Name: assessment of the effects of endocrine disrupting compounds on the development of vertebrate neural network function using multi-electrode arrays
Uploaded: 2018-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
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이 연구는 NSF (HBCU 업 연구 개시 수상, HRD 1401426 및 EPSCoR EPS-0814251)와 NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1)에 의해 지원 됩니다. 캔사스에서 델라웨어 INBRE III 6404 친교에 의해 지원 됩니다.

아래에 주어진 프로토콜 (초기) embryogenesis, 동안 BPA 노출의 효과 테스트를 표준화 하 고 BPS, BPF, 또는 병아리 배아 뉴런에서 다른 EDC와 함께 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 델라웨어 주립 대학의 제도적 정책 및 조류 배아에 대 한 NIH 정책 다음과 같습니다. 프로토콜은 DSU의 재료와 화학 안전 지침 확인입니다.
1. 소재 설정
<ol><li>1 m m 재고 솔루션 (10% 에타 놀의 mL 당 0.23 m g)을 물에 10%의 에탄올 (v/v)에서 BPA (m.w. 228.29)을 분해. Neurobasal 매체에 후속 희석 (0.1 µ M, 0.5 µ M, 1 µ M, 5 µ M 그리고 10 µ M)를 확인 합니다. 주의: BPA는 환경 독 소 그리고 분말을 처리할 때 주의 행사 해야 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 상용 탁상 계란 인큐베이터에서 병아리 알 품 어 E7 배아에 대 한 일 동안 알을 품 어.</li>
	<li>3 ~ 4 h 70% 에탄올에 몸을 담글 하 여 측정 Sterilize MEAs의 필요한 수를 준비 하 고 세 번 약 10 mL BSLII 후드에 멸 균 증류수에 씻어. 참고:는 MEAs는 8 x 8 표에 배열 64 성공 백 금 전극 포함. 전극 직경 30 µ m 이며, 전극 사이의 간격 200 µ m 이다. 로이 MEA의 부식으로 이어질 것입니다 MEAs는 살 균에 대 한 변성된 에탄올을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>(무 균 상태를 유지)에 뚜껑 살 균 컨테이너 내부 MEAs 장소 테이블 상단 인큐베이터로 이동. 55 ° c.에 적어도 6 시간 동안 구워 이 단계는 적절 한 살 균을 위해 중요 하 고 온도 60 ° c.를 초과 하지 않아야 합니다. 무 균 유지, 추가 사용까지 MEAs 스토리지에 대 한 BSLII 후드를 포함 하는 접시를 이동 합니다. 참고: 우리는 플라스틱 뚜껑 오븐 안전한 유리 베이킹 접시 사용 하 고 표면 70% 에탄올과 건조에 대 한 BSLII 후드에서 소독.</li>
	<li>약 수 엑스트라 세포 매트릭스 ECM 솔루션입니다. 밤새 4 ° C에서 유리병을 녹여 및 동결-20 ° c.에 100 µ L aliquots 참고: ECM 냉동 배송입니다. ECM 해야 하지 주어질 실내 온도에 준비까지 코트와 실내 온도에 polymerizes, 그것 생산, 일단 코트 수는 없습니다. ECM 성장 인자 없이 알 수 없는 요인으로 인해 추가 효과 방지 하기 위해 선호 된다.</li>
	<li>모든 해 부 악기 (Dumont #5 집게, 곡선된 겸 자, 작은 위, 및 봄이 위) 소독 자체 씰링 소재 70% 에탄올과 해 부 요리를 코팅 하 고 절 개 후드에 말리.</li>
</ol>2. 병아리 배아 신경 문화와 네트워크 활동
<ol><li>도금의 날, 제거 된 유리병-20 ° C 냉동 고에서 ECM의 70% 에탄올 스프레이 얼음에. BSLII 후드 안쪽에 300 µ L 찬 neurobasal 매체를 추가 하 여 25% 희석.</li>
	<li>p 200를 사용 하 여 pipetteman을 터치 전극 표면에 박막을 떠나 즉시 제거 돌보는 MEA의 중심에 25 %ECM 100 µ L를 추가 합니다. MEA를 커버 하 고 신경 세포를 접시에 준비까지 CO2 배양 기 (37 ° C, 5% CO2)에 배치.</li>
	<li>70% 에탄올과 E7 달걀 (배아 7 일, 7 일 동안 37 ° C에서 incubated)의 외피를 소독. 감기 균 행 크의 균형 염 솔루션 (HBSS) 칼슘 없이 포함 된 Sylgard 하단 해 부 접시에 배아를 목을 벨. 눈 주위 고 눈알을 제거. 집게를 잘 몬 트 # 5를 사용 하 여 봄이 위 복 부에 절 개를 확인 하 고 개 및 광학 tectum 폭로 피부의 바깥 층을 제거. 껍질 하 고 신중 하 게 pial 멤브레인을 제거 합니다. 다른 페 트리 접시에는 개를 전송 하 고 봄이 위 약 2 m m의 작은 조각으로 잘라. 참고: 거기 해서는 안됩니다 pial 막의 제거 후에 개에 연결 된 어떤 혈관. 비록 우리 악기와 해 부 지역 70% 에탄올으로 소독 철저 하 게은으로 절 개 후드 밖에 서 수행 하는 경우 상당히 좋은 결과 얻은 그것은 메 마른 절 개 후드, 해 부를 수행 하는 것이 좋습니다 가능한 경우, .</li>
	<li>살 균 전송 피 펫을 사용 하 여, 15 mL 원심 분리기 관으로 개 조각을 수집 하 고 제거 가능한 HBSS 개 싱크 분리기 튜브의 바닥의 조각을 시키는 후.</li>
	<li>0.05%의 1 mL을 추가 트립 신/EDTA (37 ° C에 미리 예 열)와 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 조직 조각을 방해 하지 않고 트립 신을 제거 하 고 1 mL neurobasal 매체를 추가. 조직 싱크대 바닥에 조각 하 게 하 고 매체를 제거 합니다. 이 세척을 한 번 더 반복 합니다. 이 단계는 트립 신/EDTA를 씻어.</li>
