Name: live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
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우리는 그들의 도움이 논의 및 의견 Jha 실험실의 구성원 감사. 스는 암 과학 연구소의 싱가포르 (R-713-006-014-271), 국가 의료 국립 연구 재단 싱가포르와 싱가포르 교육부의 연구 센터 우수 이니셔티브의 밑에서 교부 금에 의해 지원 되었다 연구 위원회 (CBRG-검; BNIG11nov001 및 CS-IRG; R-713-000-162-511), 교육 학술 연구 기금 (모에 AcRF 계층 1 T1-2012 년 10 월-04). Y.Z., G.S.C., 및 C.Y.T. 암 과학 연구소의 싱가포르, 싱가포르의 국가 대학에 의해 수 여 하는 대학원 친교에 의해 지원 되었다.

1입니다. 준비
<ol><li>MCF10A 문화 매체를 준비: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F12 (1:1) 5% 혈 청, 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 10 µ g/mL 인슐린 승마 /.</li>
	<li>혈 청 무료 매체를 준비: DMEM/F12 (1:1)와 20 ng/mL 상피 성장 인자, 0.5 mg/mL 날린, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 10 µ g/mL 인슐린.</li>
	<li>SiRNA는 다음 순서를 사용 하 여: siControl: 앞으로: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' 역: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: 앞으로: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' 역: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>10 cm 세포 문화 요리와 24-잘 접시를 사용 합니다.</li>
</ol>2. TIP60를 사용 하 여 siRNA의 일시적인 고갈
<ol><li>하루에 1, transfection 시 약 (예: Lipofectamine RNAiMAX)의 aliquot 15 µ L의 2 mL 혈 청 매체 (예를 들어, Opti 메모리) 감소와 각각 10 µ L의 각 siRNA (10 µ M 주식), 그들을 혼합.</li>
	<li>20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>1 x 106 MCF10A 셀 10 cm 접시에 배양의 3 mL 함께 씨앗 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>10 cm 접시에 siRNA 혼합물에 의해 드롭 추가 합니다.</li>
	<li>세포는 동일 하 게 37 ° C 배양 기에 그것을 올려 놓기 전에 배포 되도록 요리를 흔들어.</li>
	<li>후 보육의 6 h, 포함 하는 siRNA 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.</li>
	<li>하루에 2, siRNA 혼합물의 다른 배치를 준비 하 고 20 분 동안 실내 온도에 그들을 품 어.</li>
	<li>1 일 추가 문화 매체의 8 mL을 aspirate 하 고 신선한 문화 매체의 3 mL와 함께 그것을 대체.</li>
	<li>요리에 의해 드롭 siRNA 혼합물의 두 번째 배치를 추가 합니다. 요리는 시 약은 완전히 인큐베이터에 그들을 올려 놓기 전에 혼합 되도록 흔들어.</li>
	<li>6 h 후 siRNA 포함 된 매체를 8 mL 신선한 문화 매체의 바꿉니다.</li>
</ol>3. 씨 셀 상처 치유 분석 결과 대 한
<ol><li>3 일에 매체를 삭제 하 고 셀 염 분 (PBS) 버퍼 인산 염 버퍼의 2 mL을 한 번 씻어. PBS 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>접시에 1 mL의 트립 신-EDTA 버퍼 x 1 추가 하 여 siControl 및 siTIP60 치료 세포를 trypsinize. 다시 20 분 동안 인큐베이터에에서 넣어.</li>
	<li>각 접시에 완전 한 문화 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 pipetting에 의해 resuspend 15 mL 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>5 분 동안 200 g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>다시 혈 청 자유로운 매체의 5 mL로 세포를 일시 중단 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>SiControl 및 siTIP60; 6 x 105 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 잘 혼합 셀 인지 확인 합니다. 100 %confluency 위해 24-잘 접시의 한 잘에 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 6 우물 각각 siControl와 siTIP60에 대 한 씨앗</li>
	<li>부드럽게 앞뒤로 접시 그리고 사이드-투-사이드 분산 되도록 흔들어. 원형 모션을 하지 마십시오. 24 h에 대 한 인큐베이터에 접시를 남겨 주세요.</li>
	<li>TIP60의 최저 효율 확인 나머지 셀을 수확. 이렇게 하려면 5 분 동안 200 g에서 나머지 세포 현 탁 액을 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>RNA는 상업적인 시 약을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 분리 하 고 최저 효율을 평가 하는 실시간 양이 많은 PCR을 진행.</li>
