Name: high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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캠핑카 작업 로슈 박사 친목 (2014-2017)에 의해 지원 되었다.

이 연구에 대 한 윤리적인 승인을 연방 식품 안전 및 스위스의 수의 사무실에 의해 제공 되었다. 모든 동물 실험 엄격한 준수 평가 및 인증의 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC)에 대 한 협회의 규칙에 따라 뿐만 아니라 동물 보호 및 복지에 스위스 연방 조 례에서에서 실시 되었다.
 1. 세대의 두뇌 Free-floating 섹션 <ol><li>최적의 샘플 품질을 보장 하기 위해, 2 %paraformaldehyde (PFA)의 신선한 솔루션에서에서 준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)는 관류의 날. 
	주의: PFA 적당히 피부 접촉 및 가능한 발암 물질에 의해 독성이 있다. 니트 릴 글러브를 사용 하 여 처리 PFA 화학 증기 두건에서 솔루션을 준비 하.
	<ol><li>60 mL 동물 당 PFA 솔루션의 준비.</li>
		<li>가져와 PFA 180-200 µ L의 PBS의 모든 100 ml 5 M 코 솔루션으로 pH를 증가 하 고 60까지 솔루션을가 열 하 여 솔루션에 ° c. 
		참고: NaOH 사용 하지 않아야 고정 시 조직 보존에 부정적인 영향을 그것으로.</li>
		<li>솔루션 식 실내 온도 내려와 pH 7.4 HCl. 여과기를 사용 하 여 아래로 필터 종이 사용 하 여 솔루션 (재료의 표 참조).</li>
	</ol></li> <li>일부 수정 앞에서 설명한 15 transcardial 관류를 통해 전체 마우스 고정을 수행. 먼저, 맥 관 구조 사용 하 여 PBS의 20 mL에서에서 혈액을 플러시 후 2%의 40 mL와 함께 perfuse PFA.</li>
	<li>앞에서 설명한 15 두개골에서 뇌 제거.</li>
	<li>담가 갓 2 %PFA 끼얹는다 뇌에 2%의 20 mL PFA 후 고정을 위한 4 ° C에서 7 h. 
	참고: PFA에 외피를 증가 권장 하지 않습니다 그것은 세포내 구조의 검색을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>광범위 하 게 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 두뇌 세척.</li>
	<li>Agarose에서 머리를 고정 하는 소스.
	난방을 위한 전자 레인지를 사용 하 여 PBS에 <ol><li>준비 3 %agarose 솔루션. 부드럽게 아래로 냉각 응고를 방지 하는 솔루션을 소용돌이.</li>
		<li>플라스틱 용기에서 agarose 솔루션에 집중 하기 전에 뇌 주위 PBS의 과잉에서 건조. 공기 방울을 제거 하려면 agarose 안에 두뇌를 회전 합니다. 얼음에 그것을 냉각 하 여 응고 agarose 허용</li>
		<li>신중 하 게 플라스틱 용기에서 agarose 블록을 제거 하 고 면도날을 사용 하 여 뇌 주위 큐브를 잘라. Vibratome 견본 홀더에 두뇌를 탑재 (재료의 표 참조) cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 (재료의 표 참조). 단면으로 진행 하기 전에 응고 접착제에 대 한 충분 한 시간.</li>
	</ol></li> <li>PBS 가진 vibratome 버퍼 트레이 견본 홀더 뇌 가득 전송. vibratome를 사용 하 여 100 µ m 뇌 조각 (화살 또는 코로나) 섹션. 이전 PBS 가득 6 잘 플레이트에 뇌 섹션을 수집.</li>
	<li>마무리 뇌 단면에 따라 신중 하 게 PBS를 제거 하 고 PBS/글리세롤의 1:1 솔루션으로 대체.</li>
	<li>저장 섹션 PBS/글리세롤에-20 ° c.</li>
</ol> 2. 셀 또는 세포 기관이 면역 형광 염색 법에 의해 라벨 <ol><li>신중 하 게 전송 뇌 섹션 24-잘 접시의 우물에 이전 가득 잘 당 PBS의 500 µ L. 섹션 같은 우물에서 절차의 끝에 때까지 유지 됩니다.</li>
	<li>부드러운 동요에서 5 분에 대 한 PBS의 500 µ L로 두 번 섹션 린스.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 동시 차단 및 뇌 조각의 permeabilization.
	PBS에서 <ol><li>준비 0.3% 차단과 permeabilization 솔루션 트리톤 X 및 10% 당나귀 세럼. 
		참고: 당나귀 혈 청 사용 특정 이차 항 체의 호스트 종에 맞게 염소 혈 청으로 대체 될 수 있다.</li>
		<li>부드러운 동요에서 실 온에서 1 h에 대 한 차단 및 permeabilization 솔루션의 250 µ L 섹션을 품 어.</li>
	</ol></li> <li>솔루션을 제거 하 고 추가 5% 당나귀 혈 청 및 (예를 들어, 1:1, 000에 1: 100)는 적합 한 희석에서 1 차적인 항 체를 포함 하는 PBS 솔루션. 부드러운 동요에서 4 ° C에서 밤새 품 어. 
