우리는이 연구 자금에 대 한 우수성에 대 한 유태인 유산 기금에 감사입니다. 우리 닥터 스튜어트 윌리엄스 II 전기 시스템의 사용을 아낌없이 제공 감사. 우리는 또한 Griffithsin를 제공에 대 한 박사 케네스 팔 머 감사 합니다. 우리는 또한 박사 노부유키 마토 바와 그의 연구소 GRFT ELISA에서 작동 하는 훈련에 대 한 감사 합니다.

1. 준비 및 제조 Electrospun 섬유 발판의 주의: 화학 증기 두건 .에 용 매 또는 폴리머 솔루션으로 모든 작업을 수행 해야 프로토콜을 시작 하기 전에 각 시 약의 물질 안전 데이터 시트를 참조.
<li><ol>Electrospin 3 mL 15 %w / w PLGA 폴리머 솔루션에 무게의 50: 50 폴 리 (유산 공동 glycolic 산) 720 mg (PLGA; 0.55 0.75 dL/g, 31-57 kDa) 10 mL 섬광 유리병에. 솔루션의 볼륨은 현재 연구에 사용 되는 일반적인 일괄 처리 크기에 따라. 
	참고: 폴리머 질량 주어진된 양의 용 매를 추가 하는 폴리머를 분해 하는 데 사용 하는 용 매에의 밀도 확인 하 여 계산 되어야 합니다. 용 매 Hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP)의 조밀도 1.59 g/mL 이다. 따라서, 용 매, 무게 4.8 g (3.0 x 1.59 g/mL)는 3.0 mL HFIP 필요의 볼륨에 따라. 15 %w / w HFIP PLGA의 일부분, 720 mg PLGA 3.0 mL HFIP (0.15 x 4800 mg = 720 mg)에 추가 되어야 합니다. %W / v, 보다는 오히려 %w / w 폴리머/솔루션을 사용 하 여의 장점은이 마지막 해결책의 정의 무게를 제공 합니다. 이 정의 된 무게 1.3 단계 용 매 증발의 경우 더 정확한 용 매 대체 가능.</li>
	<li>추가 3.0 mL HFIP 유리 섬광 유리병 (에서 단계 1.1) PLGA를 포함 하는 혈 청 학적인 유리 피 펫을 사용 하 여. 플라스틱 필름, 유리병 커버 다음 측정 하 고 기록 유리병 미사</li>
	<li>는 폴리머의 완전 한 해체를 위해 37 ° C에서 하룻밤 폴리머 정지 품 어. 어떤 용 매 증발, 유리병 질량 감소 추가 HFIP 유리병 단계 1.2에서에서 원래 질량에 도달할 때까지.</li>
	<li>인큐베이션, 후 준비 전기 장치 ( 그림 2 A). 모든 규모의 맨 드릴을 사용할 수 있습니다, 비록 여기 회전 25 mm 외부 직경 스테인리스 굴대는 수집기로 사용 되었다. 
	참고: 큰 맨 드릴 직경 전기 솔루션의 동일한 볼륨을 주어 섬유 두께 줄일 것 이다.</li>
	<li>폴리머 솔루션 3 mL 주사기로 발음.</li>
	<li>무딘 18 게이지, ½ 인치 바늘 팁 주사기를 연결 하 고 바늘 팁에서 빈 headspace 제거 초과 솔루션 (일반적으로 0.25 mL) 분배.</li>
	<li>주사기 주사기 펌프에 놓고 2.0 mL/h. 악기 유량 설정 
	참고:이 유량은 이전 기반 최적화이 대 한 폴리머 점도.</li>
	<li>폴리머 솔루션 +27의 전압을 사용 하 여 주사기 바늘과 electrospin에는 전원 연결 kV. 바늘 및 수집기 사이의 거리는 대략 25 cm ( 그림 2 B)로 설정 되어야 합니다. 
	주의: 전기 프로세스 용 매 증기를 만듭니다. 증기 두건 또는 밀폐 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 유해한 증기 .을 제거</li>
	<li>전체 솔루션 electrospun 일단 전원 끄고 완전히 용 매를 증발 하는 추가 30 분에 대 한 회전 심 봉 수.</li>
	<li>차례 회전 심 봉 수집기와 곡 괭에서 섬유를 잘라 면도날을 사용 하 여. 블레이드를 사용 하 여 곡 괭에서 섬유를 부드럽게 껍질.</li>
	<li>레이블이 페 트리 접시에 electrospun PLGA 섬유를 수집 하 고 잔여 용 매를 제거 하는 desiccatorovernight에.</li>
</ol> 2. GRFT 섬유의 표면 수정 <ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 2-(N-morpholino)의 준비 솔루션 ethanesulfonic 산 (MES 버퍼). 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1.44 g Na 2 HPO 4 및 0.24 g KH 2 포 4 초순 물 1 L에 용 해 하 여 PBS를 준비 합니다. 마찬가지로, 19.52 g MES (무료 산, MW 195.2) 분해 및 29.22 g MES 버퍼 준비 초순 물 1 L에 NaCl. 각 솔루션의 최종 pH는 7.2-7.5 5.0-6.0, 각각, pH 미터를 사용 하 여 확인 하십시오.</li>
