저자는 Universiti 푸 트 라 말레이시아의 지원을 하 고 싶습니다.

참고: 모든는 화학과 생 화 확 적인 시 약 사용 될 분석 등급의 고 추가 정화 없이 사용. 살 균 이온된 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다. 오토 클레이 브 살 균 전에 모든 유리.
주의: 사용 하십시오 모든 적절 한 안전 관행 공학적 통제 (연기 후드, 글러브)의 사용을 포함 하 여 실험실 활동을 수행할 때 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 외 투, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)입니다.
1. 제조 및 특성의 수정 전극 PLA AuNPs를 사용 하 여
<ol><li>
준비 및 PLA AuNPs의 특성화
	<ol>
<li>빨리 끓는 수성 chloroauric 산 성 솔루션 (1 mM) 100 mL를 나트륨 구 연산 염 해결책 (38.8 m m)의 10 mL를 추가 하 고 주위 온도 아래로 냉각. 준비 된 AuNPs 솔루션는 노란색, 거 무스 름 한 변경으로 시작 되 고 마지막으로 어두운 루비 빨간색으로 끝나는 색상의 변화를 관찰 합니다.</li>
		<li>PLA 펠 릿 용 해 공정에 대 한 스테인레스 스틸 몰드에 놓고 10 분 따라 눌러 절차와 190 ° C의 온도에 그들을 예 열: PLA 시트 준비의 일환으로 1 분에 대 한 2.2 MPa의 압력에서 그들을 넣어. PLA 시트는 약 3 시간 냉각 후 사용 하기 위해 준비가 될 것입니다.</li>
		<li>적극적으로 교 반, 실 온에서 클로 프롬의 5 mL에 PLA 시트의 0.68 mg 분해. 이전 준비 AuNPs 솔루션의 10 mL와 함께 녹아 PLA를 혼합 하 고 균질 실내 온도에 그것을 저 어. 균질 혼합물 다음 PLA AuNPs로 표시 될 수 있습니다 하 고 UV-마주, XRD, TEM, 및 FESEM EDX에 사용 특징.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비 및 수정된 모티브로 탄소 전극의 특성 참고:이 연구에 사용 된 SPCE 구성 3 전극 시스템: 카운터 전극, 탄소 작업 전극과 Ag/AgCl 기준 전극.<ol>
<li>빠르게 SPCE 그리고 공기에 PLA AuNPs의 동질적인 솔루션의 피 펫 25 µ L 24 h 사용 전에 건조.</li>
		<li>수정 된 전극의 화학적 특성 SPCE/PLA-AuNPs, 칼륨 페로 시안 화물에 (K3[Fe(CN)6]3/4-) 활성 표면적, 전기 화학 임피던스 분광학, 반복성, 측정 하 재현성, 고 안정성30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발
<ol><li>
조사 준비 참고: ssDNA 프로브 및 보완 DNA 시퀀스는 생물 공학 정보 (NCBI) 데이터베이스에 대 한 국립 센터에서 정보에 따라 선정 됐다.<ol>
<li>다음 시퀀스에 따라 상업 실험실에서 동결 건조 된 분말 합성 oligonucleotides (20-메 르 ssDNA 프로브, 20-메 르 보완 DNA, 20-메 르 일치 하지 않는 DNA와 21-메 르 비 보완 DNA)를 구입: thiolated ssDNA 프로브: 5 '-/ 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3 보완 DNA: 5 '-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3 한 기반 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG-' 3 ' 3 자료 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG-' 3 ' 비 보완 DNA: 5 '-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3</li>