	참고: 성공적으로이 프로토콜 NVU의 다른 세포 유형을 분류 하는 항 체의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오. 1 차 항 체의 최적의 희석은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 다른 항 원의 동시 라벨에 대 한 동일한 솔루션에 있는 모든 기본 항 체 희석. 모든 1 차 항 체는 다른 종에서 발생 되어야 합니다. 항 체 침투를 개선 하기 위해, 샘플 수 있습니다 알을 품을 72 h에 대 한 4 ° c.</li>
	<li>제거 항 체 솔루션 및 세척 섹션 실 온에서 부드러운 동요에서 PBS에 10 분 동안 3 번. PBS를 제거 하 고 250 µ L PBS 솔루션 포함 5% 당나귀 혈 청 및 적절 한 종의 붙일 이라는 2 차 항 체를 추가. 섹션 부드러운 동요에서 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
	<ol><li>이 프로토콜을 사용 하는 2 차 항 체의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>실 온에서 부드러운 동요에서 PBS에 세 번 10 분 대 한 항 체 솔루션 및 세척 섹션 제거.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 4의 250 µ L를 추가 &#39;, 1 µ g/mL의 최종 농도 가진 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션. 부드러운 동요에서 10 분 동안 실내 온도에 섹션을 품 어. PBS 가진 5 분 동안 3 번 DAPI 솔루션 및 세척 섹션 제거.</li>
	<li>현미경 슬라이드 (예를 들어, 조직-본드 유리 슬라이드) 본딩에 뇌 섹션을 탑재 합니다. 조심 스럽게 초과 PBS 슬라이드에 섹션 주위 제거. 설치 매체의 한 방울을 추가 (재료의 표 참조) 신중 하 게 뇌 섹션의 상단에 커버 0.17 mm (제 1.5) 붕 규 산 유리 coverslip.
	<ol><li>샘플 이미지 수집 수행까지 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol></li></ol> 3. 혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 이미징 <ol><li>레이저 스캔 적합 한 수행 이미지 수집 confocal 현미경 (재료의 표 참조) 레이저 라인 405, 488, 561와 633 nm의 여기에 대 한 빛의 스펙트럼의, 녹색, 오렌지, 파란색과 빨간색 영역에 fluorophores. 1.4의 조리개 수치와 이미지 수집, 사용 기름 목표 X 63.</li>
	<li>인수에는 현미경을 제어 하는 소프트웨어의 메뉴 이미지 수집 매개 변수를 설정. 드롭 다운 메뉴에서 &#8216; 이미지 크기 &#8217;, 1024 x 1024 픽셀의 값을 선택 합니다. 수정 픽셀 크기의 값을 조정 하 여 200, 300 nm 사이의 값으로는 &#8216; 줌 &#8217; 메뉴. &#8221; 참고: 세포내 구조 분석에 대 한 75 픽셀 크기를 줄일 수 nm. 이 이미지 크기 설정을 대폭 획득 시간을 증가 하 고 512 x 512 픽셀 작은 시야를 영상 획득 시간 감소를 줄일 수 있다.</li>
	<li>에는 &#39; 수집 속도 &#39; 400 Hz의 값 즉, 400 초당 라인 선택 드롭-다운 메뉴. 에 &#39; 시스템 설정 & #39; 선택 메뉴는 &#39; 픽셀 깊이 &#39; 드롭 다운 메뉴, 그리고 12 비트에 값을 변경.</li>
	<li>현미경 소프트웨어에서 내는 &#39; 인수 &#39; 탭, 순차적 프레임 인수에 대 한 옵션에 토글. 값을 수정 하 여 광학 섹션 두께 0.75와 각 채널에 대해 1 µ m 사이의 값으로 설정 된 &#39; 홀 &#39; 메뉴.</li>
	<li>형광 여기 패널에서 최적의 샘플 예 488 nm 레이저 라인 녹색 발광 fluorophore fluorophores 흥분 하 필요한 레이저 활성화. 
	참고: fluorophore 스펙트럼 뷰어 사용 하 여 (테이블의 자료 참조) 여기 적절 한 레이저를 선택 하.</li>
	<li>510 및 550 nm 녹색 발광 fluorophore 대 사이의 예 각 채널에 측정 될 것 이다 파장 선택 슬라이더를 이동 하는 형광 검출에 대 한 패널에. 
	참고: fluorophore 스펙트럼 뷰어 사용 하 여 (재료의 표 참조) 적절 한 검출 파장 선택.</li>
	<li>는 굴절률 유리 coverslip와 목표에 맞게 두뇌 섹션 coverslip 위에 1.52의 굴절률을 가진 침수 오일 한 방울을 추가 합니다. 샘플 현미경에 놓고 현미경 쌍안경을 사용 하 여 샘플을 시각화 하기 위해 epifluorescent 램프를 켭니다.</li>
	<li>현미경 스탠드에 버튼을 사용 하 여 변경 필터 휠을 DAPI 스테인드 핵을 시각화에 대 한 적절 한 필터를 선택 합니다. 조 악한 초점을 사용 하 여 초점으로 DAPI 스테인드 핵에서 신호 하기.</li>
	<li>혈관 마커 (예: CollagenIV 또는 CD31)에서 신호를 시각화 하 고 개별 모 세관 세그먼트에 보기의 필드 센터 필터 변경 단추를 사용 하 여 현미경 스탠드에.</li>
	<li>라이브 스캔 모드를 시작 하려면 버튼을 누릅니다. 스캔 하는 동안 이미지의 동적 범위를 극대화 하 고 픽셀 채도 피하기 위해 각 채널에 대 한 이득 및 레이저 강도 조정. 