	<li>EDC (2 mM) 및 보 건국 (5mm)의 개별 작업 솔루션 준비.
	<ol><li>EDC와 보 건국 냉장고에서 제거 하 고 무게 전에 실내 온도에 equilibrate 수.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 관으로 EDC의 4 밀리 그램 무게.</li>
		<li>다른 microcentrifuge 관으로 NHS의 6 밀리 그램 무게.</li>
		<li>추가 1 mL MES 버퍼 각 튜브입니다. 소용돌이 시 약을 보장 하기 위해 적극적으로 모두 튜브 완전히 해산.</li>
	</ol></li> <li>Hydroxylamine 솔루션 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 밀리 그램 무게에 의해 준비.</li>
	<li>20 mL PBS hydroxylamine와 추가 해산 소용돌이.</li>
	<li>15 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 PLGA 섬유의 적절 한 금액을 질량. 일반적으로, 섬유의 75 mg는 각 반응 일괄 처리에 사용 됩니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 MES 버퍼의 8 mL을 추가.</li>
	<li>추가 1 mL 각 관에 앞서 준비 EDC와 보 건국 솔루션의. 솔루션의 최종 볼륨 10 mL 이어야 한다. EDC와 보 건국의 최종 농도 0.4 mg/mL 및 0.6 mg/mL, 각각 이어야 한다.</li>
	<li>가까이 플라스틱 필름 및 실내 온도 ( 그림 3 B)에서 15 분 동안 부드럽게 반전에 솔루션을 수 있도록 회전에 15 mL 튜브를 봉인. 이 단계는 GRFT 단백질 ( 그림 3 A)와 공유 수정 있도록 폴리머에 carboxyl 그룹 활성화.</li>
	<li>활성화, 후 신중 하 게 튜브에 β-mercaptoethanol의 14 µ L을 추가 하 여 반응을 끄다. 완전 한 혼합 되도록 여러 번 튜브를 반전. 
	주의: β-mercaptoethanol은 매우 독성 및 화학 증기 두건에서 사용 해야 합니다.</li>
	<li>는 상쾌한 삭제 하 고 10 mL PBS, 모든 나머지 β-mercaptoethanol을 제거 하려면 두 번, PLGA 섬유 린스.</li>
	<li>Rinsing 후, 튜브를 GRFT 재고 솔루션의 적절 한 금액을 추가. 예를 들어 5 nmol GRFT/mg 섬유는 섬유의 밀리 그램 당 (10 mg/mL 재고)에서 GRFT 재고 솔루션의 6.35 µ L를 요구할 것입니다. 따라서 75 mg 섬유 샘플 476.25 µ L 10 mg/mL GRFT 재고 솔루션의 필요. 
	참고: GRFT 섬유 0.05, 0.5, 및 mg 섬유 당 5 nmol GRFT의 이론적인 선적으로 조작 했다.</li>
	<li>닫고 철저 하 게 혼합 되도록 튜브 반전 추가 8 mL를 최종 볼륨을가지고 충분 한 PBS.</li>
	<li>튜브 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 장소는 터에 다시,이 시간 2 h.</li>
	<li>부 화 후 2 h, 15ml 원심 관으로 hydroxylamine 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 반응을 끄다. 제조업체 지침 당 냉각 반응 동안 hydroxylamine의 최종 농도 0.7 mg/mL 이어야 한다.</li>
	<li>는 솔루션을 잘 혼합 하 고는 상쾌한 삭제. 어떤 결합형된 GRFT를 제거 하려면 10 mL 초순 물으로 두 번 표면 수정 PLGA 섬유 린스.</li>
	<li>전송 섬유 페 트리 접시 및 장소는 desiccator 내부 섬유 완전히 건조 될 때까지. 저장을 위한 4 ° C를 페 트리 접시를 전송.</li>
</ol> 3. SEM GRFT 표면 특성 수정 섬유 <ol><li>장소는 SEM에 탄소 이중 면 테이프의 스트립 견본 마운트. 영구 마커를 사용 하 여 샘플 식별 정보 견본 마운트 하단의 레이블.</li>
	<li>한 표면 수정 섬유에서 3 샘플 고 별도 표본 마운트에 그들을 배치. 각 샘플의 두께 약 0.5 m m.</li>
	<li>스퍼터 코트 골드 플레이트에서 전자 유도 입자 증 착을 사용 하 여 샘플. 스퍼터 90 코트 s, 2.4 k v. 
	참고: 스퍼터 코트 시간 전압 및 암페어 수를 포함 하 여 장비 매개 변수에 따라 다를 수 있습니다.</li>
	<li>8 샘플 이미지 5, 1, 000에서까지 확대와 함께 kV X. 000</li>