		<li>솔루션을 사용 하는 살 균 테 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), 분석 부분으로 나누어 모든 oligonucleotides (100 µ M)의 재고 솔루션을 준비 합니다. -4 ° C에 보관 한 다음 적절 한 희석 그냥 사용 하기 전에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동원 정지 및 교 잡의 최적화 참고:는 SPCE PLA AuNPs, SPCE/PLA-AuNPs로 표시로이 연구를 위해 사용 되었다 고 드롭 주조 방법은 DNA 동원 정지 및 교 잡에 대 한 사용 되었다.<ol>
<li>첫째, SPCE/PLA-AuNPs에 thiolated ssDNA 조사의 25 µ L를 무력화 하 고 공기 건조 실 온에서 24 h 이후 그것은 것입니다 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. 세 가지 요소를 사용 하 여 동원 정지 조건의 최적화를 결정: ssDNA (0.2에서 1.4 µ M에 배열 되는), (에서 30 210 분), 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 농도.</li>
		<li>SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 후 그것은 수 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA 교 잡 이벤트 수행의 표면에 보완 DNA의 25 µ L 플라스틱 (5에서 30 분에 배열 되는) 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 두 요소를 통해 교 잡 조건의 최적화를 결정 합니다.</li>
		<li>담가 고정 30 분에 대 한 20 µ M MB에에서 교배 전극을 제거 0.5 m ABS 세척 하 여 비 특히 흡착된 DNA와 초과 MB/20 mM NaCl (pH 4.5)과 다음으로 rinsing 저온. 측정 피크 전류 DPV 기술을 사용 하 여 MB 감소 합니다. DPV 측정 0.1 M PBS (pH 7)를 사용 하 여 실행 없음 표시기를 포함 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조작된 DNA 바이오 센서의 특성
	<ol>
<li>30 분 동안 20 µ M MB에에서 SPCE/PLA AuNPs를 담가, 0.5 M ABS/20 m m NaCl (pH 4.5), 세척 하 고 이전에 측정 이온을 제거 된 물으로 씻어. 프로브 DNA, 보완 DNA, 일치 하지 않는 DNA 및 비 보완 DNA 샘플을 포함 하 여 모든 상호 작용에 대 한 비슷한 절차를 따릅니다.</li>
		<li>전기 화학 감소를 측정 합니다. 참고: DPV 인터페이스 소프트웨어와 상업적으로 제조 된 Autolab를 사용 하 여 측정 했습니다. 0.005 V, 0.05 V의 진폭을 변조 하 고 0.1 M PBS (pH 7)에서 7.73 mVs-1 의 스캔 속도의 잠재적인 단계 V, 0.25-0.5 V에서에서 배열 하는 잠재력에서 MB 전기 화학 감소의 DPV 측정 없음 표시기 포함. 선택도, 감도, 재현성, 및 조작된 DNA 바이오 센서의 열 안정성 더 공부 했다. 보고 결과 3 개의 복제에으로 평균 값 측정을 제시 했다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 실제 샘플을 사용 하 여 조작된 DNA 바이오 센서의 유효성 검사
<ol><li>세균성 긴장의 준비
	<ol>
<li>해산물31,32 의 그들의 중요 한 오염에 따라 세균 샘플을 선택 합니다. 참고: parahaemolyticus V. 참조 긴장 및 다른 8 세균성 긴장 (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 살 모 넬 라 장 염, Klebsiella 폐 렴으로 병원 성 대장균 O157:H7, 균 cereus및 비 브리 오 alginolyticus) 일반적인 식중독의 병원 체는이 연구에서 전기 화학 DNA 바이오 센서 유효성 검사에 대 한 고용 했다.</li>