	참고: 레이블 포화 픽셀-채도 시각적으로 평가 하는 조회 테이블을 사용 합니다. 신호-채도 방지 하려면 높은 형광 신호를 것으로 예상 되는 샘플 설정을 조정.</li>
	<li>설정 2 평균 라인에 대 한 값. 
	참고: 높은 수집 속도 사용할 때 소음을 줄이기 위해이 값을 늘립니다.</li>
	<li>구축 시작 하 고 모 세관의 전체 볼륨에 걸쳐 있는 광 z 스택 수행에 대 한 섹션을 종료. 0.45 μ m의 단계 크기를 사용 하 여. 
	참고: 이미지 후속 정량화에 사용 될 경우 완전 한 데이터 집합에 대 한 동일한 수집 설정을 유지.</li>
	<li>정량화에 대 한 통계적 비교에 대 한 적어도 3 개의 다른 마우스에서 섹션 당 10 ~ 20 z-스택 확보. 
	참고: 샘플 표백 및 레이저 강도 변동에서 발생 하는 변화를 줄이기 위해 동일한 세션에서 전체 데이터 집합을 확보.</li>
</ol> 4. 이미지 처리와 3D 재건 Neurovascular 단위 <ol><li>(선택 사항) 인수 z 스택의 축 해상도 증가, 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터 집합이 deconvolution 수행 (테이블 자료 참조 ).
	<ol><li>Deconvolution 소프트웨어에서 수행 하기 위해 설정을 변경 &#34; 장 님 &#34; deconvolution, (즉, 적응형 포인트 확산 함수를 사용 하 여).</li>
		<li>Deconvolution 소프트웨어 설정, 배경 제거;에 대 한 옵션에 토글이이 옵션은 이미지 스택에 작은 강도 값에 이미지의 모든 픽셀의 강도 값에서 뺍니다.</li>
		<li>Deconvolution 소프트웨어 설정에서 rescaling 강도 대 한 옵션을 전환 하 고 16 비트 깊이; 크기 조절이 옵션 것 원래 강도 값과 이미지의 동적 범위.</li>
		<li>의 메뉴에 &#39; 굴절률 &#39;, 1.52로 값을 설정. 에 &#39; 설정 파장 &#39; 메뉴를 선택 각 이미지 채널에 대 한 값을 방출. 예를 들어 녹색 발광 fluorophore에 대 한 선택.</li>
	</ol></li> <li>시각화 및 3 차원 데이터 세트 (재료의 표 참조)의 분석에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터 집합을 엽니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 눌러는 &#34; Surpass &#34; 모 세관의 3D 볼륨 렌더링 하는 단추.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어에에서는 &#34; 추가 새로운 표면 &#34; 세그먼트에 모 세관 표면 버튼. 아래쪽 화살표를 사용 하 여 표면 생성 마법사의 단계에에서 사이 이동.
	<li><ol>에는 &#39; 만들기 &#39; 탭 모 세관 표시, 예를 들면 CollagenIV와 함께 채널 소스 채널을 설정 하 고 0.5 µ m의 값을 노출 영역 세부 설정. 
		참고: 후자의 옵션 이미지에 가우시안 필터를 적용 하 고 표면의 부드러움을 결정 합니다.</li>
		<li>에는 &#39; 만들 &#39; 탭, 절대 강도 임계값 옵션에 토글. 
		참고:이 옵션 이미지에서 선택 된 채널의 절대 강도에 따라 마스크를 생성 하 여 서피스를 생성 합니다.</li>
		<li>표면 만들기 마법사에서 다음 단계에 렌더링 된 마스크 커버 이미지에서 전체 모 세관까지 강도 히스토그램에서 슬라이딩 윈도우를 이동 하 여 표면에 대 한 낮은 강도 임계값을 조정. 각 데이터 집합에 대 한 경험적으로이 매개 변수에 대 한 값 범위를 확인.</li>
		<li>표면 작성 마법사의 마지막 단계에서 아래 드롭 다운 메뉴에서 클릭 합니다 &#34; 필터 유형 &#34; 옵션을 선택 하 고 &#39; 복 수 &#39;. 2.0e5 1.0e5 사이의 값으로 복의 최소 수를 설정. 
		참고:이 옵션 표면 복, 프레임의 가장자리에 모세의 예를 들어 작은 세그먼트의 작은 수를 제외 합니다.</li>
		<li>표면 만들기 마법사를 완료 하 고 클릭 하 여 생성 매개 변수를 저장 &#34; 매개 변수 기억 &#34; 표면 메뉴의 다시 탭에서.</li>
		<li>첫 번째 이미지에 사용 되는 매개 변수 집합을 로드 하 여 데이터 집합을 이미징 하는 전체에 대 한 절차를 반복 합니다. 각각, 임계값, 강도와 최소한의 배경 강도 및 모 세관 형태, 차이 대 한 계정에 각 이미지에 대 한 복에 대 한 매개 변수를 조정.</li>
	</ol></li> <li>세포내 나노미터 구조 (예, 면역 글로불린 가득 endosomes) 세그먼트, 먼저만 모 세관 내에서 형광 신호를 포함 하는 새 채널을 만듭니다. 
	참고:이 프로세스 단계 4.3 <ol><li>선택에서에서 만든 모 세관 표면을 사용 하 여 마스크를 생성 하 여 관심의 영역을 정의 것입니다는 &#39; 편집 &#39; 메뉴는 &#39; 모 세관 표면 &#39; 패널. &#39; 속성을 마스크 &#39;, 클릭 &#34; 마스크 모든 &#34;. 로 세포내 소포 신호를 포함 하는 채널 선택은 &#39; 소스 채널 &#39; 옵션에 토글 &#34; 마스크를 적용 하기 전에 채널을 복제 &#34;.</li>