	<li>Neurobasal 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 분쇄 시작. 분쇄는 메 마른 불 광택 파스퇴르 피 펫을 복용 하 고 그것을 통해 조직의 여러 번 통과 부드럽게 조직의 아니 더 많은 조각을 볼 수 있습니다 때까지 포함 한다. 어떤 부분이 반복된 패스 후 남아 있으면 그냥 두고 바닥에 정착. 참고: 분쇄-거품은 형성 중지 하 고 열망 하 여 제거 하는 동안 볼만 하지 마십시오.</li>
	<li>Neurobasal 매체와 다시 중단된 셀 1시 10분 희석 하 고 Trypan Blue 염료와는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀. 믹스 50 µ L 희석된 셀의 0.5 mL 원심 분리기 튜브에서 Trypan 블루 솔루션의 50 µ L로. hemacytometer에는 coverslip에 배치 후 10 µ L을 추가 하 고 밝은 명확한 셀 (파란색 셀 죽 었 고 계산 한다). 참고: 단일 E7 광섬유 tectum 범위 1와 5 x 107 셀/mL 사이에서 일반적인 셀 번호.</li>
	<li>천연 접시 ECM에 세포 코팅 MEAs 2200 셀/평방 mm의 밀도. 우리의 나 시스템에 대 한이 MEA 당 약 130000 셀 변환 됩니다. 밤새 셀 첨부 파일 및 neurite 연장 (그림 1)에 대 한 CO2 인큐베이터에서 MEAs을 1 ml는 MEA에 볼륨을가지고 neurobasal 매체를 추가 합니다. 참고: 다른 분야와 전극 숫자의 MEAs에 대 한 다른 셀 밀도 수 시도-일반적으로, 더 높은 세포 조밀도 결과 더 큰 네트워크 활동, 하지만 또한 짧은 살린된 문화.</li>
	<li>다음 날, neurobasal 매체에 10 µ M의 최종 농도에 대우 MEA 단계 1.1에서에서 만든 1 m m 재고에서 BPA를 추가 합니다. 제어 MEA 물 (v/v) 솔루션에서 10% 에탄올의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>대체 보냈다 매체 neurobasal 매체 포함 10 µ M BPA 매일까지 7 일에서 생체 외에서 (7DIV) 그 후, 매일 네트워크 활동 증가. 참고: 네트워크 활동 증가, 신진 대사 활동 증가 하 고 미디어 변경 내용을 더 자주 필요. 중간을 오렌지를 설정 하지 마십시오.</li>
</ol>3. 신경 네트워크 활동을 기록
<ol><li>수집의 날, 신선한 neurobasal 매체와 문화 매체를 교환 하 고 녹음 하기 전에 2 h의 최소 CO2 배양 기에는 MEAs를 반환 합니다. 레코딩 소프트웨어를 시작 하 고 37 ° C에 온도 아이콘을 클릭 하 여는 MEA의 온도 설정 (보충 그림 3.1a-b). 참고: 녹음 도금의 3 일 일찍 시작할 수 있습니다 및 문화 살아 있는 계속할 수 있습니다.</li>
	<li>(아래 왼쪽된 창 패널에서 스트림) "뮤 즈" 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 인수 매개 변수를 놓으십시오, "추가 처리" 및 "스파이크 탐지기"를 선택 하 고 팝업 창에서에서 확인을 클릭 합니다. "탐지기 스파이크 (6 x 표준)" 파일 이름 아래에 나타납니다 (보충 그림 3.2a-b).</li>
	<li>다음 스파이크 검출기에 오른쪽 클릭, "추가 처리" 및 "파열 탐지기"를 선택 하 고 팝업 창에서에서 확인을 클릭 합니다. "탐지기 버스트" (ISI) 뮤 즈 아이콘 아래에 나타납니다 (보충 그림 3.3 a-b).</li>
	<li>다음 버스트 검출기에 오른쪽 클릭, "추가 처리"와 "신경 통계 컴파일러." 선택 팝업 창에서에서 파일 헤더, 잘 통계 집계 및 Synchrony 선택 되었는지 확인 합니다. 클릭 확인입니다. "통계 컴파일러" 아래에 표시 됩니다 (보충 그림 3.4 a-b). 참고:이 적응형 임계값 (6 x 표준 필터), 5, 평균 발사 속도 감지 10에 스파이크의 최소한 100 ms에 간 스파이크 간격을 설정 합니다 synchrony 매개 변수 20 ms에서와 최소 스파이크 속도 분 당 0.083333 스파이크에서 s.</li>
	<li>하단에 시계 아이콘을 클릭 하 여 녹음 시간 5 분 (300, 000 밀리초)에 대 한 예약된 녹화를 설정 합니다. 이 모든 5.1 분을 기록 하 고 5 분 동안 기록에 대 한 설정 섹션에서 정보를 변경 하 여 이루어집니다. 이 즉시 시작 될 것 이다 하 고 한 번 실행 될 것 이다 (보충 그림 3.5).</li>
	<li>MEA의 온도 MEA를 이동 하기 전에 37 ° C를 도달 했습니다 확인 하십시오. 인큐베이터에서는 MEA를 제거 하 고 기록 단위에 배치는 MEA를 잠글. 시작 예정 된 녹음 섹션에서 시작 레코드 또는 "파일 재생" 창에서 기록 아이콘을 클릭 하 여 네트워크 활동을 기록 합니다. 일반적으로, 5 분 (300, 000 밀리초)의 녹화 시간, 충분 하다 비록 더 이상 녹음 최대 10 분의 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>녹음 후 인큐베이터에는 MEA를 반환 합니다. 참고: 합니다 주의 불 임을 유지 하 고는 MEA가 인큐베이터 밖에 시간을 최소화 합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>오프 라인 레코딩 소프트웨어를 사용 하 여 원시 데이터의 분석을 수행할 수 있습니다. 파일 풀 다운 메뉴 클릭 하 고 녹음을 엽니다. 원시 데이터 파일 분석을 선택 합니다. 필요한 급격히 매개 변수 캡처 원시 녹음 재생.</li>
	<li>스파이크의 평균 수를 얻으려면 스파이크 검출기 모듈을 사용 하 고 Synchrony 인덱스를 얻기위한 신경 통계 컴파일러 모듈을 사용 합니다.</li>
	<li>스파이크 검출기, 버스트 검출기 및 (제 3) 하기 전에 통계 컴파일러 모듈 로드 합니다.</li>
	<li>스파이크 검출기, 버스트 검출기 및 통계 컴파일러 모듈 창 내에서 풀 다운 메뉴에서 스파이크 목록, 네트워크 버스트 목록 및 고급 통계, 각각 선택 합니다.</li>
	<li>감독된 폴더에.csv 파일을 만듭니다 있는 데이터 파일을 기록 하려면 기록 단추를 클릭 합니다. 스파이크 매개 변수-스파이크와 Synchrony 인덱스의 총 수-.csv 파일에 기록 됩니다. 참고:이 프로세서 시간과 컴퓨터 리소스를 사용할 수 원시 데이터를 기록 하는 동안 실시간으로 분석 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