</ol> 4. GRFT 표면 수정 섬유에서 추출 <ol><li>1.5 mL microcentrifuge 튜브로 3 중에서 섬유의 2 밀리 그램을 대량.</li>
	<li>튜브, 다음 소용돌이를 1 mL 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 추가 하 고 완전히 섬유 분해를 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
	<li>인큐베이션, 후 희석의 10 µ L 약 수 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 4.2, 적어도 100 단계에서 DMSO 섬유 솔루션 (pH = 8.0).</li>
	<li>ELISA와 특성화 로드까지-20 ° C에서 샘플을 저장할.</li>
</ol> 5. 섬유에서 탈 착 GRFT 측정 <ol><li>GRFT 발표의 양을 평가 또는 섬유 표면 수정 및 microcentrifuge 관에서 5-10 밀리 그램의 무게는 섬유에서 desorbed. 각 관에서 섬유 대량 기록.</li>
	<li>생리 적인 환경을 모방 하는 적절 한 솔루션의 1 mL을 추가 (예, PBS, 테 버퍼, 시뮬레이션된 질 액체 (SVF), 등) 각 샘플.</li>
	<li>200 rpm, 37 회전 통에 1 시간에 대 한 샘플을 품 어 ° c.</li>
	<li>후 부 화, 제거 약 1 mL 유리병, 약 수에서 desorbed GRFT 클러스터에 포함 된 테 버퍼 튜브. 단백질 정량화까지-20 ° C에서 저장소.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브 샘플 전송, microcentrifuge 관 내의 섬유에 신선한 버퍼 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 다음 시간 포인트까지 품 어.</li>
	<li>릴리스를 측정 하는 데 사용 하는 전형적인 시간 포인트 포함: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h, 및 1 wk. 무시할 수 탈 착 4 헤 후 이러한 연구에서 관찰 되었다</li>
</ol> 6. GRFT 추출 및 ELISA 통해 탈 착의 정량화 HA의 0.1 mL <ol><li>코트 96-잘 ELISA 플레이트 (10 µ g/mL) 잘 당 앞에서 설명한 51. 플라스틱 필름 격판덮개 및 4 ° C ( 그림 4)에서 밤새 품 어.</li>
	<li>코팅 버퍼를 제거 하 고 각 우물에 버퍼 (2-3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 0.05% 폴 20와 함께)를 차단 하는 0.3 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 적어도 2 시간에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>, 부 화 후 3 번 0.1% 폴 20 (PBS-P)와 1 x PBS 가진 접시를 씻어. Rinsing 후, 각 우물에 부정적인 컨트롤 샘플, 표준, 또는 PBS의 0.1 mL를 분배. 다시 실 온에서 1 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>린스는 접시 3 번 다시 PBS. Rinsing 후, 각 음에 1 차적인 항 체 (염소 안티 GRFT 원으로)의 0.1 mL를 추가 하 고 실내 온도에 적어도 1 시간에 품 어. 일반적으로 1 차적인 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.</li>
	<li>잠복기 1 차적인 항 체 린스 샘플 판 다시 3 회 PBS.와 후 이차 항 체의 0.1 mL를 추가 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)-활용 된 토끼 반대로 염소 IgG) 각을 잘 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 이차 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.</li>
	<li>세척 접시 3 번. 각 우물에 0.1 mL TMB 2 과산화 효소 기질을 추가 합니다. 모니터 색상 개발 (약 2 분), 다음 추가 0.1 mL H 2 이렇게 4 (1 N) 반응 해소. 450에 접시를 읽고 플레이트 리더에 nm.</li>
	<li>배경 OD 값 (웰 스 PBS를 수신만 하는), 평균 및 실험적인 그룹에서 이것을 빼기.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