		<li>에는 &#39; 마스크 설정 &#39; 열, 선택 &#34; 지속적인 내부/외부 &#34; 및 &#34; 복을 외면 설정: &#34; 0.00을 값을 설정 하 고. 
		참고:이 프로세스 모 세관 마스크 외부 모든 복 0 강도 값을 할 것 이다 하는 이미지에는 추가 채널을 만들어집니다. 계량 (즉, 뇌 실질에) 모 세관 외부 이벤트를 선택 &#34; 복 표면 내부 설정: &#34; 0.00을 값을 설정 하 고.</li>
		나노미터 구조를 세그먼트, 시작 버튼을 누르면 <li>는 &#34; 새로운 관광 명소 추가 &#34; 마법사. 아래쪽 화살표를 사용 하 여 표면 생성 마법사의 단계에에서 사이 이동.</li>
		<li>만들기 탭에서 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 &#34; 소스 채널 &#34; 단계 4.4.4에서에서 만든 세포내 마스크 채널 선택.</li>
		<li>만들기 탭에서 아래는 &#34; 탐지 자리 &#34; 섹션, 예상된 XY 직경 0.5와 소포에서 관찰의 평균 크기에 따라 1 µ m 사이의 값으로 설정 실험입니다. 이 옵션 세그먼트화 알고리즘에 의해 검출 될 것 이다 가장 작은 크기를 결정 합니다.</li>
		<li>만들기 탭에서 아래는 &#34; 탐지 자리 &#34; 섹션에 대 한 옵션에 토글 &#34; 배경 빼기 &#34;. 
		참고:이 옵션 (단계 4.4.7에서에서 선택한 값)에서 0.75 자리 반지름의 가우스 필터와 이미지를 부드럽게 것 이다 고 0.88 자리 반경으로 필터링 원본 이미지 가우스의 강도 뺀 다음.</li>
		<li>에는 &#39; 만들 &#39; 탭, 아래에 있는 드롭다운 메뉴를 눌러 &#39; 필터 유형 &#39; 선택 &#34; 품질 &#34;. 참고가 관광 명소의 중심에 강도에 따라 임계값을 적용 하 여 이미지를 세그먼트 것입니다. 걸쳐 슬라이딩 윈도우를 이동 하 여 낮은 강도 임계값을 조정에 &#39; 품질 &#39; 식별 소포의 대부분 표시 될 때까지 막대 그래프. 
		참고:이 매개 변수에 대 한 값의 범위는 각 데이터 집합에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가.</li>
		<li>자리 만들기 마법사를 완료 하 고 버튼을 눌러 생성 매개 변수를 저장 &#34; 매개 변수 기억 &#34; 표면 메뉴의 다시 탭에서.</li>
		<li>첫 번째 이미지에 사용 되는 매개 변수 집합을 로드 하 여 데이터 집합을 이미징 하는 전체에 대 한 절차를 반복 합니다. 조정에 대 한 매개 변수는 &#39; 품질 강도 임계값 &#39; 배경 강도 차이 대 한 계정에 각 이미지에 대 한.</li>
	</ol></li></ol> 5. BBB에서 세포내 수송의 정량화 <ol><li>계량 (µ m 3)에서 볼륨 및 모 세관 세그먼트의 (µ m 2)에 지역. 분석 소프트웨어에서 단계 4.3에서에서 만든 혈관 표면의 통계 패널을 액세스. 선택은 &#39; 상세 &#39; 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 선택 하 고 탭, &#34; 모든 값 &#34; 볼륨 및 지역에 대 한 값을 찾을 수.</li>
	<li>계량 모 세관 세그먼트 내의 소포 수 있습니다. 분석 소프트웨어에서 단계 4.4에서에서 만든 관광 명소의 통계 패널을 액세스. 선택은 &#39; 전체 &#39; 이미지에 관광 명소의 총 수의 값을 찾을 수 탭.</li>
	<li>각 이미지에 대 한 모 세관 볼륨당 vesicles의 수를 계산 하려면 볼륨 단계 5.1에서에서 계산에 의해 관광 명소의 수를 정상화. 모 세관 볼륨의 1000 µ m 3 당 소포 수 1000이이 값을 곱합니다.</li>
	<li>모 세관 내에서 총 강도 계량 하 전체 이미지 다음 4.3 다음 수정 단계에 설명 된 지침을 포함 하는 새 화면을 만듭니다. 소스 채널 관련 신호 (예를들면, mIgG)를 포함 하는 채널을 선택 하 고 5 µ m 영역 세부 수준 값 설정. 전체 이미지를 포함 하는 표면, 만들려고 낮은 강도 임계값의 값을 0 설정.</li>
	<li>분석 소프트웨어에 액세스 통계 단계 5.4에서에서 만든 표면. 선택은 &#34; 상세 &#34; 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 선택 하 고 탭, &#34; 모든 값 &#34;. 에 대 한 값을 기록 &#39; 강도 합계 &#39; 관심;의 채널에 대 한 이 매개 변수는 모든 픽셀 개별 휘도 값의 합에 해당. 
	참고: 세포내 신호에 대 한이 복 외면을 0.0으로 설정 된 중복된 채널에 해당 합니다. 이 복 0.0으로 설정 하는 표면 내부와 복제 된 채널에 해당 하는 뇌 실질에 신호에 대 한.</li>
	<li>각 이미지에 대 한 모 세관 볼륨 당 형광 강도 계산 하는 단계 5.1에서에서 계산 볼륨에 의해 강도 정상화. 1000 모 세관 볼륨의 1000 µ m 3 당 형광 강도 값을이 값을 곱합니다. 
	참고: 뇌 실질에 형광 신호에 대 한 모 세관 볼륨 마이너스 총 이미지 볼륨 값을 정상화 하 고 뇌 실질의 1000 µ m 3 당 총 강도를 1, 000을 곱합니다.</li>
	<li>전체 데이터 집합에 대 한 절차를 반복 하 고 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터의 통계 분석을 수행.</li>
</ol>

