Bioeconomy 과학 센터의 과학 활동 NRW Strategieprojekt BioSC (313/323-400-002 13)의 프레임 워크 내에서 사역의 혁신, 과학, 그리고 연구에 의해 재정적으로 지원 했다. 저자는 혁신의 내각, 과학, 및 연구의 노르트라인-베스트팔렌, 하인리히 하이 네 대학 뒤셀도르프 라스 주 클러스터 산업 생명 공학 CLIB 대학원 내에 장학금에 대 한 감사합니다. 추가 자금 활성화 공간 프로그램 "미생물 Bioprocess 연구소-A 헬름홀츠 혁신 연구소"를 지원 하기 위해 독일 헬름홀츠 협회의 "헬름홀츠 혁신 연구소"에서 받았습니다.

저자는 공개 없다.

제시 프로토콜의 일반적인 자연 수 예를 들어, 다른 미생물 식 호스트9,47,,4849,50, 공부에 대 한 다양 한 적응, 51, 또는 glycosylation 패턴 또는 이황화 채권 같은 대상 단백질의 다른 속성을 최적화. 프로토콜 사용 가능한 실험실 장비에 적응도 해야 합니다. MBR 시스템의 통합 시간에 큰 비용 절감을 가능 하 게 실험 처리량을 늘릴 수 있습니다. 그러나, 완벽 하 게 계측 및 제어 bioreactors MBR 시스템 교체, 결과의 확장성8,37,,5253고려 한다. 미상 방법론 및 수학적 모델링을 사용 하 여 효율적인 실험 계획 및 모델 기반 데이터 해석15공부 객관적인54 에 따라 측정 데이터의 정보 내용을 극대화에 도움이 됩니다.
방법에 대 한 수정 다목적 및 확장 로봇 액체 처리 시스템이이 연구에 사용 된 것과 같은, 옆 언급 해야이 작업을 수행할 수 있고 안에 배치 될 수 있습니다 상용 시스템을 처리 하는 여러 작은 액체는 층 류 흐름 작업의 자의 자동된 pipetting 시스템을 사용할 수 있는 다른 미디어 작곡 미상 계획에 따라 단일 또는 다중 채널 펫을 사용 하 여 수동 pipetting으로 실현 또한 수 있다. 수동 준비는 더 오류가 있기 때문에 꽤 오랜 시간에 대 한 높은 집중된 작업을 요구할 것 이다, 다른 미디어 작곡의 낮은 수를 준비 하는 것이 좋습니다.
고용된 MBR 시스템의 기능에 따라 해당 재배 프로토콜은 달라 집니다. 예를 들어, 바이오 매스 형성의 아무 온라인 측정을 사용할 수 있는 경우 성장 실험의 완료 후 바이오 매스 농도 측정 하는 충분 한 수 있습니다. 온라인 모니터링 함께에서 여러 MBR 시스템에서 구현 되는 용 존된 산소와 pH의 성장 채도 안전 하 게 결정 될 수 있다. 원칙적으로, 성장 실험 MTPs 혼자 incubators, MBR 시스템의 사용 없이 동요 내부 배치에서 수행할 수 있습니다. 이 경우에, 적절 한 재배 조건을 보장 해야: (1) 산소 제한 지켜온 적절 한 주파수를 흔들어 및 직경, 예를 들어, 광장 96 또는 24 깊은 동요와 함께 적당 한 형상의 MTPs를 사용 하 여 피할 수 있습니다 잘 판 3mm 던져 또는 25 mm 던져에서 250 rpm에서 1000 rpm에서 각각 운영 한다. 중요 한 것은, 낮은 달성 최대한 산소 전송 속도, 낮은 주요 탄소 소스 해야 집중. 