급속 한 성장 및 embryogenesis 등 개발의 단계는 BPA를 포함 한 다양 일 분 비 방해 화합물의 해로운 효과에 특히 취약 합니다. 우리 생체 외에서 척추 신경 네트워크 모델에 BPA 노출의 효과 연구에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 BPA synchrony 인덱스 개발 신경 네트워크 (그림 2-b)로 서 스파이크 속도 낮추고 설립.
우리의 방법론은 BPA 노출 초기 embryogenesis 동안 공부 고 다른 EDCs의 효과 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다. 여자에서 배아 신경 문화 쥐 또는 마우스를 포함 하 여 다른 척 추가 있는 모델에 비해 상대적으로 쉽게 설정 수 있습니다. 또한, 필요는 없습니다 별도 동물 방-실험실 벤치에 간단한 보육은 이러한 분석을 수행 하기에 충분 한입니다. 우리는 네트워크 활동에 EDC, BPA의 영향을 평가 하기 위한 멀티 전극 시스템 (MEA)의 사용을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요 한 측면은 무 균의 유지 보수. 이 포함 하는 무 균 조건 하에서 배아의 해 부-70% 에탄올과 살 균 행 크의 균형 염 솔루션의 사용 악기를 살 균 하는 것입니다 충분 한. 데이터가 주 기간 동안 수집, 그것은 살 균 처리는 MEAs의 유지에 중요 한입니다. 일단 설립 신경 문화 수 수 경작 장기-최대 3 개월-고 따라서 EDCs 및 신경 네트워킹에 다른 화합물에 장기 노출 공부 하는 데 유용. 이 프로토콜의 또 다른 중요 한 측면은 도금을 해 부에서 시간. 최적의 시간은 trypsin으로 직물의 외피를 포함 하 여 30 분입니다. 더 이상 시간을, 셀의 가난한 생존.
여기 어떤 화학 또는 행동과 신경 기능에 영향을 주는 약물의 평가에 적용할 수 있는 기본 프로토콜을 설명 합니다. 여기, 우리는 m m2당 2200 셀의 셀 밀도 사용 그러나,이 수정할 수 및 다른 셀 밀도 사용 될 수 있다. 일반적으로, 우리는 셀 밀도 증가 네트워크 활동-짧은 시간에 더 많은 스파이크 나타났습니다. 방법 설명, 네트워크 활동에 화학 물질의 효과 사정에 매우 유용 하지만 한계는. 방법의 가장 큰 한계 중 하나입니다 이러한 생체 외에서 문화 2 차원 척추 뇌의 3 차원 구조를 반영 하지 않을 수 있습니다. 이 슬라이스 기록을 사용 하 여 극복할 수 있습니다. 또 다른 대안은 이다, 발전 병아리 태아 치료를 적용할 의미 계란15의 광범위 한 끝에 작은 창, 치료 처방의 끝에 뇌를 해 부하는 vibratome에 두꺼운 부분 고 대 한 MEA에 배치 네트워크 활동을 기록합니다.
우리의 프로토콜 네트워크 활동의 개발에 EDCs의 효력의 검사를 가능 하 게 하 고 이러한 화학 물질의 효과 대 한 기계적으로의 탐험을 제공 한다는 점에서 중요 하다.