<ol>
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J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging.">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li><li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier:+are+they+related+to+permeability.">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li></ol>

저자는 로슈에 의해 유료 취업을 받고 있다.

위에서 설명한 프로토콜 BBB의 고해상도 현미경 뇌 부동성 섹션, immunofluorescent 얼룩, 이미지 수집 및 분석 매개 변수의 준비를 설명 합니다. 이 방법은 최근 항 체 전달 플랫폼3, BBB17에서 내 생 적인 IgG의 교통과 pericyte 손실18시 BBB의 이종의 지역화를 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 프로토콜의 다른 단계는 실험의 특정 목표에 맞게 수정할 수 있습니다. 첫째, 두께 (100 µ m) 단면도 사용 하 여 immunostaining 및 설치 절차 동안 그들의 처리를 촉진 한다. 그것은 또한 모 세관 네트워크 neurovascular 단위의 3 차원 재구성 및 모 세관 및 NVU 횡단면의 세대에 대 한 수 있습니다. 그러나, 조직 섹션 내에서 항 체의 다를 수 있습니다 그리고 일부 항 체 얼룩이 지는 coverslip 주변 조직의 표면 층을 제한할 수 있습니다. 프로토콜은 permeabilization 단계 동안 세제의 농도 또는 permeabilization 단계 조직으로 항 체 침투 개선의 길이 증가 하 여 수정할 수 있습니다. 둘째, 이미지 품질 이미지 산란으로 굴절율 불일치에서 광학 착오 인 조직 (표면 아래 일반적으로 20 ~ 30 μ m) 내의 깊은 시도할 때 손상 될 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 삭제 하는 조직과 활성 항 체 침투20 에 대 한 새로운 방법이이 프로토콜 조직의 이미지 더 큰 볼륨을 함께 결합할 수 있습니다. 셋째, deconvolution 축 해상도의 이미지를 개선 하기 위해 이미지 수집 후 수행 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 장 님 deconvolution 알고리즘의 선택은 (i) 그것의 사용의 용이성, 포인트 확산 함수의 아무 사전 계산은이 기반 필요, 이미지 품질21, 그리고 (iii) mIgG에의 부족을 개선 하기 위한 (ii) 그것의 견고성 구현 후 세포내 구조입니다. 세포내 구조 샘플에 시각에 따라 다른 deconvolution 알고리즘 높은 이미지 품질에서 발생할 수 있습니다. 다음 참조21,22 장점과 이미지 deconvolution 추가 알고리즘의 한계에 대 한 광범위 한 토론을 제공 합니다. 마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 3 개 차원에서 모세 혈관과 세포내 구조의 세분화를 허용. 명확 하 게 이미지 분석 프로토콜 및 대체 패키지 참조23에서 설명 하는 예 하에 설명 하는 소프트웨어를 제한 하지 않습니다, 그리고 세그먼트 이미지를 사용할 수 있습니다. 이미지 세분화의 정확도 평가 하 여 BBB 통해 세포내 구조 분석에 대 한 다른 소프트웨어 프로그램의 적합성을 실험적으로 확인 되어야 한다.
이 메서드는 고정 된 샘플에 기반을, 그것은 BBB에 걸쳐 transcytosis의 역학에 대 한 직접적인 정보를 제공 하지 않습니다. 그러나, 그것은 결합 될 수 있다 시간 과정 실험24, 예를 들어 정 맥 주입의 분자 재구성의 활동을 주입 후 다른 시간 지점에서 BECs 내의 그것의 축적을 측정 하 여 세포내 수송입니다. 이 방법의 장점은18, 현재 intravital 라이브 이미징 접근에 액세스할 수 있는 같이 깊은 두뇌 지구의 분석에 대 한 허용 한다. 프로토콜 중 중요 한 단계는 조직 고정의 주의 깊은 모니터링. 고정 4 %PFA 극적으로 세포내 세포와 생 또는 주변 관리 면역 글로불린17 (그림 1B)의 immunogenicity 감소 시킨다. 이 프로토콜의 한계의 요구-고품질 항 체의 (즉, 낮은 일반적인 얼룩, 낮은 분) 면역 형광 검사에 적합 이다. 같은 시 약을 사용할 수를 제공 관심사의 어떤 단백질의 세포내 지역화 조사 메서드를 적용할 수 있습니다. 예를 들어 프로토콜 뇌 내 피 세포17리소좀을 식별 하기 위해 사용 되었다. 이 프로토콜은 confocal 현미경 검사 법에 기반을, 측면 해상도 회절에 의해 제한 됩니다을 약 175 ~ 250 보다 작은 구조를 확인할 수 없는도 주목 한다 nm (그림 2).
이전 연구는 confocal 현미경 검사 법25,26를 사용 하 여 혈관 단위의 세포 구성의 상세한 분석을 수행 했습니다. 그러나, 전송 전자 현미경 검사 법19,,2728의 사용에 주로 의존 BBB에서 세포내 수송을 조사 합니다. 이 메서드는 세포내 구조의 높은 측면 해상도 제공 합니다, 전자 현미경 낮은 처리량을 가진 도전적인 기술 남아 있다. 또한, EM에 의해 구상 될 수 있는 다른 분자 대상의 수는 매우 제한 됩니다. 이 프로토콜 BBB에서 세포내 수송을 조사 하는 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 5 ~ 6 일에 이미지 분석, 뇌 컬렉션에서 완전 한 절차를 수행할 수 있습니다. 적합 한 항 체를 사용할 수 있는 경우 면역 형광 같은 샘플 내의 여러 세포 유형/분자의 동시 탐지를 허용 한다. 또한이 프로토콜 공간 해상도29에 한계를 극복 하기 위해 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술로 결합 될 수 있었다. 전반적으로, 위에서 설명한 프로토콜 변화 neurovascular 단위 내의 관심사의 단백질의 세포내 지역화에 정량화를 수 있습니다. 다른 유전자 또는 약리학 물결에 대 한 응용 프로그램 비보에BBB의 세포내 구조 및 전송 기능을 조사 하는 수 있게 됩니다.

