 삼각 플라스 크에 34 μ g/mL 페니를 이동 문화의 53 mL. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 정기적으로 문화. 처음에, 모든 h 문화 OD600 확인 하십시오. 문화는 원하는 OD600에 도달, 하지 자라 다를 15 분 마다 확인 합니다. 0.9와 1.0 사이 세600 문화를 성장. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송 및 문화의 온도 줄이기 위해 소용돌이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SDS 페이지 분석을 변성 시키기에 의해 나중에 분석 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 전송.
	<ol>
<li>실 온에서 14000 x g에서 microfuge에 1 분 동안 원심 분리에 의해 1.5 mL 튜브에 세포를 작은. 폐기는 상쾌한. Pipetting으로 150 μ 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 펠 릿을 resuspend. PBS 또는 CaCl2 , MgCl2없이 있을 수 있습니다.</li>
		<li>SDS 페이지 샘플 버퍼 x 2의 150 μ 추가 (150 m m Tris HCl, pH 6.8, 1.2 %SDS, 30% 글리세롤, 15% β-mercaptoethanol (βME), 블루 0.0018 %bromophenol) 피펫으로 또는 소용돌이 의해 철저 하 게 혼합. -20 ° c.에 3 분 저장소에 대 한 종 기</li>
	</ol>
</li>
	<li>세균성 문화에 추가: 0.25 m m 이소프로필-베타-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 M 재고 솔루션) 및 50 μ M ZnCl2 (50 m m 재고 솔루션)의 최종 농도. IPTG T7 발기인에서 PFV 유전자의 표정을 유도 및 ZnCl2 PFV 인치 품 즉시 4 헤 대 한 225 rpm에서 떨고와 25 ° C에서 문화에에서 아미노 터미널 아연 손가락 영역의 올바른 접는 보충 교재로 추가 됩니다. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송. SDS 페이지 분석 1.3에서 위와 같이 동일한 프로토콜을 다음 위한 문화의 1 mL를 저장 합니다.</li>
	<li>
적절 한 크기의 원심 병 세균성 문화를 전송 합니다. 예를 들어 1 L 문화 4 살 균 일회용 250 mL 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 병을 양도할 수 있습니다. 4 ˚C에서 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 탁상 원심 분리기에 병을 회전 합니다. 붓는 의해 supernatants를 삭제 합니다.
	<ol>
<li>25 mL (6.25 mL 병 당) 차가운 PBS (또는 CaCl2 및 MgCl2)의 총 볼륨 1 L 세균성 문화에서 알 약의 모든 pipetting으로 resuspend. 결합 하 고 한 50 mL 원뿔 튜브에 세균성 정지를 전송. 4 ° c.에 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 원심 분리기에서 회전 붓는 또는 pipetting는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipetting으로 세균 펠 릿 10 mL 물의 resuspension 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 및 500 μ M phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 프로 테아 제 억제 물)에서 resuspend. 스냅 잠수함 50 mL 튜브에 충분 한 액체 질소와 함께 Dewar 플라스 크에 튜브를 삽입 하 여 펠 릿을 동결. 조심 스럽게 액체 질소에서 튜브를 제거 하 고-80 ° c.에 저장 참고: 세균성 펠 릿-80 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다. 우리는 2 년 동안-80 ° C 저장 다음 활성 단백질의 손실 없이 보았다.</li>
	<li>
분석 사전 유도 후 유도 샘플 8.3 c m, 높이 7.3 c m 0.75 m m 두께 SDS 페이지 젤 1.5 mL 6 %polyacrylamide 레이어 스태킹와 (125 mM Tris HCl, pH 6.8, 6% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED) 3.5 mL 10% 레이어를 해결 polyacrylamide (375 mM Tris HCl, pH 8.8, 10% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED)12.
	<ol>
<li>겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 후 10 잘 빗을 삽입 합니다. 젤 생산은 때 페이지 장치를 조립 하 고 충분 한 SDS 페이지 실행 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, 0.1 %SDS)를 추가 합니다.</li>
		<li>각 샘플의 10 μ prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 염료 앞 약 60 분, 젤의 하단에 도달할 때까지 16.5 V/cm에서 실행 합니다.</li>
		<li>젤 접시를 분해 하 고 젤 플라스틱 욕조를 전송. Coomassie 화려한 블루 솔루션 (0.1 %Coomassie 화려한 블루 R-250, 40% 메탄올, 10% 아세트산) 아낌없이 젤 커버 하 고 주위 온도에서 20 분 동안 얼룩 얼룩을 추가 합니다.</li>
		<li>붓는 의해 얼룩 솔루션을 제거 하 고 바꿀 솔루션 (40% 메탄올, 10% 아세트산) destain까지 밴드를 쉽게 볼 수 있습니다. 붓는 의해 destaining 솔루션을 제거 하 고 이온된 수를 바꿉니다. PFV에 후 유도 샘플에서 쉽게 식별 되어야 합니다. Hexahistidine 태그와 PFV에 47374 Da의 분자량.</li>
		<li>PFV에 표시 되지 않는 경우 변환 접시 중 하나에서 다른 식민지로 시작 하는 유도 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 니켈 친화성 크로마토그래피
<ol><li>얼음에 대 한 세균 펠 릿 녹여 참고:이 중요 한 시간 (약 2-3 h) 소요 됩니다. 펠 릿은 셀 슬러리에 동 때 추가 500 μ M PMSF (100 m m 재고 솔루션)를 추가 합니다.</li>
	<li>계속 박테리아의 50 mL 튜브 얼음 슬러리. 30 대 30% 진폭에서 박테리아를 sonicate s (1 초, 1에서 s) 0.125 인치 직경 0.5 인치 직경 바이오 경적 sonicator는을 사용 하 여 1 L 문화에서 파생 된 펠 릿 당 테이퍼 microtip, 20 kHz의 주파수 및 400 w.의 최대 전력</li>
	<li>차가운 ultracentrifuge 튜브에 셀 샘플을 전송. 폴 리 탄산염 병 어셈블리 (25 m m 직경, 89 m m 높이) 유형 60 Ti 고정된 각도 터와 호환을 사용 합니다. 동일한 중력 힘을 달성 하는 경우 대체 튜브와로 터를 사용할 수 있습니다. 4 ° c.에서 60 분에 대 한 회전 120000 x g 명백한 펠 렛 이어야 한다. 상쾌한 노란 색깔을 할 수 있습니다.</li>
	<li>붓는 또는 찬 50 mL 원뿔 튜브에 pipetting는 상쾌한 전송. 참고 볼륨; 이 볼륨 스냅 동결 전에 사용 되는 물의 resuspension 버퍼의 볼륨 약 해야 합니다. 상쾌한 점성 경우에, 착 색 인쇄기 열을 방해할 수 있는 세균성 DNA에 의해 오염 될 수 있습니다. 이 경우에, 세균성 DNA를 펠 렛을 ultracentrifugation를 반복 합니다.</li>
	<li>
500 mL를 준비 (50mm pH 7.5, 500 mM NaCl, Tris HCl 500 μ PMSF) 버퍼와 500ml 버퍼 B (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μ PMSF, 200mm 이미). 참고:이 프로토콜에서 계속 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템, 모든 버퍼 및 샘플 콜드 룸에 4 ° C에서.<ol>
<li>살 균 필터 완충기 A와 B 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B 버퍼 A와 버퍼 B, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 10%와 90% 버퍼 A 버퍼 B. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 5 mL/min 흐름 속도 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비는 110 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 1.5 mL 니켈 충전 지 (최대 바인딩 용량 50 mg/mL, 최대 1 MPa의 압력). 열 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ˚C에 저장 된 수 있습니다.</li>
	<li>FPLC 악기에 열을 연결 합니다. 0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 90% 버퍼 A와 10% 버퍼 B (이미 20 m m) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (280). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.</li>
