저자는 실험의 일부 지원에 대 한 수치와 카밀 마틴과 힐러리 Samagaio의 준비에 대 한 수잔 윗 필드를 감사합니다.

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</ol>

저자는 그녀는 아무 경쟁 금융 관심사가 선언 합니다.

그것은 모든 실험 기간 동안 박테리아 고착 수 표면에 자각 하는 것이 중요입니다. 따라서 유리에 바인딩 할 수 있다 박테리아 수 있습니다 과소 평가 될 가능한 셀 계산 한다면 유리 튜브와 펫을 사용 하 여. 경우 고 일부는 agar agar 또는 토양 식물 재배 또는 토양 식물에 남아 다음 박테리아 수 있습니다 바인딩 접착 소재 보다는 식물. 다른 한편으로, 식물 표면, 특히 뿌리의 경우 세척을 제거할 수 있습니다 자연 표면 코팅과 같은 점 막 따라서 준수 테스트의 결과 변경.
그것은 외피 혼합물에 추가 하는 박테리아 실험 기간 동안 살아 남아 특정 해야 합니다. 따라서 자유로 연결 된 박테리아의 가능한 셀 카운트 정기적으로 해야 한다. 일부 치료 또는 세균성 돌연변이 세균 성장 속도 감소 또는 실제로 세균성 인구의 일부분의 죽음의 원인이 있습니다. 라이브 하 고 죽은 박테리아 특별 한 얼룩 사용 하지 않으면 현미경에 구별할 수 있습니다. 라이브/죽은 박테리아의 유용한 얼룩 키트 살아있는 박테리아에서 염료의 배제에 달려 있다. 그러나, 세균성 종의 혼합된 인구는 존재 하는 경우 다음의 종의 가능한 셀 수 것입니다는 인큐베이션 세균성 죽음 귀착되 여부를 결정 하는 가장 쉬운 방법.
중간 구성 세균성 생존 및 성장을 좌우할 것 이다. 루트 exudate 및 자료 상처에서 나왔고 사이트 잘라 겸손 세균성 성장을 지원 하기 위해 기판을 제공할 것입니다. 인산 염, 질소, 그리고 철이이 조건에 제한 되 경향이 있다. Divalent 양이온 칼슘, 마그네슘 등 접착에 영향을 미칠 수 있습니다. 어떤 경우에 접착에 영향을 미칠 수 있는 탄소 소스. pH도 중요 하다. 일반적으로 rhizosphere의 pH는 5.5 및 6.5 사이입니다.
그것은 박테리아 항 생 저항으로 표시를 사용 하 여 조심 해야 합니다. 가장 자주 사용 하는 항생제는 리 팜 피신 및 nalidixic 산. 이러한 항생제에 저항 염색체 유전자에 있는 돌연변이 때문에 일반적으로 (RNA 중 합 효소와 gyrase, 각각) 이며 따라서 쉽게 전송할 수 없습니다 다른 긴장에는 부 화 하는 동안. 저항의이 유형은 또한 되지는지 않습니다 저하 또는 항생제의 수정. 플라스 미드 부담 유전자 표시와 함께 표시 하는 박테리아 플라스 미드는 다른 박테리아를 전송할 수 없습니다 않는 한 권장 하지 않습니다. 민감한 박테리아 항생제 내성 박테리아에 인접해 있다면 항생제 접시에 성장 수 다음으로 항생제 내성 때문에 항생제의 저하 또는 화학 수정 되지 않아야 합니다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 샘플 (예: 인간 병원 체를 포함 하는 실험) 포함 될 필요가 작은 샘플 크기 및 실험에 대 한 유용 합니다. (위 재료 또는 50 개 이상의 식물의 100 g) 큰 샘플 크기에 대 한 다른 방법 또는이 방법의 과감 한 수정 것입니다 필요10,19,32,,1933, 34 , 35 , 36. 공부 되 고 종 이외의 미생물의 많은 수의 존재는 중요 한 문제를 초래할 수도 있습니다. 가능한 솔루션에는 형광 단백질 또는 항생제 저항 6.1.2-7.3 단계에 설명 된 대로 표시 된 박테리아를 사용 하 여 포함 됩니다. 그러나, 관심의 박테리아는 다른 미생물의 큰 인구에서 드문 개인 때 이러한 마커 공부 되는 박테리아의 수의 명확한 평가 수 있도록 적절 한 않을 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법 중 모두 실험실 기반 방법. 작은 수정 온실 연구 필요할 것 이다. 더 많은 주요 수정 원생 동물, 곤충과 다른 동물 포식, 기후 변화 실험에 대 한 정의 된 조건의 규정을 복잡 분야 연구에 필요한 될 가능성이 있습니다. 미래에 이러한 방법은 식물 표면에 두 개 이상의 미생물의 상호 작용을 포함 하도록 확장할 수 있습니다.