그들의 다공성 구조와 큰 표면 영역, EFs 헬스케어, 치료 배달 차량으로 봉사를 포함 하는 중 하나는 다양 한 응용 프로그램을 발견 했다. 약물 및 다른 활성 에이전트 통합할 수 있습니다 EFs에서 가변 배달 동안 생물 의약품 및 화학 ligands 셀-특정 대상52 또는 바이오 센 싱53섬유 표면에 활용 될 수 있습니다. 여기 GRFT의 제조 표면-수정 PLGA EFs, HIV 감염을 방지 하기...

국 소 전달 플랫폼으로 EFs 사용 하 여 성병을 줄일 가능성이 있다. 현재, 36 백만 이상의 사람들이 HIV에 보고 2015 혼자1,2의 이상 2 백만 새로운 케이스와 함께 살고 있다. 또한, 포진 심 플렉스 바이러스 2 (HSV-2) 감염의 영향을 수백 전세계 사람들의 수백만 입력 하 고 2-5 배3HIV의 수집을 향상을 보여줘 왔다. 이 관계 HSV-2 감염 및 HIV 취득으로 인해 여러 성병에 대 한 동시 보호를 제공 하는 새로운 활성 에이전트 개발에 상당한 관심이입니다. 또한, 이러한 항 바이러스 대리인의 납품을 개선 하기 위해 새로운 차량의 개발 추가 보호 및 치료 효능을 향상 시키기 위해 잠재력을 제공 합니다. 이 목표를 향해 EFs V-1와 h s V-2 감염의 보급을 줄이기 위해 새로운 배달 플랫폼으로 조사 되어 있다.
지난 2 년 동안 EFs는 약물 전달 및 조직 공학4의 분야에서 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 종종, 생체 고분자는 쉽게 치료 응용 프로그램을 변환할 선택 됩니다. 고분자 EFs를 조작 하 선택 된 폴리머는 유기 용 제 또는 수성 솔루션에 폴리머 hydrophobicity5의 정도 따라 녹입니다. 관심의 활성 에이전트 다음 전기 과정 이전 또는 수성 솔루션에 추가 됩니다. 폴리머 솔루션 다음 주사기로 발음 이며 천천히 전류 따라 나옵니다. 이 프로세스는 일반적으로 폴리머 섬유 시트 또는 원통형 macrostructures (그림 1)와 마이크로-나노 규모6에서 배열 하는 섬유 직경에에서 발생 합니다. 가장 치료 응용 프로그램에 대 한 활성 에이전트 전기 과정에서 섬유 안에 통합 되 고 확산 및 후속 섬유 저하를 통해 섬유에서 해제 됩니다. 속도 저하 또는 자료의 다른 유형의 폴리머를 사용 하 여 변경 될 수 있습니다 또는 폴리머 혼합7을 독특한 화학 및 물리적 특성 부여 하 고 거의 모든의 캡슐화를 추진 하 고 원하는 릴리스 프로필을 설정 하 복합. 따라서, EFs는 작은 분자 약물 및 단백질, 펩 티 드, oligonucleotides, 및 성장 요인6,,89를 포함 하 여 생물 학적 에이전트의 배달에 도움이 입증 했습니다.
STI 예방 분야에서 EFs 최근 사용 된 통합 하 고 지속 또는 유도할 수 있는-릴리스 항 바이러스 대리인10,,1112,13,14의 제공 ,15,,1617,,1819. 초기 연구 중 하나에서 전화 응답 섬유 에이즈-111에 대 한 보호의 온-디맨드 방법으로 활성 에이전트 (FRT) 여성 재생산 지역 내 환경 변화에 대응을 출시 개발 되었다. 이후, 다른 연구 조사 폴리머 혼합 폴 리 에틸렌 산화물 (PEO)와 폴 리-L-젖 산 (PLLA), 에이즈-1 예방 및 피임 생체 외 에 대 한 항 바이러스 및 피임 제의 가변 평가의 구성 12. 추가 연구는 다음을 제공 하는 EFs의 타당성 증명: 작은 분자 antivirals14, 강한 릴리스 및 유연한 기계적 특성20, 3 차원 배달 아키텍처21 연장 , 정자 침투12, 그리고 다른 배달 기술13와 병합 하는 능력의 저해. 마지막으로, 이전 작업 일반적인 co-infective 바이러스, HSV-2와 에이즈-114에 대 한 항 바이러스 제의 지속적인 배달에 대 한 고분자 섬유를 평가 했다. 이 연구에서는 폴리머 섬유 1 달까지 동안 그들의 구조를 유지 하 고 바이러스 항목에 대 한 물리적 방 벽을 제공 하 여 항 바이러스 배달 보완 활동을 제공. 이러한 결과에서 둘 다 물리적 및 화학적 방해 바이러스 감염에 EFs를 사용할 수 있습니다 관찰 되었다.
가변 자료 속성을 고분자 EFs microbicide 배달에 대 한 매력적인 전달 플랫폼, EFs 표면 수정 건설 기계7을 다른 응용 프로그램에서 개발 되었습니다. 종종 역할 건설 기계 세포 재생22, 개선 하 고 조직 공학23,24에 그들의 유틸리티를 강화 하는 세포 외 기질 (ECM)의 형태를 모방 하기 위해 eFs 사용 되었습니다. 섬유 고분자 폴 리-ε-caprolactone (PCL) 등으로 구성 되었으며 PLLA 성장 인자와 단백질 표면 수정 후 전기를 얻으며 ECM 같은 속성 증가 세포 접착 및 확산25 를 포함 하 여 , 26. 항균 성 표면 수정 EFs 특정 병원 성 박테리아27,28의 성장을 방지 하기 위해 평가 또한. 이 다양성 및 생물 학적 효과 유도 하는 능력, EF 기술 다양 한 기계 멀티 기능을 제공 하는 분야에서 확장 하 고 있습니다. 그러나, 그들의 유틸리티 애플 리 케이 션의 다양성에도 불구 하 고 표면 수정 섬유 최근에 microbicide 필드29탐험 되었습니다 있다.