이 연구를 위해, 위에서 언급 한 대로 10 g/L 포도 당 사용이 했다 고용된 재배 조건;에 대 한 제한 산소를 방지 하기 위해 적당 한 (2) 바이오 매스 및 제품 정량화에 대 한 MTP 문화의 샘플링 최소한으로 감소 되어야 한다. MTP 떨고 인큐베이터에서 제거 됩니다 때마다 산소 전송 됩니다 즉시 고장 형편이 나쁜 경작 조건;에서 발생할 수 있습니다. (3) 저자의 의견에에서 MTP 독자 재배 장치를 사용 하 여가이 목적을 위해이 소자 들은 개발 되지 않은으로 바람직하지 않습니다. 예를 들어 떨고 역학 만들어진 시 약 추가 후 microplates의 가끔 혼합 하 고 따라서, 일에 대 한 지속적인 떨고 지속의 긴 실행에 대 한 견고성 부족. 또한, 미생물 경작에 필요한 충분 한 전원 입력이이 독자에서 실현 될 수 없습니다. 광학 밀도 판독의 통합 짧은 시간 간격 반복된 기간 산소 제한의 결과로 떨고 운동의 중지를 해야 합니다. 또한, 긴 재배 기간 동안 이러한 시스템에서 증발 결과 왜곡할 것 이다. 에 대 한 자세한 내용은 MTPs 미생물 경작에 대 한 사용 하 여 놀라울 정도로 복잡 한 주제, 독자는 인용된 문학22,23,,2425,26 참조 거기에 참조.
추가 고려 사항 죽인다 반복 최적화 단계를 신중 하 게 제품 정량화에 대 한 분석 방법을 선택 하는 것이 좋습니다. 빠르고 간단한 방법 실험 부정확성을 허용 하는 반복 실험 설계 전략으로 정밀도 정확도, 비용 선호 해야 합니다. 그러나, 더 복잡 있을 수 있습니다 충분 하 게 정확 하 고 정확한 제품 정량화 방법에 대 한 최종 결과 확인 해야 합니다. 일반적으로, 주의 깊은 평가 및 연구 절차에 대 한 의사 결정 연구의 시작 부분에서 노력을 필요로 하지만 일상적인 방법 설정 된 후 긴 안목으로 보면, 치를.
최적화 하는 동안 모든 실험 비교 참조 실험을 정의 높은 것이 좋습니다. 즉, 측정 된 출력 뿐 아니라 적용된 중간 구성 요소 농도 기준 값으로 나누는 통해 정규화 됩니다. 이러한 방법으로, 각각 적용 되 고 측정 된 값 참조 값의 x 배로 해석 될 수 있다. 격판덮개 사이 계정 변화를 하기 5 참조 실험 각 접시에 수행 됩니다. 측정된 결과의 의미 값 정규화에 대 한 사용 됩니다.
그것은 수 있다 일반적으로 하지 보장 개발된 매체는 또한 다른 변종에 대 한 최적의. 그러나, 향상 된 매체 대부분 수도 mutagenesis 연구 (에서 얻은 하나의 아미노산 대체와 효소 이체를 생산 하는 때 작은 유전 다름, 예를 들어, 식 종자 재배에 적합 비록도 단일 지점 돌연변이 설명 효과 세포질 물질 대사 및 분리 식 성능55,56). 이 경우에, 제시 프로토콜 프로토콜 높은 처리 식 검 진57다음 첫 번째 단계를 수 있습니다. 복제는 눈금에서 캠페인 심사 확인 다른 가기 최적화 된 매체 해당 bioprocess 조건에 대 한 확인 한다 중간 개발 이후 규모-최대 먹이 배치 경작을 위한 프로토콜을 사용 하는 경우 다른 먹이 전략 및 재배 미디어52,58공연. 또한, 도입된 KriKit36 일반적으로 향상 된 전체적인 bioprocess 최적화에 기여할 수 있다.최근, 도구 능력 또한 모두 업스트림 및 다운스트림 프로세스59,60를 최적화에 대 한 중요 한 될 수 있는 다 객관적인 최적화40를 지원 하도록 확장 했다.