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, 일반적으로 언급으로 Bisphenol-A 또는 BPA, 산화 첨가제에에서 있으면 다양 한 폴 리 카보 네이트 및 열 종이에서 배열 하는 에폭시 수 지 기반 제품, Cd, 및 균열 증거 유리 안쪽에의 코팅 음료 캔. BPA 에스트로겐1을 내 분 비 방해 대리인 것으로 알려져 있다, 비록 그것의 병에 효과에 BPA 매일 우연한 노출 때문에 대 한 연구는 주로 마지막 10-15 년에 밖으로 나와. BPA 노출도 낮은 레벨의 결과 어머니2,3의 노출을 통해 embryogenesis 동안 포함 한 초기 발달 기간에 가장 심오한. Utero에서 노출 여성 태아의 내 분 비 방해 화학 물질에는 또한 유 방 암4,5질에서 증가 질병 민감성에 연결 되었다. 동물 연구는 BPA에 노출 리드 비정형 뇌 구조와 기능 이상이 동작6에 설명 했다. 결과적으로, 유아 젖 병에 BPA 사용 하 여 유럽과 북미 지역, FDA 등에서 가장 규제 기관에 의해 금지 되었습니다. 규정 준수, 많은 제조 업체 4, 4'-sulfonyldiphenol 또는 bisphenol-S (BPS)로 전환 합니다. BPA와 BPS 인 구조 아날로그와 최근 보고서 estrogenic 전사7BPS의 유사한 효능을 보였다는 사실에 근거한 BPA 기준으로이 화합물의 독성 연구 중요 하다.
여기는 병아리 태아 척추 모델을 사용 하 여 신경 세포의 네트워크에 BPA (및 다른 EDCs)의 효과 테스트 하는 프로토콜에 설명 합니다. 생체 외에서 문화 뉴런의 시 냅 스 연락처를 형성 하 고 (스파이크 라고도 함) 하는 활동 전위를 생성. 이러한 문화의 급격히 활동 다중 전극 배열 (MEA) 시스템을 사용 하 여 기록할 수 있습니다. 스파이크는 synchrony에 있을 때 그들은 서로 5 ms 이내 발생으로 간주 됩니다. 결국 동기화 초기 랜덤 급격히 활동 신경 네트워크8,9개발의 핵심 기능입니다. Synchrony 다양 한 방법을 사용 하 여 측정 될 수 있다 그리고 몇 가지 알고리즘 문학9,,1011에 설명 되어 있습니다. 우리의 분석에서 우리는 MEA 수집 시스템 드라이브 레코딩 소프트웨어에 통합 되어 있는 동료와 Paiva12 에 의해 개발 된 알고리즘을 사용 합니다. 미 발달 병아리 뉴런의 강력한 스파이크 활동 신경 네트워크 활동13에 BPA의 효과 공부에 대 한 프로토 타입을 제공 합니다. 관찰 기록 급격히 활동 다중 전극 배열 사용 하 여, BPA 노출 신경 스파이크 synchrony9,14의 개발을 억제 합니다. 여기, 우리는 병아리 배아 문화에 신경 스파이크 synchrony의 개발에 대표적인 결과 함께 문화에 병아리 태아 신경에 BPA 노출 공부에 대 한 상세한 방법론을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>#5 foreceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Axion Muse MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>M64-GL1-30Pt200</td><td>Will be called MEA system in manuscript</td></tr><tr><td>Axis Software</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>Will be called recording software in the manuscript</td></tr><tr><td>BPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239658-250g</td><td></td></tr><tr><td>curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs</td><td>from any local farm or Spafas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>BrainBits</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer statistical software</td><td>Nex Technologies</td><td>Neuroexplorer version 5</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15514-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard bottom dissection dishes</td><td>Living Systems Instrumentaion</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue dye</td><td>Fisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of the effects of endocrine disrupting compounds on the development of vertebrate neural network function using multi-electrode arrays