방지 하 고 성병 치료 배달 신기술 개발 병행, 새로운 생물학적 치료제 개발 되었습니다. 가장 유망한 microbicide 후보자 중 하나 접착제 항 바이러스 lectin, GRFT30입니다. 원래 빨강 조류의 종에서 파생 된, GRFT는 설명 했다 HIV, HSV-2, SARS의 강력한 억제제로 활동 뿐만 아니라 C 형 간염 바이러스31,32,,3334, 35 , 36. 사실, 생물학 기반의 억제제 중 GRFT는 가장 강력한 반대로 HIV 활동 하면서 안정성과 질에서 문화 미디어 존재 활동 연락처30, 시 거의 즉시 V-1를 비활성화 최대 10 일37미생물. 더 최근에, 0.1 %GRFT 젤 자 HSV-2 도전, 그것은 HSV-2와 에이즈-132 에 대 한 보호의 첫 번째 줄에 대 한 유망한 후보 만들기에 대 한 마우스를 보호 하기 위해 표시 했다, 38. 에이즈에 대 한 GRFT 물리적 항목38,,3940,41 방지 하기 위해 바이러스 성 봉투 표면에 gp120 또는 터미널만 노 오 스 N 연결 glycan 잔류물을 바인딩 하 여 감염을 억제 하는 특히, ,42. 이 억제는 매우 강력한 IC50s 3 ng/mL43접근. HIV 감염을 억제 하는 것 이외에 연구는 또한 보여주었다 GRFT 바이러스32의 세포-세포 확산을 억제 하 여 감염 HSV-2에 대 한 보호. 모든 경우에, GRFT 변성에 높은 저항을 시연, 바이러스 성 입자에 접착제를 되도록 표시 되었습니다. 마지막으로, GRFT 만들고 그것은 실현 가능성이 EFs와 함께 공동 관리에 도움이 테 (TFV) 및44의 다른 antivirals 조합으로 시너지 활동을 시연 하고있다. GRFT의 강력한 속성은 우수한 생물학 기반의 항 바이러스 후보자, 있는 배달 EF 기술로 향상 될 수 있도록 합니다.
GRFT의 접착제 및 타고 난 항 바이러스 속성의이 지식을 활용 하 여, 고분자 섬유 비 계 설계 되었습니다, 이러한 속성을 제공 하는 바이러스 항목 저해29의 첫 번째 계층을 통합 하. Cervicovaginal 점액 mucoadhesive mucin 상호 작용을 통해 주로 바이러스 전송 방해 하는 방법에 영감을 찾기, 우리 가정 했다 그를 발판으로 EFs를 사용 하 여 covalently GRFT의 높은 밀도와 표면 수정 GRFT 표면에 활용 된 것 수 고 entrypoint45,,4647에서 바이러스를 비활성화. 여기 EFs는 플랫폼을 제공 하는 단백질 기반, 바이러스 성 접착제 비활성화 장벽 고정 발판으로 개발 되었다. 우리를 만드는 새로운 바이러스 "함정." 생체, 대, 고 내구성 폴리머 플랫폼 GRFT의 적 정량 항 바이러스 특성을 결합 하고자
이러한 목표를 달성 하기 위해 PLGA의 구성 하는 섬유 electrospun, 그리고 EDC-보 건국 화학 GRFT와 EF 표면 그 후 수정 하는 데 사용 되었다. PLGA 전기48, 생체 적합성 및 비용 효율성에에서 그것의 광범위 한 사용 모델 폴리머 역임 했습니다. 또한, 표면 개 질 EFs의 큰 표면 영역을 이용 하 고 캡슐화 섬유 유틸리티49를 극대화 하기 위해 결합 될 수 있는 유용한 대안을 제공 합니다. 전통적인 캡슐화 방법 어디 GRFT의 일부만 사용할 수 (그리고는 FRT만 뚜렷이 제시), 달리 표면 수정 수 있습니다 가능 치료의 전체 기간 동안 최대 bioactivity를 유지 하는 GRFT 또한, 전통적인 전기 방법으로 단백질 같은 친수성 화합물의 낮은 캡슐화 효율성 및 단백질 활동50의 손실 될 수 있습니다. 따라서, GRFT 표면 수정 섬유 STI 감염에 대 한 보호 기능을 향상 하거나 전기와 함께 사용할 수 있는 유망한 대체 배달 방법을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50</td><td>Lactel</td><td>B6013-2P</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>147541000</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2</td><td>Brico Medical Supplies</td><td>BN1815</td><td></td></tr><tr><td>BD 3mL Syringe Luer-lok tip</td><td>VWR</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm (plastic film)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3671&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176</td><td></td></tr><tr><td>Griffithsin (GRFT)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>custom made, no product number</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Milipore</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris EDTA Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>3355</td><td></td></tr><tr><td>Influenza Hemagglutinin (HA)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>custom made, no product number</td></tr><tr><td>Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>custom made, no product number</td></tr><tr><td>Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)</td><td>Santa Cruz</td><td>2056</td><td></td></tr><tr><td>Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td><td>KPL</td><td>52-00-00</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections

Electrospun 섬유 (EFs) 널리 다양 한 치료 애플 리 케이 션;에 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 단지 최근에 적용 되었을으로 방지 하 고 치료 성적으로 기술 전송 감염 (STIs). 또한, 많은 EF 기술 biofunctionality를 얻으며 표면을 활용 하 여 상대적인 활성 에이전트를 캡슐화에 초점. 여기 조작 및 poly(lactic-co-glycolic) 산 (PLGA) electrospun 섬유, 강력한 항 바이러스 lectin Griffithsin (GRFT)와 표면 수정 하는 방법을 설명 합니다. PLGA는 약물 전달의 뛰어난 화학 및 생체 특성 때문에 널리 사용 된는 FDA 승인 중합체 이다. GRFT 자연, 강력한, 및 안전 lectin 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1) 형을 포함 하는 수많은 바이러스에 대 한 광범위 한 활동을 소유 하는. 결합 될 때, GRFT 수정 섬유 체 외에에이즈-1의 강력한 비활성화를 증명 하고있다. 이 원고에서는 조작 하 고 GRFT 수정 EFs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, PLGA 섬유 비 계를 만들 electrospun입니다. 섬유는 이후에 표면 수정 1을 사용 하 여 GRFT-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS) 화학. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 크기와 표면 수정 공식의 형태를 평가 하기 위해 사용 되었다. 또한, gp120 또는 조류 (하)-기반된 ELISA, 활용 된 GRFT GRFT 섬유 표면에서 탈 착의 양을 계량 하 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 섬유를 서로 다른 단백질의 다양 한 표면 수정 조작 하 더 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.