현대 재조합 유전자 기술 제약 산업, 동물 먹이, 유기 화학 및 식품 가공1,2,3에서 다양 한 응용 프로그램에 대 한 기술 효소의 광범위 한 사용을 수 있습니다. 대량 수량에서 기술 효소의 생산은 산업 공학에 대 한 최적화 된 재조합 단백질 생산을 위한 주요 주제 둘 다 변형 및 bioprocess 엔지니어링이 필요 하다. 효율적으로 설계 생산 종자의 생성에 대 한 서로 다른 유전자 라이브러리를 사용할 수 있습니다 예를 들어, 균형된 진 식4 또는 증가 된 분 비 효율5.
Corynebacterium glutamicum 산업 규모6,7 에서 아미노산의 중요 한 생산자가 고 재조합 단백질8의 분 비 생산에 대 한 매력적인 비 전통적인 식 호스트 나타냅니다. ,9. 일반적인 분 비 (Sec)와 트윈-아르기닌 전 (문신) 통로 C. glutamicum 에 존재 하 고 재조합 단백질 분 비10성공적으로 적용 했다. Bioprocess 공학 산업 규모 뿐만 아니라 단백질 g/L 양의11 및 대규모 발견 bioprocess 이질성에 관한 좋은 견고성을 분 비 하는 능력에서 아미노산 생산에 관한 광범위 한 경험 지켜온12,13, 산업 규모에 유망한 플랫폼 유기 체 분리 단백질의 분 비 생산에 대 한 C. glutamicum 확인 합니다.
재조합 형 단백질 생산 미생물 시스템14,15,,1617 따라서, 매체의 조정 개선 영양 중간 최적화 알려져 있다 구성은 bioprocess에서 보람 있는 단계 최적의 생산성18,19,,2021기준 개발. 미생물 배양22,,2324 결정 판 (MTPs)의 응용 프로그램에 대 한 강렬한 연구 개발 및 미생물 배양25 MTPs의 디자인에 대 한 방법을 포장 26 및 MTP 기반 microbioreactor (MBR) 시스템 온라인 모니터링 및 환경 개발 제어27,28. 마샬링 사용 실험 재배 처리량에 크게 증가 합니다. 게다가, 원자로, 생물 반응 기, 예를 들면, 거품 열 또는 흔들된 탱크의 형태소를 분석 하는 MBR 시스템 미생물 bioprocess 최적화29,,3031, 사용할 수 있습니다. 32.
일반적으로 최적화 연구 DOE 방법론 등 설계 변수 간의 상호 작용을 평가 하거나 높은 차원 검색 공간을 줄이기 위해 함께에서 더욱 강력한 되 증가 실험 처리량에서 혜택을. 따라서, MBR 시스템, 실험실 자동화, DOE의 사용 생물 공학8,16,33,,3435에서 강력한 방법으로 입증 했다.
미디어 최적화에 대 한 프로토콜 결합-의 상태--예술 실험실 자동화, MBR 기술 온라인 프로세스 모니터링 및 Kriging 기반 데이터 분석/실험 설계와 함께 제공 됩니다. Kriging 방법론 MATLAB 도구 상자 (이 하 "KriKit") 다운로드 하 고 사용할 수 있는 구현 됩니다 무료 충전36입니다. 응용 프로그램 예를 들어, C. glutamicum 와 녹색 ﬂuorescent 분 비 단백질 (GFP) 생산의 극대화는 CgXII 최소 매체의 구성을 최적화 하 여 표시 됩니다. GFP titer 쉽게 측정할 수 있다 그리고 그것은 넓게 MBR 시스템37,,3839에 대 한 연구에 대 한 모델 단백질으로 적용 최적화 목적으로 선택 되었다.
제시 프레임 워크는 그림 1에 나와 있는 4 단계로 나누어져 있습니다. 단계 상자 프레임으로 표시 하 고 프로토콜의 섹션에 해당. (그림 1A)의 첫 번째 단계는 프로젝트 목표를 정의 하 고 필요한 방법을 결정입니다. 미상 방법론, MBR 기술 및 실험실 자동화의 조합은 강력한 데이터 처리를 요구 하는 증가 실험 처리량을 허용 한다. 두 번째 단계 (그림 1B) 중요 한 설계 변수 최적화 목표에 높은 영향 (즉, 중간 구성 요소)를 감지 하는 것을 목표로. 이것은 관심의 설계 변수는. 세 번째 단계 (그림 1C) 나머지 설계 변수 및 관심의 목표 사이의 기능적 관계의 더 상세한 조사를 위해 반복 최적화 구성 되어 있습니다. 연속적으로 확장 된 데이터 집합을 사용 하 여, Kriging 접근은 헤아릴 수 없는 위치에서 실험 결과 예측에 대 한 적용 됩니다. 반복 주기 Kriging 모델의 최적 또는 고원 충분 한 정확도로 예측 대로 중지 합니다. 결과 4 단계 (그림 1D), 확인 된 최적 주위 더 감도 분석 시작에서 확인 됩니다. 처음, 구분 구성 되지 중요 한 또한 최적의 지역에서 발견 되 면이 세 번째 단계에서 반복 최적화 절차 동안 진정한 보유 가정 하는 합리적입니다. 이후에, 최적화 결과 확인 하기 위해 직교 방법, 활동 분석 결과 또는 SDS 페이지 같은 응용 프로그램에 의해 조언 된다.
제시 프로토콜의 일반적인 특성 다른 실험실 장비, 다른 식 호스트 및 선택, 뿐만 아니라 더 bioprocess 대상 단백질을 쉽게 적응에 대 한 pH 값 또는 재배 온도 같은 변수를 수 있습니다.또한, 다른 최적화 목표 단백질 생산 속도, 특정 수익률, 또는 제품 품질 같은 다른 최적화 연구의 범위에 맞게 선택할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
그림 1 : 최적화 검토의 워크플로. 4 개의 프레임 상자 프로토콜, "마음속에 연구와 정의의 방법" (제 1), "민감도 분석" (제 2), "반복 최적화" (제 3), 및 "유효성 검사" (제 4)의 섹션에 해당합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>For cultivation in the BioLector device</td></tr><tr><td>Sealing foil</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Sterile sealing for Flowerplate</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&amp;uuml;lich</td><td>n/a</td><td>Freely available, MATLAB installation required</td></tr><tr><td>Janus pipetting robot</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Includes &quot;WinPrep&quot; software installation</td></tr><tr><td>12-column deep well microplate</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Container for medium stock solutions</td></tr><tr><td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>For Bradford protein assay</td></tr><tr><td>&amp;micro;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655087</td><td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td></tr><tr><td>Pipette Research&amp;nbsp;plus multi-channel pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td></tr><tr><td>TruPAG&amp;nbsp;Precast Gels</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. glutamicum&lt;/em&gt; pCGPhoD&lt;sup&gt;Bs&lt;/sup&gt;-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al.&lt;em&gt; &lt;/em&gt;&lt;em&gt;Appl Microbiol Biotechnol&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;76&lt;/strong&gt; (3), 633&amp;ndash;42 (2007)</td></tr></tbody></table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