식물의 표면에 세균성 바인딩의 측정 3 개의 서로 다른 상황에서 중요 한 되고있다. 첫 번째 상황은 식물 표면1,2,3에 인간 병원 체의 전송의 시험. 목표는 여기 세균성 바인딩 방지 제거 또는 바운드 박테리아를 죽 일 하는 것입니다 따라서 공장 설비 재료에 의해 질병의 전송을 줄이기 위해. 두 번째 상황은 표면4공장 식물 병원 체의 바인딩의 시험입니다. 다시 한번 목표 여기 바인딩 방지 제거 또는 바운드 박테리아를 죽 일 하는 것입니다 따라서 질병을 줄이기 위해. 세 번째 공생 또는 식물 성장을 승진 시키는 박테리아5,6의 바인딩의 시험 이다. 목표는 여기 세균성 바인딩 및 따라서 증가 식물 건강 및 작물을 홍보 하는 수익률.
이 문서에서 설명 하는 서피스 공장 세균성 바인딩 측정 기술을 저렴 하 고 비교적 수행 하기 쉬운 있습니다. 유일한 요구 사항은 현미경 및 세균 학 실험실에서 일반적으로 자료입니다. 몇 가지 기법에 대 한 목욕 sonicator 유용합니다. 설명 된 기술은 바인딩 상대적으로 작은 샘플 크기를 사용 하 여 실시 하는 실험을 위해 설계 되었습니다. 바인딩의 측정 분야 또는 온실에서 사용 하기 위해 이러한 기술 중 일부를 수정할 수 수 있지만, 실험실에서 만들어집니다.
이 기술은 세균성 바인딩 뿌리, 콩나물, 절단된 잎, 컷 과일과는 실험실7,,89,10,11, 체리 토마토를 그대로 측정 하 사용 되었습니다. 12,13,,1415. 그들은 또한 토양에서 성장 하는 식물의 뿌리 식민지를 측정 하거나 실험실16모래 사용 되었습니다. 기술은 많은 세균성 종 등 Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, 대장균, 살 모 넬 라 enterica, 슈 도모 나 스 fluorescens와 함께 사용 되었습니다. A. tumefaciens 의 표면 상호 작용을 평가 하기 위한 방법 중 유용한 설명 (2012 년)17모 튼 및 Fuqua에 찾을 수 있습니다. 모든 경우에 포함 된 샘플 크기 작은, 더 적은 일반적으로 25-50 식물 보다 했다. 설명 포함 된 실험 기간 동안 유지 될 필요가 있는 인간의 병원 체와 함께 사용을 위해 적당 하다.

<table><tbody><tr><td>light microscope</td><td>any</td><td>N/A</td><td>phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td></tr><tr><td>seeds</td><td>any&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>make a note of the seed lot number and the cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>nutrient agar&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>sea sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sand</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrigfuge</td><td>any scientific company</td><td>N/A</td><td>to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>any scientific company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter counting cell</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatin chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>naladixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

이 원고는 가벼운 현미경에 사용 가능한 셀 카운트 axenic 식물 표면에 세균성 바인딩을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 사용 되는 식물 재료 뿌리, 콩나물, 잎를 포함 하 고 과일을 잘라. 설명 하는 메서드는 저렴, 쉽게, 그리고 작은 샘플 크기에 적합. 바인딩 실험실에서 측정 되 고 부 화 미디어의 다양 한 사용할 수 있습니다. 억제제의 효과 확인할 수 있습니다. 상황을 홍보 하 고 바인딩에 억제 평가 수 있습니다. 경우에 따라 다양 한 조건 변경 바인딩 주로 박테리아 나 식물에 그들의 효과 때문 인지 구별 가능 하다.