</ol>4. 상처를 만듭니다
<ol><li>단계 대조 현미경 셀 완전히 장착 되었는지 확인 하려면 확인 하십시오. 세포는 현미경 관찰 (4 배, 10 배, 및 20 배 확대) 셀 셀 confluent 단층 형성 하고있다 연결 완벽 하 게 됩니다. 참고: siControl 셀 일반적으로 siTIP60 셀 보다 더 나은 연결합니다. 이 때문에 TIP60의 소모 셀 더 엽 같은20으로 예상 된다. 여기, 일반 벤치탑 화이트 빛 단계 대조 현미경 사용 됩니다.</li>
	<li>상처를 생성 하려면 부드럽게 200 µ L 피 펫 팁; 우물의 중앙에 걸쳐 직선을 긁어 생성 된 상처의 길이 우물의 직경으로 동일 합니다. 모든 나머지 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.</li>
	<li>부드럽게 씻어 5 번 잘 각 혈 청 무료 사용 하 여 분리 된 세포를 제거 하는 매체.</li>
	<li>각 잘 하 혈 청 자유로운 매체의 1 mL을 추가 하 고 라이브 셀 이미징에 진행.</li>
</ol>5입니다. 라이브 셀 이미징의 설치
<ol><li>현미경을 라이브 셀 이미징 챔버에서 온도 37 ° c.에 도달 하면 되도록 설정 하기 전에 적어도 1 시간을 제어 하는 온도</li>
	<li>라이브 셀 이미징 시작 하기 전에 이산화탄소 (CO2) 가스 공급을 켜십시오. 5% CO2 농도 설정 합니다.</li>
	<li>현미경의 무대에서 24-잘 접시를 놓고 이미징에 대 한 10 배 확대와 대물 렌즈를 선택 합니다. 직접 카메라 대신 접 안경에 내보낸된 빛 고 상처와 주위 세포를 찾기 위해 초점을 조정 합니다. 참고:이 경우에, 단계 대조와 흰색 빛 사용 되었다.</li>
	<li>라이브 셀 옵저버 시스템을 사용 하 여 각 잘에서 상처의 위치를 표시. 참고: 라이브 셀 이미징 시스템의 자동화 된 단계는 여러 위치에서 이미지 수집에 대 한 수 있습니다. 이미지는 한 번 모든 간격 모든 표시 된 위치에 이동 됩니다.</li>
	<li>시간 조건 설정: 1 시간 간격 및 72 h 기간; 이 설정에 따라 시스템 것입니다 사진을 찍고 각 표시 된 위치에 72 h. 어떤 원하는 시간 간격 설정에 대 한 모든 시간과 모니터링 기간. 참고: 여기, 기간 72 h는 최고의 이러한 셀 시작 후 72 h 혈 청 자유로운 매체에 죽어가 고 있기 때문에.</li>
</ol>6. 단일 셀 이동 추적
<ol><li>후에 72 h. JPEG 형식에서 이미지와 동영상을 AVI 형식에서으로 데이터를 내보낼 데이터를 내보냅니다. 참고: 이것은 중요 ImageJ 소프트웨어만 AVI 형식의 동영상을 인식할 수 있기 때문 에입니다. SiTIP60 및 siControl 세포 사이 다른 셀 마이그레이션 속도 비디오에서 명확 하 게 관찰할 수 있습니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어에 AVI 비디오를 엽니다.</li>
	<li>MTrackJ 플러그인 (플러그인 해야 합니다 다운로드 및 설치 별도)를 열고: 플러그인 > MtrackJ.</li>
	<li>MtrackJ 도구 모음에서 "추가" 탭을 클릭 하 여 비디오에서 선택 하는 단일 셀에 대 한 트랙을 추가 합니다. 침략의 끝에 셀 및 자체에 마이그레이션할 수 있는 셀을 선택 (단일 셀 마이그레이션). 비디오에서 선택한 셀의 움직임에 따라 하 고 그들을 추적 하는 것은 MtrackJ를 사용 하 여.</li>
	<li>도구 모음에서 "측정" 탭을 클릭 하 여 이동 거리를 측정 합니다. 참고: 여기는 siControl에 거의 셀 단일 세포, siTIP60 세포의 많은 단일 세포로 이동 하는 반면 단일 셀 운동 측정 하기 어려운 만들기로 이동. 그러나, 침략 앞에 있는 세포의 움직임 수 여전히 추적 되며, siControl 및 siTIP60 셀에 계산.</li>
	<li>동영상 AVI 형식으로 트랙을 저장 합니다.</li>
</ol>7입니다. 셀 마이그레이션 능력의 정량화
<ol><li>정량화, 0 h 이미지와 "n" h, 여기서 "n" _는 timepoint 닫히면 siTIP60 또는 siControl 세포는 완전히 상처에서 이미지를 선택 합니다. 참고: 여기, 48 h 선택 되었다, siTIP60 세포에 상처 거의 완전히 폐쇄 했다.</li>
	<li>ImageJ는 다음 수식을 사용 하 여를 사용 하 여 백분율 마이그레이션 계량: (0 h-"n" h의 영역에서 상처의 지역) / 0 h x 100의 지역.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM.">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li><li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53.">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li><li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Rvb1/Tip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60/NuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage.">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li><li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. 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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