산업 바이오 생산 미생물 세포 공장을 사용 하 여 핵심 사업 스트레인 엔지니어링의 반복적인 프로세스 이며 bioprocess 조건의 최적화. 1 개의 중요 한 양상은 관심 제품의 미생물 형성을 위한 최적의 환경을 제공 하기 위해 재배 매체의 개선 이다. 그것은 잘 미디어 구성 전체 bioprocess 성능을 좌우할 극적으로 허용 합니다. 영양 중간 최적화 재조합 단백질을 향상 알려져 있다 미생물 시스템 및 따라서이 생산 bioprocess 개발에서 보람 있는 단계입니다. 그러나, 수시로 표준 미디어 조리법에서에서 가져온 문학, 재배 매체의 맞춤형 디자인 microbioreactor 기술 지원 뿐만 아니라 충분 한 재배 처리량, 빠른 제품 분석을 요구 하는 지루한 작업 이므로 액체에 신뢰성 있게 로봇 공학 실험실에 의하여 처리 하는 단계. 또한, 고급 수학 메서드는 합리적으로 측정 데이터를 분석 하 고 효율적으로 최적의 정보 콘텐츠를 달성 하기와 같은 병렬 실험을 설계 하는 데 필요한.
제시 프로토콜의 일반 자연 다른 실험실 장비, 다른 식 호스트 및 관심, 뿐만 아니라 추가 bioprocess 매개 변수 대상 단백질에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 또한, 다른 최적화 목표 단백질 생산 속도, 특정 수익률, 또는 제품 품질 같은 다른 최적화 연구의 범위에 맞게 선택할 수 있습니다. 적용된 Kriging 도구 상자 (KriKit) 일반 도구에 대 한 디자인의 실험 (DOE) 향상 된 전체적인 bioprocess 최적화에 기여 하는. 그것은 또한 업스트림 및 다운스트림 프로세스 최적화에 중요 한 될 수 있는 다 객관적인 최적화를 지원 합니다.