두번째-페 놀, 비스 페 놀 A (BPA)와 두번째-페 놀-S (BPS), 플라스틱 및 수많은 일상적인 제품의 생산에서 널리 이용 되는 대리인 polymerizing 있습니다. 그들은 내 분 비 혼란 시키는 화합물 (EDC) estradiol 같은 속성으로 분류 됩니다. 장기 노출 EDCs, 낮은 복용량 에서도 다양 한 건강 결함 등 암, 행동 장애, 불 임, 초기 발달 기간 동안 큰 취약점으로 연결 되었습니다. 신경 기능의 개발에 대 한 BPA의 효과 연구, 우리는 체 외에서 신경 네트워크 모델 초기 배아 여자 뇌에서 파생 된 사용. 우리는에 노출 발견 BPA 특히 급상승 활동 및 동기화 네트워크 활동의 개발에 영향을. 네트워크 활동에 변화는 분자 화합물 또는 약의 대상과 행동 결과에 미치는 영향 사이의 중요 한 링크입니다. 다중 전극 배열 점점 네트워크 활동 체 외에 약물의 효과 연구에 유용한 도구가 되고있다. 여러 시스템 사용할 수 시장에서 있으며, 전극, 유형 및 전극 배열 및 기본 기본 원리, 분석 소프트웨어의 품질의 수에 있는 변이 그리고 데이터 취득은 걸쳐 동일 합니다 다른 시스템입니다. 현재 2 차원 생체 외에서 문화 분석에 국한, 하지만 이러한 MEA 시스템 네트워크 활동 두뇌 조각에서 vivo에서 사용할 수 있도록 향상 되 고 된다. 여기, 우리는 배아 노출 및 신경 네트워크 활동 및 대표 결과 함께 synchrony에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