		<li>문화 조건에 대 한 표 1 을 참조 하십시오 그들의 생존을 유지 그들의 각각 agar에 세균성 긴장의 일상적인 하위 문화 2 주마다를 수행 합니다.</li>
		<li>글리세롤 동결 과정에서 그들을 손상 시킬 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지 하 여 박테리아를 보호-80 ° C에서 20% (v/v) 글리세롤에 포함 된 그들의 각각 성장 broths에 세균성 긴장의 장기 보존을 유지 합니다. 다음으로, 각각 broths로 글리세롤 주식에 보존 된 세균성 세포 배양의 루프를 예방. 박테리아를 부활 해야 하는 때 그들의 각각 성장 시간과 온도 따라 broths을 품 어.</li>
		<li>희석의 시리즈에서 파생 된 미생물을 열거 하기 위한 확산 플레이트 기술33, 표준 및 잘 알려진 방법을 사용 하 여 parahaemolyticus 대 셀의 수량을 결정 합니다.<ol>
<li>Parahaemolyticus V. Trypticase 간장 국물에 문화 (TSB + 3 %NaCl) 140 rpm 진동 상태에서 37 ° C에서. 다음, TSB + 3%의 9 mL에 박테리아 세포 배양의 1ml를 전송 NaCl 10-1 희석 비율을 얻을.</li>
		</ol>
</li>
		<li>9 번 10-10 희석 비율의 전체 시리즈를이 단계를 반복 합니다. 다음으로, 식민지 세 고, 각각에 대 한 브리의 선택적 천 배지에 0.1 mL (10-1 에서 10-10에 시작 되는) 각 희석 비율의 확산. 24 h에 대 한 37 ° C에서 incubated 접시를 품 어.</li>
		<li>식민지 카운터를 사용 하 여 개별 식민지를 계산 하 고 다음 다시-수를 계산 (CFU/pipetted 양 희석 요인 x) 밀리 밀도 (CFU mL-1) 당 콜로 니 형성 단위를 얻을 수 있습니다. CFU mL-1 흡 광도 대 한 교정 줄거리에서 박테리아 세포 정지에서 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지의 농도 파생 시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR 분석 실험의 준비
	<ol>
<li>삶은 세포 절차34다음 변경 된 게놈 DNA 추출 합니다. 첫 번째, 행진 개별 박테리아 스트레인 agar 미디어에 고 국물 미디어, 그것의 상대 성장 상태, 상태를 떨고 140 rpm에서 잠복기 뒤에 접종</li>
		<li>마이크로 원심 튜브로 국물의 1 mL 문화를 플라스틱. 4830 x g와 펠 릿을 얻기 위해 1 분에 4 ° C에서 원심이. 무 균 테 버퍼의 약 500 µ L를 사용 하 여 펠 릿으로 다시 중단. 98 ± 2 ° C가 열 블록에서에 10 분에 대 한 결과 정지를 누른 즉시 lyse 세포와 DNA를 풀어 10 분-18 ° C에서 그것을 진정.</li>
		<li>4830 x g와 명확한 정지는 상쾌한 추가 사용 하기 위해-20 ° C에서 유지 하는 3 분 4 ° C에서 게놈 DNA를 원심. Biophotometer 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로 농도 추출의 순도 결정 하 게놈 DNA 다음 표준 생 화 확 적인 분석 실험35 를 사용 하 여 그리고 16S rRNA 유전자 시퀀싱36여 확인 모든 긴장을 식별. 마지막으로 2 분 동안 92 ° C에서 게놈 DNA를 변성 하 고는 바이오 센서에 응용 프로그램 전에 얼음 물에 급속 하 게 냉각.</li>