섬유 형태 바이러스에 대 한 보호를 제공 하는 표면 수정 EFs의 기능에 상당한 효과가 있다. 전기는 편리 하 고 간단한 절차, 최적화 되지 않은 폴리머 제형 불규칙 한 섬유 형태 (그림 5B-C) 발생할 수 있습니다. 파란색 또는 비정 질 매트 같은 형태학의 대형 귀착되는 전기 조건에서 변경 종종 용 폴리머 호환성, 낮은 폴리머 점도, 흐름 속?...

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Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.4K 조회수.  University of Louisville. 이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.

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Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

연구

생체공학

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

화학

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers can be used for controlled delivery of various biological agents such as small molecule drugs, cells, proteins and growth factors. The simplicity of the methodology in making IPC fibers gives flexibility in its application for controlled biomolecule delivery. Here, we describe a method of incorporating IPC fibers into two different polymeric scaffolds, hydrophilic polysaccharide and hydrophobic polycaprolactone, to create a multi-component composite scaffold. We showed that IPC fibers can be easily embedded into these polymeric structures, enhancing the capability for sustained release and improved preservation of biomolecules. We also created a composite polymeric scaffold with topographical cues and sustained biochemical release that can have synergistic effects on cell behavior. Composite polymeric scaffolds with IPC fibers represent a novel and simple method of recreating the cellular niche.

Scaffolds for tissue engineering need to recapitulate the complex biochemical and biophysical microenvironment of the cellular niche. Here, we show the use of interfacial polyelectrolyte complexation fibers as a platform to create composite, multi-component polymeric scaffolds with sustained biochemical release.