은닉 GFP의 titer를 극대화 하기 위한 도입된 프로토콜 적용 되었습니다. 특히,는 GFP titer 후 재배의 17 h 최적화 목적으로 선정 되었다. GFP의 온라인 형광 탐지 간단한 제품 정량화를 허용. 그러나, GFP 신호 참조 재배에서 데이터의 정규화 재현성 및 결과의 comparability 불가결 하지 않습니다. 미디어 구성 요소의 사전 선택 섹션 1에서 설명한 대로 합리적으로 수행 되었다. 실험 제 1의 지침에 따라 수행 했다: 젖은 실험실 절차의 매개 변수가 일관성과 결과의 재현성을 보장 하는 모든 연구에 대 한 정의 했다.
제 2에 설명 된 대로 추가, 더 자세한 연구를 위한 최적화 목표에 중요 한 영향을 보여주는 관련 구성 요소를 식별 하는 데 초기 심사 수행 되었다. MTP 기반 MBR 시스템 48 실험을을 동시에 수행할 수 있습니다. 11-6 소수 적절 한 선택을 디자인 한 MTP (48)에 병렬 실험의 최대 가능한 번호 및 미디어 구성 요소 (11)은 24의 총 수 있습니다. 이 실험 설계 32 실험 구성 하 각 조사 미디어 구성 요소에 대 한 주요 효과의 추정 하며 나머지 재배 웰 스 (16) 여러 복제 참조 매체와 실험의 재현성 및 위치 효과 평가 하기 위해 사용 되었다. 즉, 각 실험 한 번 실시 (복제), 참조 실험 (5 복제)를 제외 하 고.
표 1 의 심사 분석 결과 요약합니다. 고려 농도 범위에서 대부분의 미디어 컴포넌트를 다양 한 목적에 눈에 띄는 효과 표시 하지 않았습니다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 강한 긍정적인 추세를 표시 하는 동안 구성 요소 NH4+ 강한 부정적인 효과 보여줍니다. Mg2 + 의 효과 현재 농도 범위에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 더 넓은 농도 범위에 대 한 수 있습니다. 따라서, NH4+ 매체에서 생략 하 고 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 추가 실험의 효과 조사 하기 위하여 결정 되었다.
제 3 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +의 농도 변화 하는 동안 GFP 형광 신호를 극대화 하는 데 사용 되는 반복 최적화 절차를 설명 합니다. 반복 1, NH4+ 생략 될 수 있다 가설 테스트를 했다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 의 농도 범위는 심사 분석에서 채택 되었다. NH4+ 의 최소 농도 0으로 설정 하 고 최대 농도 검사 실험에서 채택 되었다. 다음 실험에서 구성 요소 농도 27 실험의 결과로 정의 된 농도 범위 내 3 그리드 x 3 x 3는 배 부 되었다. 모든 경작 하는 동안 참조 매체의 5 복제 포함 했다 아무 위치 효과 MTP 통해 발생 하 고 내부 표준으로 봉사. 나머지 16 우물의 NH4+, 캘리포니아2 +, Mg2 + 농도 무작위로 주어진된 범위 안에 배포 했다.
그림 5 A 첫 번째 반복의 결과 시각화. 축 레이블을 원래 참조 매체에 사용 되는 구성 요소 농도를 참조 Ref x로 표시 된. 푸른 표면 KriKit 소프트웨어를 사용 하 여 계산 된 Kriging 보간을 나타냅니다. 각 표면 NH4+ 에 대 한 상대적인 농도와 연결 됩니다 (진한 파란색: 0 Ref, 체크 무늬 x: 1 Ref, 밝은 파란색 x: 2 Ref x). 이 시각적 유리한 NH4+를 생략 하는 것을 보여준다. 보간 표면 농도 증가 함께 모든 비행기 상승으로 또한 마그네슘2 + 그리고 캘리포니아2 +의 긍정적인 효과 보여줍니다.
반복 1의 결과 바탕으로, 그것은 결정 되었다 두 배로 최대 농도 농도 범위의 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 를 확장 하 고 실험 설계 창 우측 상단에 이동의 그림 5 참조 B.이 범위 내의 농도 6 × 6 격자에 배 부 되었다. 이 전체 농도 범위, 최적의 Kriging 보간 결과 동등한 배급을 보장 합니다. 그림 5 B 쇼 Kriging 보간 음모 결합 된 데이터에 따라 두 반복 (붉은 점 들과 노란색 사각형) 측정. 모두, 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 그들의 농도 증가의 긍정적인 효과 계속 됩니다. 따라서, 절차는 최대 농도 두 배로 반복 했다 하 고 따라서, 실험적인 디자인 창 오른쪽 상단 모서리의 경계를 탐구에 이동 되었다.