		<li>더 parahaemolyticus 대 존재 확인 toxR 유전자를 타겟으로 PCR를 사용 하 여. Thermocycler 뇌관 쌍 (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3'와 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3')를 사용 하 여이 절차를 수행 합니다. 메 마른 물 (15.5 µ L), 버퍼 (5 µ L), 뇌관 (1 µ L, 10 µ M), dNTP 믹스 (1 µ L), DNA 템플렛 (2 µ L), 및 Taq DNA 중 합 효소 (0.2 µ L, 10 x)으로 구성 된 25 µ L 양의 총 반응에서 PCR 증폭을 최적화 합니다.</li>
		<li>구성 요소를 잘 믹스 하 고 증폭의 30 주기 위한 프로그램 thermocycler에 대상 시퀀스의 PCR 증폭을 정렬. 우리의 연구에서 각 주기 구성 3 단계 반응 , 즉., 변성 (94 ° C, 1 분), 어 닐 링 (63 ° C, 1.5 분) 및 확장 (72 ° C, 1.5 분), 최종 확장 (72 ° C, 7 분) 뒤의 30 사이클 이어서 초기 변성 (94 ° C, 3 분).</li>
		<li>증폭된 제품 및 그들의 크기에 1.5 %agarose 젤 전기 이동 법을 통해 확인 합니다. 상업적으로 생산된 젤-문서 시스템 젤 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>코 클 샘플의 준비
	<ol>
<li>신선한 샘플을 얻습니다. 참고: 우리의 신선한 새 조개 (Anadara granosa) Serdang, Selangor, 젖은 시장에서 얻은 고 신속 하 게 분석을 위한 아이스 쿨러 상자에 실험실에 가져온. 2 그룹, 즉 치료 및 치료 그룹을 cockles 수확 했다 균일 하 게 추수의 시작에서 냉장으로 배치까지 가정으로 샘플을 나눕니다.</li>
		<li>사전-20 ° C 24 h, 20 ° C 4 h 이전 DNA 추출에서 UV 빛에 노출에 의해 뒤에서 그들을 저장 하 여 대우 그룹 cockles 취급. 참고: 동결 온도 자외선 노출을 사용 하는 제어에 대 한 그룹 죽이기 또는 적어도 자연스럽 게 축적 parahaemolyticus 대 cockles에 제한. 이 연구에서 제어 상태의 목표 신선한 새 조개의 실제 상황을 모방 하는 70 ° C의 높은 저온 살 균 법 체제를 적용 되지 않습니다. 한편, 그들은 실험실에 도착 하자마자 사전 치료 없이 치료 그룹에서 직접 샘플을 분석 합니다.</li>
		<li>Subculture parahaemolyticus 대 17802 TSB에 ATCC의 변형 (3 %NaCl). TSB의 적절 한 희석의 도금을 통해 inoculum 가능한 셀의 수준을 결정 (3 %NaCl) 104 CFU mL-1 parahaemolyticus 대의 inoculum을 얻으려면 CA에. 증류수에 각 코 클 워시와 껍질에서 조직 제거를 층 류 캐비닛에 소독 집게를 사용 하기 전에 흙의 무료 잡 목.</li>
		<li>살 균 TSB의 90 mL에 균질 화기와 약 10 g 코 클 조직 샘플의 균질 (3 %NaCl) 60에 대 한 s. 추가 아군된 샘플에 대 한 무 균된 샘플 국물의 9 ml parahaemolyticus 대 의 알려진된 금액. Unspiked 샘플을 사용 하 여 부정적인 컨트롤. Parahaemolyticus 대 CA에 샘플의 0.1 mL를 도금 하 여 코 클 샘플에 아군의 셀 개수를 추정 고 이후, microcentrifuge 튜브에 dna 샘플의 1 mL를 pipetting 추출, 바이오 센서 및 PCR 분석 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>변경 된 다음 아군 및 unspiked 샘플에서는 parahaemolyticus 대 의 게놈 DNA 추출 삶은 세포 절차36. DNA 농도 및 순도 바이오 광도 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 마지막으로, 결정 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 없다.