생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of this new field of biomaterials research is due to the necessity to develop implants capable of mimicking the complex functionality of the various tissues, including a continuous change from one structure or composition to another. In this latter context, one topic of main interest concerns the design of appropriate scaffolds for bone-cartilage interface tissue. In this study, three-layered scaffolds with graded pore size were achieved by melt mixing poly(lactic acid) (PLA), sodium chloride (NaCl) and polyethylene glycol (PEG). Pore size distributions were controlled by NaCl granulometry and PEG solvation. Scaffolds were characterized from a morphological and mechanical point of view. A correlation between the preparation method, the pore architecture and compressive mechanical behavior was found. The interface adhesion strength was quantitatively evaluated by using a custom-designed interfacial strength test. Furthermore, in order to imitate the human physiology, mechanical tests were also performed in phosphate buffered saline (PBS) solution at 37 &#176;C. The method herein presented provides a high control of porosity, pore size distribution and mechanical performance, thus offering the possibility to fabricate three-layered scaffolds with tailored properties by following a simple and eco-friendly route.

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

In this work, poly(lactic acid)/polyethylene glycol (PLA/PEG) scaffolds were prepared by using a combination of melt mixing and selective leaching. The method herein discussed permitted to develop three-layer scaffolds by highly controlling both porosity and pore size. The mechanical properties were also evaluated in a physiological environment.

손쉬운 및 환경 친화적 인 경로는 그레이드 기공 크기와 폴리 (젖산) 공사장 공중 발판을 제조

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by viral gene transfer into T cells. The current gold standard of viral gene transfer involves spinoculation of retronectin-coated plates, which is expensive and time-consuming. There is a significant need for efficient and cost-effective methods to generate CAR-T cells. Described here is a method for fabricating inexpensive, dry macroporous alginate scaffolds, known as Drydux scaffolds, that efficiently promote viral transduction of activated T cells. The scaffolds are designed to be used in place of gold standard spinoculation of retronectin-coated plates seeded with virus and simplify the process for transducing cells. Alginate is cross-linked with calcium-D-gluconate and frozen overnight to create the scaffolds. The frozen scaffolds are freeze-dried in a lyophilizer for 72 h to complete the formation of the dry macroporous scaffolds. The scaffolds mediate viral gene transfer when virus and activated T cells are seeded together on top of the scaffold to produce genetically modified cells. The scaffolds produce &gt;85% primary T cell transduction, which is comparable to the transduction efficiency of spinoculation on retronectin-coated plates. These results demonstrate that dry macroporous alginate scaffolds serve as a cheaper and more convenient alternative to the conventional transduction method.

Herein is a protocol for creating dry macroporous alginate scaffolds that mediate efficient viral gene transfer for use in genetic engineering of T cells, including T cells for CAR-T cell therapy. The scaffolds were shown to transduce activated primary T cells with &gt;85% transduction.

T 세포의 바이러스 형질도입을 위한 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드의 제조 및 사용

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

<meta charset="utf8"></head><body>세포 배양 삽입물에 대한 FN-Silk Membranes의 형성 및 부착

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using tissue culture inserts with a plastic membrane, which generates an apical and a basal side. Besides providing support for the cells, these membranes come far from emulating their native counterpart, the basement membrane, which is a nanofibrillar, protein-based matrix. In this work, we show a simple way to considerably improve the biological relevance of the tissue culture inserts by replacing the plastic membrane with one made from a pure recombinant functionalized spider silk protein. The silk membrane forms through self-assembly and will spontaneously adhere to a membrane-free tissue culture insert, where it can provide support for cells. Custom-designed tissue culture inserts can be printed using a standard 3D printer, following the instructions provided in the protocol, or commercial ones can be purchased and used instead. This protocol shows how the culture system with silk membranes in inserts is set up and, subsequently, how the same cell culturing techniques that are used with traditional, commercially available inserts can be implemented.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Enhancing In Vitro Cell Culture Models with Recombinant Functionalized Spider Silk Membranes

Tissue culture inserts with plastic membranes are the golden standard in cell culture labs as permeable supports to establish cell layers and models of barrier tissues. Herein, we present a simple method to replace the plastic membrane with a more biologically relevant membrane made from a recombinant functionalized spider silk protein.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...