그림 6 A 나머지 최적화 절차의 개요를 제공. 반복 3까지 수집 된 데이터 세트의 분석 Mg2 +, 즉, 한 최적 농도 범위의 Mg2 + 의 긍정적인 효과의 한계 발견 했다 밝혔다. 따라서에 캘리포니아2 + (반복 4) 농도 범위 확대 결정 되었다. 이 절차를 두 번 반복 (반복 5, 6) GFP 신호의 채도 찾을 때까지. 이 채도 셀에 사용할 수 없습니다의 캘리포니아2 +, 적용된 농도 대 한 Ca-소금의 강 수에 의해 설명 된다.
실험 결과 항상 소음에 의해 교란 된다, 결과 Kriging 보간 나타납니다 불규칙 한 고 검사 틀린 결론으로 이어질 수도 있습니다. 그러나, 최적 농도 범위의 포화 GFP 신호에 대 한 미디어 구성 요소 통계 z-검정, 또한 KriKit에서 구현 되는 안정적으로 식별할 수 있습니다. Z-검정 Kriging 메서드, 즉, 예측 값 및 제공 예측 불확실성 본질적인 통계 정보 직접 사용 합니다. 그림 6 B 확인 된 고원, KriKit 도구 상자를 사용 하 여 결정 하 고 시각화 된 보여줍니다.KriKit 도구 상자 자유롭게 사용할 수36 와 그것의 기능을 사용 하는 방법을 설명 하는 자세한 자습서와 함께 제공 됩니다.
두 개 이상의 관련 구성 요소가 발견 되 면, 3D 시각화의 한계에 도달 합니다. KriKit 영화 또는 "상영 작" 등 다른 여러 가지 가능한 시각적 방법을 제공합니다. 최적의 잠재력 정의 된 농도 범위 안의 경우, 새로운 실험 예상된 향상 률40,46을 사용 하 여 자동으로 설계 됩니다. 예상된 향상 률에 따라 실험 설계 KriKit 도구에 통합 된다. 더 자세한 정보는 소프트웨어 설명서에서 찾을 수 있습니다.
반복 절차 후 결과 확인 실시, 부분 d.에 설명 된 대로 초기가 정의 타당성 최적의 매체 구성을 사용 하 여 추가 민감도 분석을 수행 하 여 확인 했다. 즉, 관심의 모든 초기 미디어 구성 요소 변화 했다, 그러나 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 그들의 최적 농도 수준으로 설정 했다. 이 연구에서 최적의 농도 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 Ref x와 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6.8 x Ref 선정 됐다. 표 2 는 유효성 검사의 결과 보여 줍니다. NH (cf. 표 1), 심사 초기 감도 비슷한4+ 아직도 상당한 부정적인 영향 있으며 나머지 효과 여전히 무시할 수 있습니다.
때문에 쉬운 접근, 재배 정지에서 GFP 형광 신호 모든 실험 동안 extracellular GFP titer를 계량 하 사용 되었다. 확인을 위해 GFP 형광은 다른 측정에 대 한 유효성이 검사 됩니다. GFP는 문신-통로 통해 분 비, 때문에 형광 신호 사이 내-extracellular GFP 차별 수 없습니다. 따라서, 경작 기준 매체와 최적화 된 매체를 사용 하 여 재현 했다. 셀 무료 재배 supernatants에서 형광 측정 외 단백질 콘텐츠 Bradford 분석 실험과 (반) 정량은-SDS 페이지15시각 질적 GFP 개선. 모든 결과 측정 신호 했다 약 두 배가 경작에 대 한 검증 기준 매체에 비해 최적화 된 매체는 분 비 성능 최적화 된 매체의 약 100% 향상. 따라서, 재배 서 스 펜 션의 GFP 특정 형광 여겨질 수 있다 최적화 목적, 즉, extracellular GFP titer에 대 한 적합 한 통계.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
그림 2 : 민감도 분석에 대 한 볼륨 pipetting 목록에서 스크린샷. 첫 번째 열에 있는 항목 행;의 모든 볼륨에 고유한 식별자 할당 이 식별자는 MTP 잘 그림 4C cf. 액체 처리기 작업 테이블에 대상 재배 MTP의 번호입니다. 나머지 열 pipetted 수를 다른 솔루션 ("Sln-01" "Sln-15")에 대 한 볼륨을 인코딩합니다. 한 행의 누적 볼륨 잘 해당 최종 재배 볼륨에 해당 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
그림 3 : 제어 소프트웨어 "WinPREP"를 처리 하는 액체에서 스크린샷. 왼쪽: 행 정렬 명령을, pipetted 수를 재고 각 솔루션에 대 한 전송 명령을 포함 합니다. Inoculum 추가 대 한 마지막 명령 하기 전에 사용자 프롬프트 씨 문화 시간에 테이블에 배치 됩니다 보장 하기 위해 삽입 됩니다. 나머지 재고, 물 및 미디어 준비 대상 재배 MTP inoculum, 변형 주식 (12 열 같은 웰 스와 2 개의 깊은 잘 격판덮개), 시 약 물에 대 한 소스 기구를 포함 하 여 작업 테이블의 오른쪽: 회로도 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