혈액-뇌 장벽 (BBB) 연속 세포 장벽입니다 이다, pericytes, 신경 세포, 내 피 세포에 의해 형성 된 혈액 순환1에서 중앙 신경 조직 (CNS)를 분리 하는. BBB에 걸쳐 교통 규제 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할을 담당 하 고 뇌 내 피 세포 (BECs)의 특수 속성에 의해 중재. BECs transcytosis의 낮은 기초 율 사이 꽉 세포 접합의 존재의 혈액을 매개로 분자, 각각2paracellular 및 transcellular 전송을 제한 합니다. 최근, transcytosis 통로 BECs에 뇌3,4치료 큰 분자의 납품을 강화 밝혀 되었습니다 있다. 그러나, BBB에 걸쳐 transcytosis 메커니즘 아직 되지 않은 완전히 특징이5,6.
광범위 한 작업에서 체 외에서 세포 및 분자 메커니즘 BECs7,,89,10, 를 통해 세포내 전송 규제를 해독 완료 되었습니다 11, 하지만 이러한 시스템 복잡 한 건축과 혈관 단위 (NVU)의 생리학 정리 하지. 다른 한편으로, 학문 vivo에서12,13 BBB에서 전송 속도에 상세한 양적 정보를 제공 하지만 전송의 세포내 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 NVU의 세포와 세포내 구성 요소 조사 vivo에서 ex vivo 남아 있다 매우 도전적인14. 기술의 제한 된 수만 세포는 NVU의 subcellular 구조를 분석 하는 의무가 있습니다. 대부분의 연구는 전자 현미경 검사 법을 사용 하지만이 기술은 적절 한 조직 준비 및 샘플 처리에 필요한 복잡 한 프로토콜에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 뇌 샘플의 처리, 분석, 그리고는 NVU의 세포 내 subcellular 구획의 정량화를 촉진 것이 높은 해상도 confocal 현미경 기반 방법론 설립.
여기, 우리는 BBB와 세포 및 subcellular 수준의 NVU의 양적 이미징 수행을 마우스 뇌 부동성 섹션을 이용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 테스트 하 고 이미지와 3 차원에서 NVU 재구성에 항 체의 수를 확인. 또한,이 프로토콜 뇌 모세 혈관 내에서 세포의 최대 광학 회절 제한 된 해상도 이미지를 수 있습니다. 이미지 분석, 함께 neurodegeneration의 마우스 질병 모델에 예를 들어 다른 실험 조건 하에서 BBB에서 고분자의 세포내 수송을 조사 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals</td><td>MCA2388</td><td>Labels Brain Endothelial Cells&lt;br/&gt; Use at dilution 1:100&lt;br/&gt; detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody against Podocalyxin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1556</td><td>Labels Lumen of capillaries&lt;br/&gt; Use at dilution 1:100&lt;br/&gt; detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>Labels Basement membrane of capillaries&lt;br/&gt; Use at dilution 1:100&lt;br/&gt; detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td></tr><tr><td>Goat polyclonal antibody against CD13</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2335</td><td>Labels pericytes&lt;br/&gt; Use at dilution 1:100&lt;br/&gt; detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Labels Astrocytes&lt;br/&gt; Use at dilution 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal antibody against Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Labels Microglia&lt;br/&gt; Use at dilution 1:100&lt;br/&gt; detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td></tr><tr><td>Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Labels Lysosomes&lt;br/&gt; Use at dilution 1:100&lt;br/&gt; detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td></tr><tr><td>donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Use at dilution 1:400</td></tr><tr><td>donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Use at dilution 1:400</td></tr><tr><td>goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Use at dilution 1:400</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman prepleated qualitative filter paper&lt;br/&gt; Grade 0858 1/2, grained</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Fluorescent Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako fluorescent mounting medium</td></tr><tr><td>Adult mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>C57BL/6J male or female mice&lt;br/&gt; between 9 and 19 months of age</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S vibrating blade microtome</td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X with HyD detectors&lt;br/&gt; and White light laser</td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Bitplane scientific software</td><td>NA</td><td>Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64</td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science&lt;br/&gt; /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis

혈액-뇌 장벽 (BBB) 순환과 두뇌 사이 분자의 수송을 조절 하는 동적 다세포 인터페이스입니다. BBB 걸쳐 Transcytosis 뇌 실질에 호르몬, 대사, 그리고 치료 항 체의 납품을 통제 한다. 여기, 선물이 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 시각화 subcellular 세포 BBB에서 내 피 세포 내에서 면역 형광 검사 무료-부동 섹션의 결합 하는 프로토콜. 이 데이터 집합을 결합 하 여 3D 이미지 분석 소프트웨어와 함께 반자동된 세분화 및 모 세관 볼륨의 정량화 표면 영역으로 개수와 BBB에서 세포내 세포의 강도 대 한 수 있습니다. 세포내 소포 및 그들의 정량화는 BBB에서 내 마우스 생 면역 글로불린 (IgG)의 검출 방법을 설명 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 다른 분자 비보의 BBB transcytosis를 제어 하는 메커니즘의 수사에 적용할 수 있습니다.

이미지의 대표적인 예는 여기에 설명 된 프로토콜에서 얻은, 마우스 뇌 섹션 지하실 막, 이다, pericytes, NVU의 다른 구성 요소를 인식 하는 항 체로 얼룩진 했다 그리고 내 피 세포 (참조 사용 하는 특정 항 체에 대 한 테이블의 자료 ) (그림 1A, D, 및 전자). 에이 해상도 개별 astrocytic 프로세스와 모세와 직접 접촉에 있습니다-발 끝을 구별 하는 것이 가능 하다.
세포내 구조를 탐지 하기 위한이 프로토콜의 적합성을 강조 하기 위해 주변16 인간의 안티 타우 mAb86 항 체 주사는 동물에서 뇌 섹션 붙일 이라는 반대로 인간 항 체 ( 물 했다 그림 1B). mAb86는 특히 대상 뉴런 타우16의 병 적인 형태를 표현으로 알려져 있다. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, mAb86 신경 (그림 1B-C) 내에서 개별 나노미터 구조 내에서 회절 제한 된 해상도 감지 되었습니다. 또한, 내 피 세포에서 세포내 구조 pericytes (D-E 그림 1및 그림 2)에 생 마우스 IgG 검색 되었습니다.
뇌 맥 관 구조의 고해상도 confocal z 스택의 인수 모세 혈관과 세포내 소포 BBB에서의 3 차원 세그먼트화 할 수 있습니다. 렌더링 및 모 세관 CollagenIV와 마우스 igg가 양성 이라는 분단의 과정의 예를 그림 2 에 세포내 소포. 예 모 세관 볼륨 당 소포 수를 측정 하 여 분할 된 이미지의 전체 데이터 집합을 측정, 여 다른 조건 하에서 세포내 전송 프로세스에 변화를 공부 하는 가능 하다. 그림 3 B C mIgG 소포 번호와 형광 강도 해당 하는 뇌 실질에 mIgG 각각, 이전에 보고 된 로 pdgf bret/ret 마우스 모델에서 pericyte 고갈 시 차이점을 보여 줍니다. 17. 동일한 접근 했다 또한 최근 서로 다른 뇌 영역18사이 BBB에서 세포내 수송에 대 한 변경 내용을 분석 하는 데 사용 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
그림 1: 여러 종류의 subcellular 구조는 혈관의 Labelling 장치 혈관 단위 (A 와 D)와 세포내 소포 신경 (B)에 포함 된 또는이 프로토콜으로 얻은 내 피 세포 (E)의 대표 이미지. A (위)에 최대 강도 프로젝션 이미지 (녹색) CollagenIV에 의해 표시 하는 모세 혈관을 둘러싼 GFAP 양성 이다 (빨간색)의 분포를 보여줍니다. 화살표는 개별 astrocytic 프로세스를 가리킵니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 에이 해상도 개별 사이토 프로세스 및 끝 발 명확 하 게 볼 수 있습니다, 박스형된 지역 (아래)의 확대 된 이미지와 같이. 화살촉 끝 발 astrocytic을 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. B에서 이미지는 주변 주입 항 체, hippocampal 신경 내의 (녹색), mAb86의 축적을 보여줍니다. 화살촉 개별 mAb86 양성 소포를 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. C 에서 그래프는 단일 기의 선 프로필 강도를 보여줍니다. 소포 크기 절반 최대 강도 곡선 (녹색 선 및 원)의 가우스 적합 (검은 실선)의 전체 폭에서 추정 되었다. 기저 lamina (CollagenIV, 회색) 내 D 에 이미지 표시 (녹색) 내 피 세포는 pericyte 둘러싸여의 3 차원 재구성 (빨간색) 합니다. 낮은 패널 개별 형광 채널을 표시합니다. 눈금 막대 = 10 µ m. E 에서 이미지 안에 pericytes (오른쪽 패널, 녹색에서 CD13) 하지만 내 피 세포 (왼쪽 패널, 녹색에서 CD31) 내에서 세포내 소포에서 (빨간) mIgG의 지역화를 표시 합니다. 모든 이미지, 핵 스테인드 DAPI 파란색으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 5 µ m. 패널 D 그리고 E 참조17에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
그림 2 : 모세 혈관과 혈액-뇌 장벽에 세포내 소포의 3 차원 렌더링. 설명 하는 프로토콜, CollagenIV 양성 모 세관 (녹색) 및 마우스 IgG 세포내 소포 (레드) 했다의 고해상도 confocal 이미지 (A) 인수. 왼쪽된 패널 횡단면 단일 광학 섹션을 보여 줍니다. 화살표는 뇌 내 피 세포 내에서 개별 mIgG 양성 소포를 가리킵니다. 전체 z-스택 사용 하 여 오른쪽 쇼 3D 개조에 패널 이미지 처리 소프트웨어 ( 재료의 표참조). 모 세관 볼륨 (B) 및 개별 소포 (C) 3 차원에서 렌더링 된 및 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 계량 ( 재료의 표참조). 모든 이미지, 핵 스테인드 DAPI 파란색으로 표시 됩니다. 스케일 바 = 5 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