	<li>
0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 0.15 mL/min 흐름 속도로 열을 단백질 샘플 (펠 릿 당 ~ 10 mL)를 로드 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
	<ol>
<li>열을 씻어 20 mL 10%와 90% 버퍼 A와 B. 버퍼 수집 50 mL 튜브에서 세척. 선형 그라데이션 20 mL의 10% ~ 100% 버퍼 B (200 m m 이미 20 m m)와 단백질 elute</li>
		<li>마지막으로, 5 mL 100% 버퍼 B (200 m m 이미) 열 세척. 수집에 그라데이션 하 고 마지막 세척 0.27 mL 분수.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 x SDS 페이지 샘플 버퍼의 15 μ 15 μ, 세척, 그리고 피크 A280 분수를 통해 흐름의 결합. 3 분에 대 한 샘플을 끓인 다.
	<ol>
<li>두 개의 10 %SDS 페이지 젤 이전 단계에서 설명한 1.6 제외 하 고 15 잘 빗을 준비 합니다. 10 μ는 젤을 각 샘플의 prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 실행 하 고 얼룩, 1.6 단계에서 설명한 대로 젤 분석.</li>
		<li>육안 검사에 따라 거의 순수한 PFV에 포함 하도록 표시 되는 분수를 결합 한다. Pipetting, 일반적으로 8-10 mL를 볼륨을 측정 한다.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 결합 된 분수의 A280 을 측정 하 고 PFV에 단백질;의 총 금액을 계산 우리의 전형적인 수확량은 유도 문화 L 당 ~ 10 mg 이다. Hexahistidine 태그 PFV에 소멸 계수는 59360 c m-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hexahistidine 태그를 제거 하려면 PFV에 10 m m dithiothreitol (DTT, 1 M 재고 솔루션)와 0.1 m m EDTA, pH 8.0 (0.5 M 재고 솔루션)을 보충 한다. 4 ˚C에서 하룻밤 mg PFV 인치 품 당 인간의 이노 (HRV) 3 C protease의 15 μ g를 추가 합니다. 분열 47374 다에서 44394 다 PFV에 분자량을 감소 하 고 10 %SDS 페이지 분석 하 여 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 헤 파 린 친화성 크로마토그래피
<ol><li>
250 mL 준비 버퍼 C (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF)와 250 mL 버퍼 D (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF, M 1 M NaCl). 참고:이 프로토콜 FPLC 시스템, 버퍼, 그리고 샘플 보관 됩니다 4 ˚C에서 차가운 방에.<ol>
<li>살 균 필터 버퍼 C 그리고 D 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B C 버퍼와 버퍼 D, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 5 mL/min의 유량을 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
80 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 덤플링 sepharose 수 지 (최대 바인딩 용량 소의 2.0 mg mL 당 antithrombin III 수 지; 최대 1.4 MPa의 압력)의 1 mL를 준비 합니다. 열을 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ° c.에 저장 된 수 있습니다. FPLC 악기에 열을 연결 합니다.
	<ol>
<li>1 MPa의 압력을 최대 제한 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (280). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 볼륨 버퍼 c.를 추가 하 여 200mm PFV에 샘플의 NaCl 농도 감소 예를 들어 10 mL PFV 인치를 버퍼 C의 15 mL를 추가 우리의 전체 볼륨은 일반적으로 25 mL.</li>
	<li>
부하 최대 압력 0.5 mL/min 흐름 속도로 덤플링 sepharose 열에 희석된 PFV에 샘플 1.0 MPa를 제한 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
	<ol>
<li>워시 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl), 20 mL로 열 워시 50 mL 원뿔 튜브에 수집. (200 m m 1 M NaCl) 30 mL 선형 그라디언트의 20% ~ 100% 버퍼 D 열 elute</li>
		<li>워시 100% 버퍼 디의 5 mL와 열 수집 0.37 mL 분수에 그라데이션 하 고 마지막 세척 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 로드, 통해, 세척, 분수 8 %SDS 페이지 2.9에 설명 된 대로. 다음 hexahistidine 태그의 분열 하는 PFV에 44394 Da의 분자량 있으며 멸종 계수 hexahistidine 태그를 하지 않고 59360 c m-1 M-1 에 남아 있다. 4 ˚C에서 모든 분수 nuclease 분석 결과 완료 될 때까지 저장 합니다.</li>
</ol>4. nuclease 분석 결과
<ol><li>
식별 덤플링 분수 및 50의 거의 순수한 PFV 인치 결합 3 μ를 포함 하도록 표시 되는 헤 파 린 sepharose 분수 3 kb의 ng supercoiled 플라스 미드 DNA에 반응 버퍼 (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 m NaCl, 5mm MgSO4, 4 μ M ZnCl2 m 10 mM DTT) 15 μ의 최종 볼륨. 없는 PFV 인치와 90 분 포함 부정적인 컨트롤에 대 한 37 ˚C에서 품 어
	<ol>
<li>1 mg/mL 가수분해 K와 반응 (20 mg/mL 재고 솔루션) 및 0.5 %SDS 중지 (10% 주식 솔루션). 37 ° C에서 품 어 1 h. 샘플 나중에 분석-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1의 x TAE 버퍼 (40 m m 트리 아세테이트, 1 mM EDTA) 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람 (10mg/mL 재고 솔루션)13에 볼륨 (w/v) agarose 당 1% 무게의 125 mL 젤을 준비 합니다. Agarose 솔루션을 녹여와 15 cm x 10 cm 젤 캐스팅 용지함에 붓는 다. 5 m m, 0.75 m m 두께 웰 스도 15 잘 빗을 삽입 합니다. 얇은 스 웰 스 1.5 m m 두께에 비해 더 나은 밴드 해상도 얻을. 허용 주위 온도에서 응고 하 젤.
	<ol>
<li>1에서 젤 담가 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람으로 x TAE. Nuclease 분석 결과 반응 염료 (50% 글리세롤, 0.15% 오렌지 G 염료) 로드 x 6의 3.5 μ를 추가 합니다. 전체 볼륨 젤을 로드 합니다. 정 전압, 1 시간 또는 오렌지 G 염료 전면 젤의 끝에 도달할 때까지 주위 온도에 (100) cm 당 10 볼트에서 젤을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바로 형광 스캐너 ethidium 평범한 사람을 감지를 설정 agarose 젤 이미지. 선형 DNA 3 kb 크기 true로 실행 해야 합니다, supercoiled DNA 빠른 (~ 2 kb), 실행 해야 하 고 편안한 원형 DNA 느린 (~3.5 kb)를 실행 해야 합니다.
	<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 각 차선에 supercoiled, 선형, 그리고 편안한 원형 플라스 미드의 픽셀 볼륨을 계산 합니다. 이러한 세 가지 DNA 형태 "총 DNA"에 대 한 볼륨 값 및 선형 및 편안한 원형의 비율을 계산 하는 데 사용할 픽셀의 합계를 호출 합니다. 예를 들어 편안한 서클의 픽셀 볼륨 나눈 값입니다 그 차선에 있는 총 DNA 픽셀 값, 백분율을 결정 하는 100이이 숫자를 곱합니다. 분수 오염 nuclease 포함 하는 부정적인 컨트롤에 비해 선형이 고 편안한 서클의 더 높은 백분율을 표시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헤 파 린 sepharose 분수 오염 nuclease 활동을 표시 하지 않는 결합. 6-8 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 투 석 튜브 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μ M ZnCl2, 10 m m DTT, 20% 글리세롤의 1 리터에 하룻밤 4 ° C에서 10 mm dialyze.</li>
	<li>투 석 배관에서 nuclease 무료 PFV에 샘플을 복구 합니다. A280 을 측정 하 고 최종 단백질 농도 계산. 약 수 및 액체 질소에서 동결. -80 ° c.에 aliquots 저장</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