A. tumefaciens colonizes 루트 표면. 셀 루 로스 종합을 방지 하는 세균성 돌연변이의 효과 했다 셀 루 로스의 세균 생산 루트 식민에 역할 여부를 결정 하기 위해16을 검사 합니다. 1.3과 7.1 단계에 설명 된 기술은 사용 했다. 토마토 종자 표면 소독 및 살 균 물에서 출 아 했다 했다. 뿌리 길이 약 2 m 때 그들은 mL 당 105 박테리아의 현 탁 액에 담근 고 용기에 저온 살 균된 토양에 심어. 식물 빛/12 h 12 h 어두운 사이클에 25 ° C에서 14 일 동안 성장 했다. 식물 번 표시 된 후 컨테이너에서 제거 되었습니다. 뿌리를 씻어 고 바인딩된 박테리아를 제거 하는 목욕 sonicator에서 sonicated. 세균 숫자는 가능한 셀 수를 사용 하 여 결정 했다. 그림 2 는 토마토 뿌리를 식민지 화 하는 박테리아의 기능에 두 개의 다른 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이의 효과 보여준다. 일부 측정의 표준 편차는 0.9 로그10 (측정의이 유형의 일반적인 문제) 높은 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이의 바인딩 감소 명확 하 게 분명 하 고 우리가 결론 지을 수의 세균 생산 셀 루 로스는 토마토 뿌리의 식민지에서 박테리아를 에이즈.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> 그림 2 : 야생 유형 및 A. tumefaciens의 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이 의해 식민 뿌리. 로그10 cm 루트 길이 토마토 뿌리에서 발견 한 박테리아의 총 수는 야생 타입 A. tumefaciens 스트레인 C58와 셀 루 로스-마이너스 돌연변이 C58:1와 C58:A60 주사. 표시 된 숫자는 최소 4 개의 별도 실험에서에서 수단. 막대의 표준 편차를 나타냅니다. 뿌리는 한 분 mL 당 105 박테리아의 정지에서 그들을 담거 서 주사 했다. 용기에 식물 재배 하 고 느슨하게 부착 박테리아 세척 유리 유리병에 버퍼에서 뿌리를 세척 하 여 제거 되었습니다. 단단히 부착 박테리아 목욕 sonicator 가능한 셀 계산16결정 하 도금 결과 현 탁 액을 사용 하 여 제거 되었습니다. 이 그림은 Matthysse와 McMahan에서 수정 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
알 팔 파 콩나물을 다른 박테리아와 대장균 의 바인딩에서 exopolysaccharides의 역할은 시험 되었다. 대장균 O157:H7에의 한 설사 질병의 몇몇 발발 오염 된 알 팔 파 콩나물을 추적 했습니다. 야생-타입 박테리아와 다양 한 exopolysaccharides를 만들 수 없습니다 돌연변이의 바인딩 1.1, 5.1, 7.2 단계에 설명 된 방법을 사용 하 여 측정 했다. 알 팔 파 콩나물 표면 소독 하 고 어둠 속에서 25 ° C에서 살 균 물에 하루 동안 출 아 했다 했다. 연결 된 씨 외 투를 가진 4 개의 콩나물 무 균 플라스틱 요리 물 5 mL에에서 배치 했다. Luria 국물에서 성장 하는 박테리아는3 mL 당 약 5 x 10의 최종 농도에 추가 되었습니다. 접종된 콩나물 3 일 동안 어둠 속에서 25 ° C에서 인 큐베이 팅 했다. 콩나물 활발 한 전도 된 유리병에 메 마른 물 5 mL에 두 번 씻어 고는 모터 구동 테 플 론 유리 균질 화기를 사용 하 여 버퍼를 세척에 무 균. 박테리아를 사용 하 여 이전 실험 표면 박테리아는 쉽게 관찰 되었다 비록 아무 내 면된 박테리아를 보여주었다 GFP 유전자를 운반 하는 플라스 미드로 표시. 결과 표 1에 표시 됩니다. E. 콜라이 O157:H7의 2 개의 긴장 시험 되었다. 모두 긴장에서 폴 리-β-1, 6-glucuronic acid(PGA)의 생산 표면 식물 병원 성 대장균 의 바인딩에 가장 큰 기여를 할 것 처럼 보였다. 장 산도 바인딩에서 중요 한 역할을 했다. 바인딩 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이에 감소는 중요 한 하는 동안 다른 두 류 대는 큰 했다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">콩나물과 오픈 시드 코트에 바인딩의 E. 대장균 O157:H7에 Exopolysaccharide 생산 유전자에 있는 돌연변이의 효과</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">세균성 긴장</td>
			<td rowspan="2">돌연변이 또는 유전자 (관련 형)</td>
			<td colspan="2">박테리아의 로그10 수 새싹 또는 씨 외 투 바운드</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 팔 파 콩나물b
</td>
			<td>오픈 씨 코트</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>없음 (야생 타입)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (셀 루 로스-빼기)</td>