그림 4 : 재고 솔루션의 pipetting의 설치에 대 한 상세한 스크린샷 편집. (A) 철 재고 pipetting 명령을 풀어. 소스 기구 및 소스 잘 내는 작업 테이블에 의해 표시 읽기 프레임 및 해당 깊은 잘 격판덮개의 붉은 열. 대상 기구와 내 대상 우물 주위 블루 프레임 대상 재배 MTP의 블루 웰 스에 의해 표시 됩니다. 이 단계 (철 재고 솔루션) pipetting 볼륨의 할당에 (B) 상세한 예제 보기. 취항지 수는 48 행 pipetting 목록에서 읽습니다. Fe 재고 솔루션에 대 한 모든 대상 웰 스에 대 한 디스 펜스 볼륨 열 4 pipetting 목록에서에서 발견 된다. Note pipetting 목록에서 첫 번째 열 식별자 및 전송, 그림 2참조 하지 볼륨 포함. (C) 세부 사항 잘 번호 대상에. 해당 pipetting 목록의 행 # 1에에서 작성 된 볼륨 잘 # 1으로 표시로 pipetted 될 것입니다. 웰 스 #01, #08, # 41와 #48 또한 재배 MTP 자체에 인쇄 된 웰 스 A01, A08, F01 및 F08 알파-숫자 코딩에 대 한에 해당 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
그림 5 : 첫 번째 반복에서 결과 상세한. (A) 반복 1의 실험 데이터를 기반으로 하는 Kriging 보간. 빨간 점 데이터 집합을 나타냅니다. 비교를 위해, 모든 3 보간 서피스는 하나의 음모에 오버레이 (진한 파란색: 0 Ref, 체크 무늬 x: 1 Ref, 밝은 파란색 x: 2 Ref x). 결과 대 한 대체 표현은 다른15를찾을 수 있습니다. (B) 실험에 따라 Kriging 보간 반복 1 (빨간 점) 및 반복 2 (노란색 사각형)에 수행.이 그림에 표시 하는 데이터의 부분15이전에 게시 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
그림 6 : 반복적으로 수집된 최적화 결과의 묘사. (A) 최종 Kriging 예측 모델. Z통계 기반으로 하는 최적의 지역 (빨간색)의 (B) 통계 확인-테스트는 KriKit에 의해 제공 됩니다. 상자는 반복적인 디자인의 연속 단계와 실험의 실행을 나타냅니다. 이 그림에 표시 하는 데이터의 부분15이전에 게시 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>정규화 계수 값을 의미</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>미네소타2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>무42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>보33-</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>캘리포니아2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 민감도 분석의 결과. 계수 값의 최대 값을 그것의 중심 값에서 해당 미디어 구성 요소 농도 증가 하는 때 평균 효과 나타내는. 최적의 실험 설계로 표준 문학에 발견 하 고 여기에 사용, 표준 편차 대표 직접 참조 실험의 복제로 인해 실험 변형. 계수 값은 maxium 값 (구성 Ca2 +0.0422)으로 정규화 됩니다. 정규화 된 절대 계수 표준 편차 각각 0.54와 0.0226, 이다.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>정규화 계수 값을 의미</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>미네소타2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>무42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>보33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 최종 민감도 분석의 결과. 계수 값의 최대 값을 그것의 중심 값에서 해당 미디어 구성 요소 농도 증가 하는 때 평균 효과 나타내는. 최적의 실험 설계를 사용로 표준 편차만 최적화 된 중간 구성을 사용 하 여 실험 변형에 따라 다릅니다. 실험적인 변형 참조 매체를 사용 하 여 변형에 비해 약간 증가 했다. 계수 값은 maxium 값 (구성 요소 미네소타2 +0.0106)으로 정규화 되었다. 정규화 된 절대 계수 표준 편차 각각 3.63와 0.0385, 이다.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