우리 병아리 태아 신경 문화에서 synchrony 개발에 BPA의 효과 검사합니다. 급상승 활동의 동기화는 신경 네트워크 체 외의 정상적인 발전의 지표 이다. 서로 5 ms 이내 두 스파이크 발생 동기 간주 됩니다. 처음 무작위 급격히 활동을 표시 하는 체 외에서 신경 문화-스파이크 무작위로 발생 하 고 간 스파이크 간격 표시 정규 분포. 문화는 성숙, 급격히 활동 더 동기화 된다 고 간 스파이크 간격 일정. 문화의 동기 급격히 활동 Synchrony 인덱스 (SI) 파생 소프트웨어12 기록 사용 하 여 시간 스파이크의 교차 상관 분석으로 quantitated 했다. 우리는 BPA 노출 부정적인 영향을 미치는 네트워크 활동 개발 급격히 활동과 synchrony 인덱스 (그림 2는 및 2b)를 줄임으로써 발견. 요약 하자면, 우리는 배아에 BPA 노출의 해로운 효과 미치는 영향 문화에 병아리 뉴런에서 synchrony 개발을 통해 평가 될 수 있다 신경 기능을 포함 하 여 그것의 발전 나타났습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig1.jpg"> 그림 1: 여자 개 절 개에서 분리, 도금, 및 네트워크 활동의 기록 단계를 묘사 하는 프로토콜의 도식. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig2.jpg"> 그림 2: (A) 스파이크의 평균 수는 상당히 낮은 BPA 취급 E7 여자 개 문화 제어 문화에 비교 될 때. 스파이크의 평균 수는 레코딩 소프트웨어를 사용 하 여 추출 되었다. 수단 (제어, 14,890 ± 949.0, N = 15, BPA, 5,624 ± 465.9, N = 22) 크게 달랐다 (짝이 없는 t-검정, p < 0.0001). (B) 평균 synchrony 인덱스 (SI)는 크게 낮은 BPA 취급 E7 여자 개 문화 제어 문화에 비교 될 때. SI는 레코딩 소프트웨어 내에서 신경 통계 컴파일러 모듈을 사용 하 여 추출 했다. 시 수단 (제어, 0.5159 ± 0.06547 N = 15, BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) 크게 달랐다 (짝이 없는 t-검정, p < 0.0001). 오차 막대는 표준 편차를 묘사. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

환경 독 소에 노출 수 있습니다 심하게 발전 태아에 영향을. 내 분 비 혼란 시키는 화학 제품 bisphenols 부정적인 알려져 있습니다와 같은 신 경계에 영향을. 여기는 초기 배아에 독 소 노출의 기능에 미치는 영향을 연구 하는 생체 외에서 (병아리 태아) 척추 신경 네트워크 모델을 사용 하는 프로토콜에 설명 합니다.

내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

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Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

연구

신경과학

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

신경 기록 전극의 체계적인 전기 및 전기 생리 평가를위한 방법

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop working in various diseases. Studies have included neuropathological observation, fluorescent microscopy with genetic labeling, and intracellular recording in both dissociated neurons and slice preparations. This protocol discusses another technology, which involves growing dissociated neuronal cultures on micro-electrode arrays (also called multi-electrode arrays, MEAs).
There are multiple advantages to using this system over other technologies. Dissociated neuronal cultures on MEAs provide a simplified model in which network activity can be manipulated with electrical stimulation sequences through the array's multiple electrodes. Because the network is small, the impact of stimulation is limited to observable areas, which is not the case in intact preparations. The cells grow in a monolayer making changes in morphology easy to monitor with various imaging techniques. Finally, cultures on MEAs can survive for over a year in vitro which removes any clear time limitations inherent with other culturing techniques.1
Our lab and others around the globe are utilizing this technology to ask important questions about neuronal networks. The purpose of this protocol is to provide the necessary information for setting up, caring for, recording from and electrically stimulating cultures on MEAs. In vitro networks provide a means for asking physiologically relevant questions at the network and cellular levels leading to a better understanding of brain function and dysfunction.