			<td>2.9 ± 0.7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624 C</td>
			<td>
wcaD (저 승 산 마이너스)</td>
			<td>1.8 ± 0.7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624 P</td>
			<td>
pgaC (PGA-빼기)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1.0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>없음 (야생 타입)</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (셀 루 로스-빼기)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (저 승 산 마이너스)</td>
			<td>3.9 ± 0.5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-빼기)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0.7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">최소 3 일 후에 행 하는 박테리아의 수 (로그10)의 3 측정의 평균 ± 표준 편차입니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b 콩나물 측정 하기 전에 세척 했다.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">크게 다른 야생 타입 c: P < 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">크게 다른 야생 타입 d: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1:의 바인딩에 exopolysaccharide 생산 유전자에 있는 돌연변이의 효과 대장균 을 O157:H7 콩나물. 다양 한 exopolysaccharides 및 병원 성의 바인딩에 lipopolysaccharide의 역할을 결정 하기 위하여 대장균 O157:H7 긴장을 알 팔 파 새싹, 콩나물과 오픈 시드 코트에 돌연변이의 세트의 바인딩 메서드를 사용 하 여 조사 되었다 6 단계에서 설명합니다. 결과 보여 그 폴 리-ß-1, 6-N-아 세 틸-D-글루코사민 (PGA) 콩나물에 대 한 바인딩을 위한 필수적인 것으로 나타나고 그 셀 룰 로스 및 colanic 산이 대장균 O157의 최대 바인딩 필요. 이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.
PGA의 생산 공장 표면, 인코딩 PGA에 필요한 유전자 복제 오 페론을 들고 플라스 미드 (pMM11) 세균성 바인딩 되도록 충분 한 지 확인 하기 위해 생산 하지 것이 두 개의 서로 다른 박테리아에 도입 되었다 일반적으로 토마토 뿌리10에 바인딩할 수 있습니다. A. tumefaciens A1045은 야생 타입 스트레인 C58 순환-β-1, 2 글 루 칸을 만드는 데 실패 하 고 또한 표면29공장에 바인딩할 실패의 돌연변이. Sinorhizobium meliloti 파에 뿌리 혹을 형성 하는 1021 비 콩에 바인딩하지 못합니다 토마토12를 포함 하 여. 1.1, 5.1, 6.3, 및 7.1 단계에 설명 된 기술은 일반적으로 PGA 하 루트 표면에 세균성 바인딩 증가 결정 하 사용 되었다. 토마토 종자 표면 소독 및 살 균 물에서 출 아 했다 했다. 뿌리 했다 세그먼트 길이 1cm로 잘라 하 고 메 마른 물에 박테리아를 주사 했다. 이 두 종의 박테리아를 서로 다른 속도로 성장, 바인딩 세균 성장의 대략 동일한 금액에 대 한 수 있도록 다른 시간에 측정 했다. 플라스 미드 pMM11의 존재는 두 종 (표 2)10의 바운드 박테리아의 수에서 비슷한 크게 증가 발생합니다. 바인딩 크게 증가 가벼운 현미경에 또한 보였다 하지만 바인딩 두 종 (그림 3)에 대 한 매우 달랐다. A. tumefaciens A1045 개별 박테리아 루트 표면에 바인딩됩니다. S. meliloti 박테리아의 몇 가지 루트에 직접 연결 된 박테리아의 대다수는 다른 박테리아에 연결 된만 있는 큰 클러스터에 바인딩된. 이 예제는 단순히 현미경 관측을 포함 하지 않고 행 하는 박테리아의 숫자를 분석 그 실험의 결과 대 한 잘못 된 인상을 줄 수를 보여 줍니다. 하지만 두 방법 (가능한 셀 개수와 현미경 관찰) 보여 그 pMM11 증가 토마토 뿌리에 세균성 바인딩, PGA의 생산에 의해 발생 하는 바인딩 형식을 달랐다 두 세균 종10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">토마토 뿌리에 바인딩의 박테리아에 플라스 미드 pMM11의 효과</td>
		</tr>
<tr>
<td>세균성 긴장</td>
			<td>플라스 미드</td>
			<td>박테리아의 수 mm 루트 길이 당 바인딩</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045는는
</td>