전기 화학 바이오 센서의이 종류의 성공적인 개발을 위한 프레임 워크의 중요 한 단계는 핵 산 (DNA 여기); 변환기에 대 한 적절 한 생물학적 인식 요소 선택 트랜스듀서;의 감지 레이어를 생성 하기 위한 화학 접근 변환 자료; 최적화 DNA 동원 정지 및 교 잡; 그리고 실제 예제를 사용 하 여 개발 된 바이오 센서의 유효성 검사.
민감하고 선택적 전기 화학 DNA 바이오 센서의 성공적...

최근 몇 년 동안에서 공공 및 과학적인 논쟁의 주요 주제, 식중독은 주로 3 에이전트와 관련 된: 미생물1, 화학2및 기생충3. 오염 된 음식 인간, 약한 면역 체계, 노인, 임신 여성, 아기, 그리고 어린 아이4에 그들의 더 높은 위험 그룹에서 특히 심각한 건강 결과 일으킬 수 있습니다. 아프리카, 아시아 및 라틴 아메리카에서 5 세 미만의 어린이에서 매년 발생 하는 급성 설사의 경우에 이상 백만, 식중독 주요 글로벌 질병5,6 와 세계 보건 기구 설립 7가장 중요 한 기여자 서의 미생물 비 브리 오 parahaemolyticus 가장 널리 인정 된 악성 종자 들 눈에 띈다. 그램 음성 박테리아는 높은 소금 환경에서 활성화 되 고 부적당 하 게 요리, 분실 또는 원시 해양에 먹을 때 심각한 인간의 위장염은 일반적으로 해안, 강어귀, 및 해양 환경8에서 발견, 제품9. 또한, 기존의 의료 조건을 어떤 사람들 그들을 상처 감염, 패 혈 증 또는 귀 감염 parahaemolyticus 대10에서 발생 하는 경향이 확인. Parahaemolyticus 대 hemolysins의 독성 요인 질병 병 인에 기여 하는 2 가지의 유형으로 분할 된다: 내 직접 hemolysin (TDH) tdh 유전자에 의해 코딩 및 TDH 관련 hemolysin trh 유전자11에 의해. V. parahaemolyticus 의 독성 마커 (tdh와 trh 유전자)는 주로 환경 표본 보다 임상 표본에서 발견 됩니다.
Parahaemolyticus 대 보유 하 고 광범위 한 조건에서 살아남을 수 신속 하 게 환경 변화12응답. 그것의 확산 메커니즘의 독성 세포 대량13와 병렬로 증가 위험 잠재력을 에스컬레이션 합니다. 심지어 최악의 경우, 기후 변화 이러한 박테리아 그들의 세포 인구 성장14를 가속 화 하기 위해 충분 한 조건을 제공 합니다. 그것의 높은 주파수로 인해 parahaemolyticus 대 감시 될 필요가 식품 공급망의 무역 및 해산물 제품 이기 때문에 그들은 거 대 한 수량15,16 에서 발견의 생산에서 특히 따라 통해 세계. 현재 박테리아 식별 및 생화학 테스트, 농축 및 선택적 미디어17, 매 효소 연결 된 immunomagnetic를 포함 하 여 방법의 범위를 사용 하 여 절연 시험 (ELISA)18, 펄스 분야 젤 전기 이동 법 (PFGE) 19, 라텍스 교착 테스트, 그리고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 시험20. 이러한 메서드는 일반적으로 자격 갖춘된 직원, 정교한 계기 및 힘 드는 기법을 즉시에 오염에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 필요 합니다. 이 심각 하 게 유해한 오염 및 현장 응용 프로그램을 신속 하 게 감지 가능성을 제한 합니다. 빠른 검색 도구는 뛰어난 도전 남아 있습니다.
시간 절약, 비용 효과적인, 실용적인, 그리고 실시간 분석 방법21,,2223,24 제공 하기 때문에 바이오 센 싱은 foodborne 병원 체의 검출을 위한 유망 옵션으로 나오고 . 그러나, 비록 아군된 샘플 및 바이오 센서를 사용 하 여 표준 솔루션 분석 탐지의 많은 긍정적인 결과 왔다, 있다 아직 수성 혼합물 또는 유기농 추출 물25실제 샘플에 적용 하는 연구의 부족. 최근에, 직접 및 간접 deoxyribonucleic 산 (DNA) 탐지를 사용 하 여 전기 화학 바이오 센서 교 잡 이벤트26 를 통해 보완 대상의 그들의 특정 탐지 때문에 과학자 들 사이에서 증가 관심 받은 , 27 , 28 , 29. 이러한 독특한 접근은 소형화 및 상용화 유망 기술에 따라서 제공 하 고, 효소 기반 바이오 센서에 비해 더 안정. 연구의 대상 보고 여기 parahaemolyticus 대 높은 선택도, 민감도, 실용성, 교 잡 동안 DNA 순서 특이성에 따라 검색할 수 있는 빠른 도구를 생성 하는. 식별 전략 교 잡 표시기, 메 틸 렌 블루 (MB)의 존재 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)30 및 모티브로 탄소 전극 (SPCEs)의 조합을 포함 한다. 개발 된 탐지 구성의 잠재력 추가 박테리아 DNA lysate와 신선한 코 클 샘플을 사용 하 여 탐구 된다.