그림 3 : BBB에서 mIgG 세포내 지역화의 정량화. 대표 이미지를 보여주는 모 세관 (collagenIV, 녹색으로 표시)의 (A) 3 차원 개조와 mIgG의 분포 (적색) C57BL/6 마우스와 pdgf bret/ret pericyte 고갈 마우스 이전19에서 설명합니다. 스케일 바 = 10 µ m. B에서 이미지 CollagenIV 마스크 내에서 세포내 소포의 세그먼트를 표시합니다. ThB 에서 e 그래프 정량화 및 모 세관의 볼륨 당 mIgG 기 수의 비교를 보여줍니다. 각 점 개별 모 세관 세그먼트에서 측정을 나타냅니다. 오차 막대는 데이터의 표준 편차를 나타내는 및 실선 보여준다는 뜻. C 표시에서 이미지는 CollagenIV 마스크 외부 mIgG 형광 신호. 마찬가지로, C 에서 그래프 표시 정량화 및 mIgG 형광 강도의 비교 C57BL/6 마우스와 pdgf bret/ret 사이의 뇌 실질에서 pericyte 고갈 쥐. 형광 강도 단위 모든 C57BL/6 마우스에서 측정 하는 평균 mIgG 실질 강도 의해 정상화 되었다. 이 그림은 참조17에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

high-resolution-confocal-imaging-blood-brain-barrier-imaging-3d

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K 조회수.  Roche Innovation Center Basel. 여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

비디오: High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

연구

생물학

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

신경과학

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

암 연구학

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, depending on the cancer type. To reduce the brain metastatic tumor burden, gaps in basic and translational knowledge need to be addressed. Major challenges include a paucity of reproducible preclinical models and associated tools. Three-dimensional models of brain metastasis can yield the relevant molecular and phenotypic data used to address these needs when combined with dedicated analysis tools. Moreover, compared to murine models, organ-on-a-chip models of patient tumor cells traversing the blood brain barrier into the brain microenvironment generate results rapidly and are more interpretable with quantitative methods, thus amenable to high throughput testing. Here we describe and demonstrate the use of a novel 3D microfluidic blood brain niche (&#181;mBBN) platform where multiple elements of the niche can be cultured for an extended period (several days), fluorescently imaged by confocal microscopy, and the images reconstructed using an innovative confocal tomography technique; all aimed to understand the development of micro-metastasis and changes to the tumor micro-environment (TME) in a repeatable and quantitative manner. We demonstrate how to fabricate, seed, image, and analyze the cancer cells and TME cellular and humoral components, using this platform. Moreover, we show how artificial intelligence (AI) is used to identify the intrinsic phenotypic differences of cancer cells that are capable of transit through a model &#181;mBBN and to assign them an objective index of brain metastatic potential. The data sets generated by this method can be used to answer basic and translational questions about metastasis, the efficacy of therapeutic strategies, and the role of the TME in both.

Here, we present a protocol for preparing and culturing a blood brain barrier metastatic tumor micro-environment and then quantifying its state using confocal imaging and artificial intelligence (machine learning).

장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

생체공학

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

설치류의 혈액 뇌 장벽 개방을 위한 고처리량 이미지 유도 입체 신경 탐색 및 집중 초음파 시스템

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...