generic-protocol-for-optimization-heterologous-protein-production

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K 조회수.  Forschungszentrum Jülich. 이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

비디오: Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

연구

의학

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst immobilization for improved production yield and sustained synthesis. Described herewith is the experimental procedure for the development of such a system consisting of two E. coli strains that express functionally complementary enzymes. Together, these two enzymes can function co-operatively to mediate the regeneration of expensive cofactors for improving the product yield of the bioreaction. In addition, the method of synthesizing an immobilized form of the coupled biocatalytic system by encapsulation of whole cells in calcium alginate beads is reported. As an example, we present the improved biosynthesis of L-xylulose from L-arabinitol by coupling E. coli cells expressing the enzymes L-arabinitol dehydrogenase or NADH oxidase. Under optimal conditions and using an initial concentration of 150 mM L-arabinitol, the maximal L-xylulose yield reached 96%, which is higher than those reported in the literature. The immobilized form of the coupled whole-cell biocatalysts demonstrated good operational stability, maintaining 65% of the yield obtained in the first cycle after 7 cycles of successive re-use, while the free cell system almost completely lost the catalytic activity. Therefore, the methods reported here provides two strategies that could help improve the industrial production of L-xylulose, as well as other value-added compounds requiring the use of cofactors in general.

Presented is the protocol for co-immobilizing whole-cell biocatalysts for cofactor regeneration and improved reusability, using the production of L-xylulose as an example. The cofactor regeneration is achieved by coupling two Escherichia coli strains expressing functionally complementary enzymes; the whole-cell biocatalyst immobilization is achieved by cell encapsulation in calcium alginate beads.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

화학

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

생체공학

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab and industrial scale. However, due to its toxicity and flammability, there is a desire to avoid methanol while maintaining the high productivity of P. pastoris. Small scale bioreactor cultivations (0.5-5 L working volume) are commonly used to evaluate a strain and its protein production characteristics since microscale cultivation in deep well plates can be hardly controlled or relies on expensive equipment. Furthermore, traditional protocols for the cultivation and induction of P. pastoris were established for constitutive expression or methanol induction and so far, no reliable protocols were described to screen P. pastoris expression strains with derepressible promoters in (controlled and monitored) parallel cultivations. To simplify such initial cultivations to characterize and compare new protein production strains, we established a simple shake flask cultivation system for methanol free expression that simulates bioreactor conditions including a constant slow glycerol feed and online monitoring, thereby coming closer to the real conditions in bioreactors compared to mostly applied small scale batch cultivations. To drive recombinant protein expression in P. pastoris, the carbon source repressed promoters PDC and PDF were applied. Polymer discs with embedded carbon source, releasing a constant amount of glycerol, assured a feed rate delivering the necessary energy for maintaining the promoters active while keeping the biomass generation low.

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

This method for the first time describes reliable experimental procedures for efficient inducible methanol-free recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), employing the carbon source regulated promoters PDCand PDF in small scale experiments while cultivation parameters can be monitored online, and a constant glycerol feed is applied.

Pichia Pastoris 탈 억제 기술을 채용 하 여 메탄올 독립 식

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

생물학

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and reagents. Moreover, microplate-based high-throughput cultivation methods developed in recent years have poor microbial growth status and experiment parallelization because of their low dissolved oxygen, poor mixture, and severe evaporation and thermal effect. Due to many advantages of micro-droplets, such as small volume, high throughput, and strong controllability, the droplet-based microfluidic technology can overcome these problems, which has been used in many kinds of research of high-throughput microbial cultivation, screening, and evolution. However, most prior studies remain&#160;at the stage of laboratory construction and application. Some key issues, such as high operational requirements, high construction difficulty, and lack of automated integration technology, restrict the wide application of droplet microfluidic technology in microbial research. Here, an automated Microbial Microdroplet Culture system (MMC) was successfully developed based on droplet microfluidic technology, achieving the integration of functions such as inoculation, cultivation, online monitoring, sub-cultivation, sorting, and sampling required by the process of microbial droplet cultivation. In this protocol, wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 and a methanol-essential E. coli strain (MeSV2.2) were taken as examples to introduce how to use the MMC to conduct automated and relatively high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution in detail. This method is easy to operate, consumes less labor and reagents, and has high experimental throughput and good data parallelity, which has great advantages compared with conventional cultivation methods. It provides a low-cost, operation-friendly, and result-reliable experimental platform for scientific researchers to conduct related microbial research.

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

This protocol describes how to use the Microbial Microdroplet Culture system (MMC) to conduct automated microbial cultivation and adaptive evolution. MMC can cultivate and sub-cultivate microorganisms automatically and continuously and monitor online their growth with relatively high throughput and good parallelization, reducing labor and reagent consumption.

미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.