DNA 복구 단백질, 단일 분자 현미경 검사 법 응용 프로그램, 또는 retroviral integrases 산소 청소부와 같은 DNA와 상호 작용 하는 재조합 단백질 오염 세균 nucleases2,3의 무료 되어야 합니다. 이러한 오염 물질은 동안에 대량 생물 또는 단일 분자 분석 실험 결과의 해석을 혼동 수 있습니다.
우리는 세균 nuclease 자주 공동 정화 PFV 인치와 발견 ...

Dna 단백질 상호 작용의 생 화 학적 및 단일 분자 연구 매우 순수한 재조합 단백질을 필요로합니다. 박테리아에서 nucleases 오염 이러한 분석의 결과 모호한 수 있습니다. 오염 nuclease 재조합 단백질 산소 폐품 protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) 및 대장균 (대장균)1 에서 절연 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV) integrase (IN)의 준비에서 발견 되었습니다. , 2 , 3.
Retroviral 통합 분석 실험 활동4의 측정으로 긁어 또는 선형 제품 supercoiled DNA의 변환에 의존합니다. 세포 감염 동안에 호스트 chromatin5바이러스 성 cDNA의 두 끝에 합류 했다. 반응에 참여 하는 각 끝에는 스트랜드 전송 되 나 이다. 분석 실험 활동 두 DNA 올리고 참여 수 재조합에의 공동된 통합 반응4,,56,7,8에서 표적 DNA에 종료 바이러스 성 cDNA를 흉내 낸. 또는 재조합에 비 순수 관련 반 사이트 통합 반응9,10단 하나의 DNA 끝을 참여할 수 있습니다. Supercoiled 플라스 미드 DNA의 대상인 통합, 공동된 통합 제품은 오는지 DNA 고 반 사이트 통합 제품은 편안한 서클. 이러한 반응 제품 agarose 젤 전기 이동 법1동안 상대 그들의 이동성에 의해 식별 됩니다. 재조합에 오염 nuclease 있으면 가짜 편안한 원이나 실험 결과 혼란 가능성이 선형화 플라스 미드 있을 것입니다. 바이러스 성 DNA 올리고 nuclease 제품 반대로 통합 제품을 결정적으로 식별 하 붙일 표시 될 수 있습니다. 그러나,에서 크게 하시 더군요 supercoiled DNA 목표; 편안한 원 또는 오염 nuclease에 의해 선형 DNA supercoiled 플라스 미드의 손실 결과 및 해석 데이터11의 왜곡 수 있습니다. 따라서 세균 nucleases retroviral 준비에서에서 제거 하는 것이 필수적 이다.
PFV에 세균성 nuclease1에 비해 헤 파 린 sepharose에 대 한 다른 선호도 하고있다. PFV에 고는 nuclease 덤플링 sepharose에서 선형 그라데이션 차입에 의해 분리 될 수 있습니다. 280 nm 첨단 자외선 (UV) 흡 광도 또는 분석 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)는 nuclease 쉽게 감지 되지 않습니다. 대신,는 nuclease 편안한 원이나 선형 제품 supercoiled 플라스 미드의 전환 채용 nuclease 활동 분석 결과 의해 감지 됩니다. 헤 파 린 sepharose 크로마토그래피 다음 각 분수는 nuclease 활동에 대 한 테스트입니다. PFV에 nuclease 오염 물질 모노-Q 음이온 수 지에 대 한 선호도에 차이가 있다. 모노-S 양이온 수 지에 대 한 선호도에 작은 차이가 있다. 그러나, 세균성 nuclease 모노 S 해상도 PFV에 단백질의 효율적인 분리를 수 없습니다. 궁극적으로, 덤플링 sepharose 친 화력 정화 PFV에 세균성 nuclease의 최고의 분리를 제공 하 고 무제한 부하 볼륨의 이점이 있다.
오염 nuclease 활동에 대 한 테스트 다른 단백질을 적용할 수 있습니다. 관심사의 단백질 대체 선호도 특성 PFV에; 보다 가능성이 해야한다. 바인딩 관심과 nuclease 오염 물질의 단백질의 특성에 차이 실험적으로 결정 되어야 합니다. Nuclease 오염 식별이 방법론 모노-S 양이온 또는 모노-Q 음이온 교환 수 지를 포함 하 여 다른 수 지에 적용할 수 있습니다. 선호도 및 이온 교환 수 지는 크로마토그래피 중 단백질의 볼륨에 제한이 없는 nucleases 오염에서 재조합 단백질을 분리 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C protease&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