<table><tbody><tr><td>Acetic acid</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane tetraacetic acid</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Gold (III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate III</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate anhydrous salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin methylene blue agar&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

(대 parahaemolyticus) 브리 parahaemolyticus 크게 인간의 사망률과 질병 률의 속도 영향을 미치는 보건 문제의 큰 비율에 세계적으로, 기여 일반적인 foodborne 병원 체 이다. 문화 기반 방법, 면역학 분석 실험, 분자 기반 방법 등 parahaemolyticus 대 의 검출을 위한 일반적인 방법 복잡 한 샘플 처리를 요구 하 고, 지루한, 시간과 비용이 많이 드는 있습니다. 최근, 바이오 센서는 빠른 검색, 비용 효율성, 실용성의 장점으로 유망 하 고 포괄적인 탐지 방법으로 입증 했습니다. 이 연구는 높은 선택도 및 DNA 교 잡의 원리를 사용 하 여 감도 parahaemolyticus 대 감지 하는 빠른 방법 개발에 중점을 둡니다. 작업, 합성된 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)의 x 선 회절 (XRD), 자외선 보이는 분광학 (UV-Vi), 전송 전자 현미경 (TEM), 필드-방출을 사용 하 여 달성 되었다 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (FESEM), 그리고 주기적 Voltammetry (CV). 우리는 또한 추가 안정성, 감도, 및 PLA AuNPs의 재현성의 테스트 실시. 우리는 PLA AuNPs 수성 해결책에서 안정 된 나노 입자의 소리 구조 형성을 발견. 우리는 또한 감도 작은 충전 전송 저항 (Rct) 값과 활성 표면적 (0.41 c m2)의 증가 결과로 향상 된 관찰. 우리의 DNA 바이오 센서의 개발은 PLA AuNPs와 redox 표시기로 메 틸 렌 블루 (MB)를 사용 하 여 모티브로 탄소 전극 (SPCE)의 수정에 근거 했다. 우리는 차동 펄스 voltammetry (DPV)에 의해 동원 정지 및 교 잡 이벤트를 평가. 보완, 보완, 우리 그를 발견 하 고 일치 하지 않는 oligonucleotides 특별히 조작된 바이오 센서에 의해 수훈이 있었다. 그것은 또한 다양 한 식품을 매개로 병원 체에 대 한 분 연구 하 고 신선한 cockles parahaemolyticus 대 의 식별에 안정적으로 민감한 탐지를 보여주었다.

AuNPs의 형성 나트륨 시트르산 존재와 용액의 색깔에서 변화를 통해 밝혀졌다. 이 깊은 루비 레드 빛 노란색에서 변경 하려면 색상을 발생 합니다. PLA AuNPs의 세대 표면 플라스몬 공명 (SPR) 피크의 성장 약 540에서 발견 됐다 대 한 UV 스펙트럼 (그림 1)에서 확인 되었다 nm. 형성 및 PLA AuNPs의 존재는 입자 크기37에 따라 500-600 nm 파장 범위?...

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K 조회수.  Universiti Putra Malaysia. 브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

비디오: Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

연구

생체공학

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

면역학 및 감염병학

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

의 광학 검출<em&gt; E. 대장균</em메조 포러스 실리콘 바이오 센서에 의해&gt; 박테리아

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

진균 독소의 검출을위한 ELIME (효소가 단백질 자기 전기를 연결) 방법

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

생물학

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Electrochemical Biosensing

Electrochemical biosensors detect the binding of a target molecule by sensing an oxidation-reduction event. These sensors paved the way for modern biosensing after the invention of the glucose biosensor. This video will introduce electrochemical biosensing, show the workings of the glucose biosensor, and discuss how electrochemical biosensors are used in cancer detection.

Glucose Biosensor: an Electrochemical Biosensor

전기화학 바이오센싱

Electrochemical biosensors detect the binding of a target molecule by sensing an oxidation-reduction event.  These sensors paved the way for modern ...