			<td>없음</td>
			<td>103 ± 0.25 x 103 x 0.25
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (벡터)</td>
			<td>103 ± 0.25 x 103 x 0.25
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA 합성)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>없음</td>
			<td>감지 없음</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (벡터)</td>
			<td>감지 없음</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA 합성)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">세균성 바인딩 2 시간 후에 측정 되었다</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b 세균성 바인딩 18 시간 후에 측정 했다</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2:의 바인딩을에 PGA의 합성에 대 한 유전자를 운반 하는 플라스 미드의 효과 A. tumefaciens A1045 및 S. meliloti 토마토 루트 세그먼트 1021. 폴 리-ß-1, 6-의 능력을 시험 하기 위하여N-아 세 틸-D-글루코사민 (PGA) 공장 박테리아의 바인딩을 촉진 뿌리, 식물 관련 된 박테리아의 2 개의 긴장의 바인딩에 PGA (pMM11)을 만들 수 있는 능력을 부여 하는 플라스 미드의 효과 토마토 뿌리는 시험 되었다. 어느 긴장 박테리아의 유전자 PGA 합성 (pBBR1mcs)을 인코딩 없이 플라스 미드 플라스 미드의 존재 또는 부재에 토마토 뿌리에 중요 한 바인딩을 보여주었다. PGA 합성 유전자를 운반 하는 플라스 미드의 추가 바인딩 두 가지 유형의 박테리아에 의해 증가 했다. 때문에 A. tumefaciens S. meliloti 바인딩 S. meliloti에 대 한 18 h 그리고 A. tumefaciens 에 대 한 보육의 2 시간 후 측정 되었다 보다는 빨리 성장 한다. 7 단계에서 사용 된 기술은 그 기술 된다. 이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> 그림 3 : A. tumefaciens A1045 바인딩과 S. meliloti 1021 토마토 루트 머리카락에 PGA 생 합성 유전자를 운반 하는 플라스 미드 pMM11의 효과. A의 토마토 루트 머리카락 바인딩) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021, 및 D) S. meliloti 1021 pMM11. 비록 2 개의 세균성 종의 바인딩 증가 대략 비슷합니다 가벼운 현미경에서 보듯이 바인딩 세부 매우 다르다. 6 단계에서 사용 된 기술은 그 기술 된다. 이 그림은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그것은 때로는 생물학적 인 표면에 바인딩을 사용 하 여 박테리아의 특정 상호 작용에 식물의 기여를 구별에 도움이 수 있습니다. A. tumefaciens 의 유 니 폴라 polysaccharide(UPP) 두 생물과 비 생물 표면30의 다양 한 세균성 바인딩 중재 수 표시 되었습니다. 칼슘은 식물 표면 UPP28에 의해 중재 A. tumefaciens 바인딩을 억제 하 관찰 되었다. 식물의 표면에 세균 바인딩의 칼슘 이온에 의해 저해 박테리아 나 식물 표면 효과 때문 인지를 파악 하기 위해 나일론 스레드를 박테리아의 바인딩 시험 되었다. 단계에서 설명 하는 기술을 8.2 사용 되었다. 토마토 종자 표면 소독 하 고 물 1 단계에 설명 된 대로에 출 아 했다 했다. 박테리아 자당과 최소한의 매체에서 성장 하 고 토마토 뿌리 또는 약 105/mL의 최종 농도에 나일론 스레드 5.1 단계에서 설명한 대로 추가 되었다. 에 세균에 바인딩 토마토 뿌리 및 나일론 스레드 추가 CaCl2 의 효과 현미경에서 시험 되었다. 그림 4 는 칼슘 중 표면 제안 칼슘의 효과 주로 박테리아10을 사용 하 여 바인딩의 유사한 금지를 보여준다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> 그림 4 : 토마토 루트 머리카락과 나일론 스레드 A. tumefaciens 의 바인딩에 칼슘의 효과. 1시 10분에서 토마토 뿌리 (A와 B) 또는 24 h에 대 한 나일론 스레드 (C 및 D) A. tumefaciens 를 incubated MS 염과 1시 20분의 희석 AB 최소한의 매체, 0.4% 자당 (A와 C) 또는 1:10에서 희석 MS 염과 1시 20분의 희석 AB 최소 매체의 희석 포함 하는 60 m m CaCl2 (B와 D)310.4% 자당. 추가 CaCl2 뿌리와 나일론 스레드 억제 보다 식물 표면에 박테리아에 영향 때문에 주로 이었다 제안 모두에 세균성 바인딩을 저해. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