레트로 바이러스 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 integrase (IN) 단백질은 retroviral 통합의 메커니즘 연구 모델 효소 이다. 다른 레트로 바이러스에서에 비해, PFV에 더 많은 가용성과 실험적인 조작에 순종. 또한, 그것은 임상으로 관련 된 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1)에 억제제, PFV에 촉매 메커니즘은 그의 HIV-1 인치에 catalyzes 바이러스 무료 DNA (cDNA) 대상의 공유 결합 비슷한 제안에 민감한 과정에서 DNA 가닥 전송을 이라고합니다. 이 물가 이동 반응 대상 DNA에 닉스를 소개합니다. 통합 반응 제품의 분석 nucleases 마찬가지로 DNA를 닉의 존재에 의해 혼동 될 수 있습니다. 세균성 nuclease 공동 재조합 PFV에 대장균 (대장균)에 표현 된 정화 표시 되었습니다. 여기 헤 파 린 친화성 크로마토그래피에 의해 오염 nuclease에서 PFV에 격리 하는 방법을 설명 합니다. 분수는 쉽게 supercoiled 플라스 미드와 agarose 젤 전기 이동 법 nuclease 오염에 대 한 상영 됩니다. PFV에 및 오염 nuclease nuclease 무료 준비 재조합 PFV에 통합의 대량 생 화 확 적인 또는 단일 분자 분석에 대 한 적합 한 허용 하는 헤 파 린 sepharose에 대 한 대체 선호도 표시 합니다.