그것은 셀 마이그레이션 과정에서 셀 수 중 이동 부착 시트;의 형태로 알려져 느슨한 클러스터; 또는 단일, 고립 된 세포입니다. 모드와 다이나믹 셀의 다른 한 상태에서 변화할 수 있다 그리고 표현 형 시간 변경할 수 있습니다. 전통적인 상처 치유 분석 결과 12 또는 24 h와 같은 긴 시간 간격으로 현미경에서 찍은 스냅 사진을 기반으로 합니다. 이 어렵게 상처 폐쇄의 동적 및 셀 움직임의 패턴을 ?...

HIV Tat에 상호 작용 단백질 60 kDa (TIP60)은 히스톤과 비 히스톤 단백질1,2acetylate 수 있는 lysine acetyltransferase 이다. 그것의 기능은 전사, DNA 손상 복구 및 apoptosis1,3,,45,6, 를 포함 하 여 여러 신호 전달 경로에 영향을 찾을 수 있습니다. 7 , 8. 또한, TIP60 자주 downregulated 암에 그 downregulation 암 전이 상관은 고 가난한 생존 요금9,,1011,12, 13,14. 종양 전이 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 그것은 다단계 과정 그리고 전이의 초기 단계는 마이그레이션 및 인접 조직을15,16으로 종양 세포의 내 습을 포함 한다. 그렇게 하기 위해 종양 세포는 먼저 기본 종양 질량 총칭 침입 셀 시트의 모양에서 분리 해야 합니다 또는으로 단일 셀17분리. 이 과정 동안 종양 세포는 종종 엽 전환 (응급), 형태학 및 세포 접착 기능17,18에 변화 결과로 상피 받을.
몇 가지 기법 연구는 마이그레이션 개발 되었습니다 그리고 종양의 내 습 능력 세포 생체 외에서. 그 중, 상처 치유 분석 결과 가장 효율적이 고 경제적인19이다. 첫째,이 방법은 마이그레이션할 및 간격 닫기 셀 되므로 셀 confluent 단층에 인공 갭의 창조를 포함 한다. 둘째, 시작 및 실험의 끝에 간격의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 마지막으로, 간격 폐쇄의 비교는 세포 이동의 비율을 결정 하는 데 사용 됩니다. 단계 대조 현미경 일반적으로 기존의 상처 치유 분석 실험에 대 한 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 상처 치유 분석 결과의 또 다른 장점은 그것은 부분적으로 종양 세포 마이그레이션 vivo에서 유사한입니다. 유사 하 게 종양 전이 에 비보를 상처 치유 분석 실험에서 셀 마이그레이션 상피 시트의 집단 이주와 분리 된 단일 셀의 마이그레이션을 보여줍니다.
그러나, 셀 마이그레이션 동적, 알려져 있다 그리고 실시간으로 세포의 움직임을 문서화 하는 필요 있다. 예를 들어, 기존의 상처 치유 분석 결과 단일 셀 움직임을 분석 하는 연구원을 허용 하지 않습니다. 다른 한편으로, 상처 치유 분석 실험에 대 한 배양 세포 들은 세포 증식을 억제 하는 혈 청을 굶 어입니다. 이것은 세포 증식으로 인해 간격 폐쇄의 가능성을 배제 하기 위해 이루어집니다. 그럼에도 불구 하 고, 있을 것입니다 아직도 일부 확산 및 세포 죽음, 및 단계 실험은 그들을 구별 수 없습니다 전후를 찍은 이미지.
라이브 세포 이미징 기술을 기존의 상처 치유 분석의 이러한 제한을 해결합니다. 라이브 영상 현미경을 사용 하 여 CO2 배양 기 및 적절 한 온도 제어와 결합 하 여, 연구원은 간격 크기를 측정할 수 있으며 세포 적극적으로 마이그레이션의 움직임을 추적 하는 동안 시간이 지남에 폐쇄의 그것의 비율의 끝에는 침략 앞에. 따라서, 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션 모니터링 구현만 셀 이동의 더 나은 시각화를 제공 하지 않습니다 하지만 또한 셀 마이그레이션 및 세포 증식, 제공 하는 더 구별 가능성에 대 한 수 세포 이동의 신뢰할 수 있는 분석.
이 연구에서는 MCF10A 유 방 상피 세포 상처 치유 분석 결과 및 라이브 셀 이미징 셀 마이그레이션에 TIP60의 역할을 연구 하기의 조합을 설명 하기 위해 사용 되었다. TIP60의 소모 증가 마이그레이션 능력 MCF10A 세포에서 발생합니다.