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

This protocol provides the necessary information for setting up, caring for, recording from and electrically stimulating cultures on MEAs. In vitro networks provide a means for asking physiologically relevant questions at the network and cellular levels leading to a better understanding of brain function and dysfunction.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

생물학

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

HD-MEA에 대한 멀티모달 대규모 신경 기록 및 분석 

Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array

Large-scale neuronal networks and their complex distributed microcircuits are essential to generate perception, cognition, and behavior that emerge from patterns of spatiotemporal neuronal activity. These dynamic patterns emerging from functional groups of interconnected neuronal ensembles facilitate precise computations for processing and coding multiscale neural information, thereby driving higher brain functions. To probe the computational principles of neural dynamics underlying this complexity and investigate the multiscale impact of biological processes in health and disease, large-scale simultaneous recordings have become instrumental. Here, a high-density microelectrode array (HD-MEA) is employed to study two modalities of neural dynamics - hippocampal and olfactory bulb circuits from ex-vivo mouse brain slices and neuronal networks from in-vitro cell cultures of human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The HD-MEA platform, with 4096 microelectrodes, enables non-invasive, multi-site, label-free recordings of extracellular firing patterns from thousands of neuronal ensembles simultaneously at high spatiotemporal resolution. This approach allows the characterization of several electrophysiological network-wide features, including single/-multi-unit spiking activity patterns and local field potential oscillations. To scrutinize these multidimensional neural data, we have developed several computational tools incorporating machine learning algorithms, automatic event detection and classification, graph theory, and other advanced analyses. By supplementing these computational pipelines with this platform, we provide a methodology for studying the large, multiscale, and multimodal dynamics from cell assemblies to networks. This can potentially advance our understanding of complex brain functions and cognitive processes in health and disease. Commitment to open science and insights into large-scale computational neural dynamics could enhance brain-inspired modeling, neuromorphic computing, and neural learning algorithms. Furthermore, understanding the underlying mechanisms of impaired large-scale neural computations and their interconnected microcircuit dynamics could lead to the identification of specific biomarkers, paving the way for more accurate diagnostic tools and targeted therapies for neurological disorders.

저자 스포트라이트: HD-MEA 기술을 통한 대규모 신경 역학 발전

Here, we employ HD-MEA to delve into computational dynamics of large-scale neuronal ensembles, particularly in hippocampal, olfactory bulb circuits, and human neuronal networks. Capturing spatiotemporal activity, combined with computational tools, provides insights into neuronal ensemble complexity. The method enhances understanding of brain functions, potentially identifying biomarkers and treatments for neurological disorders.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

Large-scale neuronal networks and their complex distributed microcircuits are essential to generate perception, cognition, and behavior that emerge from ...

<meta charset="utf8"></head><body>뇌 집합체에서 네트워크 활동 기록: 다중 전극 어레이 접근법

A Multi-Electrode Array Platform for Modeling Epilepsy Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Assembloids

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal brain development. The fusion of dorsal with ventral regionally specified brain organoids in vitro generates assembloids, which have functionally integrated microcircuits with excitatory and inhibitory neurons. Due to their structural complexity and diverse population of neurons, assembloids have become a useful in vitro tool for studying aberrant network activity. Multi-electrode array (MEA) recordings serve as a method for capturing electrical field potentials, spikes, and longitudinal network dynamics from a population of neurons without compromising cell membrane integrity. However, adhering assembloids onto the electrodes for long-term recordings can be challenging due to their large size and limited contact surface area with the electrodes. Here, we demonstrate a method to plate assembloids onto MEA plates for recording electrophysiological activity over a 2-month span. Although the current protocol utilizes human cortical organoids, it can be broadly adapted to organoids differentiated to model other brain regions. This protocol establishes a robust, longitudinal, electrophysiological assay for studying the development of a neuronal network, and this platform has the potential to be used in drug screening for therapeutic development in epilepsy.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 인간 뇌 집합체의 다중 전극 어레이 기반 장기 전기생리학적 모니터링을 통한 유전적 간질 연구 발전

This protocol aims to stably plate dorsal-ventral fused assembloids on multi-electrode arrays for modeling epilepsy in vitro.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal ...

내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가

요약

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Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

신경 기록 전극의 체계적인 전기 및 전기 생리 평가를위한 방법

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