재조합 PFV에 종종 세균 nuclease1오염 됩니다. 생 화 확 적인 통합 분석 편안한 원 및 선형 제품 supercoiled 플라스 미드 DNA의 변환의 정량에 따라 달라 집니다. 오염 nuclease의 존재는이 분석 실험의 스 퓨 리 어스 정량으로 이어질 수 있습니다. Hexahistidine 태그와 표현의 PFV에 대장균 (그림 1)에서 유도 된 이며 니켈 친화성 크로마토그래피 (그...

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Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase 단백질은 종종 정화 동안 세균성 nuclease로 오염 됩니다. 이 메서드는 nuclease 오염을 식별 하 고 효소의 마지막 준비에서 그것을 제거 합니다.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K 조회수.  The Ohio State University College of Medicine. 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase 단백질은 종종 정화 동안 세균성 nuclease로 오염 됩니다. 이 메서드는 nuclease 오염을 식별 하 고 효소의 마지막 준비에서 그것을 제거 합니다.

비디오: Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

연구

면역학 및 감염병학

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

생물학

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

유전학

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Single-Step Heparin Affinity Chromatography를 이용한 AAV 벡터 정제

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

저자 스포트라이트: Adeno-Associated Viral Vectors의 생산 및 정제를 위한 개선된 방법

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

요약

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