<table><tbody><tr><td>MCF10A cell</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>Breast epithelial cell</td></tr><tr><td>DMEM/F12 media (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>MCF10A culture media</td></tr><tr><td>Epithelial growth factor (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Supplements for MCF10A culture media</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8052</td><td>Supplements for MCF10A culture media</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td>Supplements for MCF10A culture media</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1882</td><td>Supplements for MCF10A culture media</td></tr><tr><td>House serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Supplements for MCF10A culture media</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>For MCF10A detach from plate</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>For counting cell</td></tr><tr><td>Opti-MEM reduced serum media</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>For siRNA mixture</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>56532</td><td>Transfect reagent</td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>For mRNA extraction</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>For cDNA generation</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5125</td><td>For real time qPCR</td></tr><tr><td>7500 Fast Real Time PCR system</td><td>Biosystems</td><td></td><td>Real time qPCR mechine</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td>For Knockdown experiment</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td>For wound healing assay</td></tr><tr><td>siControl siRNA</td><td>Self designed</td><td>Self designed</td><td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>Self designed</td><td>Self designed</td><td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>Live cell observer</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments</td></tr></tbody></table>

live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60

상처 치유 분석 결과 효율적인 셀 마이그레이션 시험관을 공부 하는 가장 경제적인 방법 중 하나. 전통적으로, 이미지는 시작과 단계 대조 현미경을 사용 하 여 실험의 끝에 고 셀의 마이그레이션 능력 상처의 폐쇄에 의해 평가 됩니다. 그러나, 셀 이동은 동적 현상, 그리고 종래의 방법 단일 셀 이동 추적에 대 한 허용 하지 않습니다. 현재 상처 치유 분석 실험에 개선 하기 위해, 우리는 셀 마이그레이션 실시간으로 모니터링 하 라이브 세포 이미징 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 셀 추적 시스템을 기반으로 셀 마이그레이션 속도 확인할 수 있습니다 하 고 셀 마이그레이션 및 세포 증식 사이 명확한 구별을 제공 합니다. 여기, 우리 TIP60의 존재에 의해 영향을 하는 유 방 상피 세포의 다른 마이그레이션 능력을 연구 분석 상처 치유에 라이브 셀 이미징의 사용을 보여 줍니다. 세포 운동 성 높은 동적으로, 우리의 메서드는 상처 치유의 상처 폐쇄 상처 치유 분석 실험에 사용 되는 전통적인 이미징 기술을 함께 찍은 스냅샷 보다 과정에 더 많은 통찰력을 제공 합니다.

일반 스키마의 라이브 셀 이미징 기반 셀 마이그레이션 분석 결과 그림 1A 는이 프로토콜의 스키마입니다. MCF10A 셀 siControl 전형적인 상피 형태를 보여와 페. TIP60의 고갈 후 MCF10A 셀 제어 셀 (그림 1B)에 비해 더 엽 했다.
TIP60 때 려 눕 힘 효율성의 시험 <st...

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Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.8K 조회수.  National University of Singapore. 여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

연구

발생학

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

암 연구학

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

생체공학

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

의학

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and fusion above the tongue. Defects in this process lead to cleft palate, a common birth defect. Recent studies have shown that palatal shelf elevation involves a remodeling process that transforms the orientation of the shelf from a vertical to a horizontal one. The role of the palatal shelf mesenchymal cells in this dynamic remodeling has been difficult to study. Time-lapse-imaging-based quantitative analysis has been recently used to show that primary mouse embryonic palatal mesenchymal (MEPM) cells can self-organize into a collective movement. Quantitative analyses could identify differences in mutant MEPM cells from a mouse model with palate elevation defects. This paper describes methods to isolate and culture MEPM cells from E13.5 embryos-specifically for time-lapse imaging-and to determine various cellular attributes of collective movement, including measures for stream formation, shape alignment, and persistence of direction. It posits that MEPM cells can serve as a proxy model for studying the role of palatal shelf mesenchyme during the dynamic process of elevation. These quantitative methods will allow investigators in the craniofacial field to assess and compare collective movement attributes in control and mutant cells, which will augment the understanding of mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation. Furthermore, MEPM cells provide a rare mesenchymal cell model for investigation of collective cell movement in general.

We present a protocol for isolation and culture of primary mouse embryonic palatal mesenchymal cells for time-lapse imaging of two-dimensional (2D) growth and wound-repair assays. We also provide the methodology for analysis of the time-lapse imaging data to determine cell-stream formation and directional motility.

집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...