측정 및 식물, 특히 뿌리와 콩나물, 세균성 접착을 위한 쉬운 방법이이 문서에 설명 되어 있습니다.

공장 실험실에서 측정 하는 표면에 박테리아의 부착

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. 측정 및 식물, 특히 뿌리와 콩나물, 세균성 접착을 위한 쉬운 방법이이 문서에 설명 되어 있습니다.

비디오: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

생체공학

Arabidopsis thaliana에 대한 Rhizobacterial Colonization 검출

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

저자 스포트라이트: Enhancing Rhizobacteria colonization on plant roots for improved microbial fertilizer efficiency (미생물 비료 효율 향상을 위한 식물 뿌리의 Rhizobacteria 집락화 향상)

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

수경 재배 조건에서 Arabidopsis thaliana 뿌리에 대한 박테리아 집락 측정

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

환경과학

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily composed of multiple copies of the major fimbrial subunit FimA. FimH adhesin, however, is present as a fibrillar tip structure that drive bacteria binding to host cellular mannose containing receptor. Here, we provide protocols to evaluate and compare the function of type 1 fimbrial subunits in F18ab fimbriae+ Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). We found that both FimA and FimH are required for bacterial adhesion, invasion, and biofilm formation. Deleting fimA gene showed much more reduction in bacterial adhesion and invasion to porcine intestinal columnar epithelial cells IPEC-J2, than that of fimH mutant. Biofilm formation was significantly reduced in both mutants with an equal level. In addition, qPCR demonstrated that either fimA or fimH deletion down-regulated the bacterial flagella and F18 fimbriae genes expression, while up-regulated adhesin was involved in diffuse adherence-I (AIDA-I) gene expression, suggesting the co-regulation of cell surface-localized adhesins in F18ab fimbriae+ STEC.

<meta charset="utf8"></head><body>숙주 세포를 위한 F18ab Fimbriae+ STEC 집락화를 위한 Fimbrial Rod 사용

Here we present a protocol to study the function of fimbriae in bacterial colonization.

숙주 세포를 위한 F18ab Fimbriae+ STEC 집락화를 위한 Fimbrial Rod 사용

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily ...

공장 실험실에서 측정 하는 표면에 박테리아의 부착

요약

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포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

수경 재배 조건에서 Arabidopsis thaliana 뿌리에 대한 박테리아 집락 측정

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을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

숙주 세포를 위한 F18ab Fimbriae⁺ STEC 집락화를 위한 Fimbrial Rod 사용