이온 및 RGB 자금: PZ00P3 142404/1, PZ00P3 163979 스위스 국립 과학 재단 Ambizione-점수 부여.

모든 실험 ARVO 문을 따라 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 수행 했다 및 지방 기관에 의해 승인 했다.
 1. 준비 Ultrathin 섹션의 실리콘 웨이퍼 <ol><li>샘플 고정 <ol><li>0.1%도, 0.1 m M cacodylate 버퍼에 4% 포름알데히드를 포함 된 통 솔루션 준비. 
		참고: 주의! 도, 포 름 알 데히드 및 cacodylate 버퍼에 작업할 때 주의 사용 하 여 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 증기 두건에서 일.</li>
		<li>안락사 5 일 게시 수정 (5 dpf) zebrafish 애벌레 tricaine (에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate, PBS (인산 염 버퍼 염 분, pH 7)에서 0.4 %w / v)와 앞에서 설명한 15.</li>
		<li>얼음에 미리 냉장된 통 솔루션에 집중 하 여 애벌레를 수정. 머리를 제거 하 고 부드러운 락 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>트리밍 1 %agarose 베드 플레이트에 냉장된 통 솔루션의 미세 집게와 (쌍안경) 아래 서 메스를 사용 하 여 눈 주위 조직에 의해 눈을 해 부. 신선한 냉장된 사전 정착 액 튜브 눈 전송.</li>
		<li>각 세척 실 온 (RT)에서 5 분 동안 PBS (인산 염 버퍼 염 분, pH 7.4)에 두 번 세척.</li>
	</ol></li> <li>젤라틴 침투와 장착 <ol><li>워밍업-15 mL 지역 식품 브랜드 젤라틴 12 %w / v 샌드위치 (인산 염 버퍼, 0.1 m M pH 7.4)에 40 ° C. PBS를 제거 하 고 눈을 들어 있는 튜브에 젤라틴 해결책을 추가 하십시오. 부드럽게 젤라틴 침투 샘플 및 부드러운 떨고와 thermoblock 또는 물 욕조에 40 ° C에서 10-30 분 동안 품 어 튜브 누릅니다.</li>
		<li>채우기 12 m m x 5 m m x 3 m m 실리콘 또는 폴 리 에틸렌 40 ° C 물 욕조에 따뜻한 젤라틴으로 금형을 포함 하는 평면. 추가 곰 팡이를 피 펫을 사용 하 여 당 두 눈, 제대로 해 부 바늘을 사용 하 여 눈 아래 그들을 정렬 시키고 젤라틴 1 분 동안 실내 온도에 아래로 냉각 하 고 20 분에 4 ° C에서 강화</li>
		<li>다시 잘라 면도날을 사용 하 여 블록 당 한쪽 눈에 맞게 눈 아래 젤라틴 블록.</li>
		<li>얼음에 샌드위치에 2.3 M 자당 포함 된 젤라틴 눈 전송. 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>Exchange 새로운 2.3 M 자당 솔루션 및 4 ° C 또는-20 ° C에 게가이 단계 후 샘플 단면에 대 한 준비가 또는 개월에 몇 주 동안-20 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>다시 cryo-핀에 전송 하기 전에 눈의 거의 크기에 젤라틴 블록을 잘라. 액체 질소 및 곳을 알아내는-ultramicrotome 이전에 동결.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>cryo ultramicrotome에 다이아몬드 칼으로-120 ° C에서 잘라 110 nm 두께-섹션.</li>
		<li>유선 루프 (물)에 2% 스와 2.3 M 자당 솔루션 (1:1)의 작은 물방울을 포함 하는 섹션을 선택 합니다. 7 x 7 mm 실리콘 웨이퍼에 섹션을 전송. 추가 처리까지 4 ° C에서 섹션 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>방울에 웨이퍼를 거꾸로 배치 하 여 4 개의 상품에 20 분에 대 한 0 ° C에서 PBS로 세척 웨이퍼. PBS는 실내 온도에 2 x 2 분에 세척.</li>
	<li>품 어 3 번, PBS에 0.15% 글리신에 1 분. 1 분 동안 3 배 세척/PBS로 세척. 5 분에 PBG (0.5% 소 혈 청 알 부 민 BSA와 0.2% 젤라틴 타입 B PBS)와 미리 incubate</li>
	<li>토끼 안티-Tom20와 품 (재료의 표 참조) PBG에 (4 µ g/mL) 실 온에서 30 분.</li>
	<li>는 PBG에 1 분/세척을 위한 6 x를 씻어. 반대로 토끼 알 렉 사 647 F(ab&#39;) 2 실시간 품에서 5 분 동안 PBG로 사전 incubate (재료의 표 참조) PBG에 (7.5 µ g/mL) 30 분에 대 한</li>
	<li>는 PBG에 1 분/세척을 위한 6 x를 씻어. PBS에서 3 x 2 분을 씻어. DAPI 함께 품 어 (4 µ g/mL) 10에 대 한 PBS에 PBS에 2 x 2 분 세척 s..</li>
</ol> 3. 슈퍼 해상도 현미경 <ol><li>품 웨이퍼 짧게 (10 s) 글리세롤 (80%)의 1:1 솔루션의 물방울에 그것을 배치 하 고 이미징 버퍼 청소 시스템 (200 m m 인산 염 버퍼 10% 포도 당, 0.5 mg/mL를 포함 하는 산소를 포함 하 여 glucoseoxidase, 40 µ g/mL catalase 15 m m 베타 mercaptoethylamine 염 산 염 (MEA HCL), pH 8.0).</li>
	<li>글리세롤 (80%)의 1:1 혼합물의 신선한 방울에 유리 하단 (두께 170 ± 5 μ m) 페 트리 접시 (섹션 아래로 향하게) 웨이퍼 전송 및 이미징 (3.1 단계)에서 버퍼.</li>
	<li>피 펫와 모든 면에서 웨이퍼 아래 액체의 대부분을 제거합니다. 페 트리 접시의 바닥에 웨이퍼를 해결 하기 위해 사용 하는 실리콘 줄무늬. 
	참고: 실리콘 줄무늬 2 구성 요소 실리콘 접착제 (3 m m x 12 m m) 밖으로 만들어집니다.</li>
	높은 수 가늠 구멍을 사용 하는 거꾸로 한 현미경에 <li>이미지 섹션 (예: 160 X / 나 1.43; 참조 테이블의 재료) 기름 침수 슈퍼 해상도 전용된 목표. 이미징, 이전 하자 최소화/측면 및 축 드리프트를 줄이기 위해 현미경 온도 equilibrate 샘플.</li>
	<li>관심 영역을 가운데로 하 고 첫 번째 widefield epifluorescence 참조 이미지. 슈퍼 해상도 동작 모드를 변경 합니다. 15 ms에 카메라의 노출 시간을 조정 하 고 설정 (EM) 이득 300 최대 멀티 전자.</li>
	<li>조명 샘플은 642 nm 연속파 레이저 epifluorescence 모드에서 최대 레이저 전력 (~2.8 kW/c m 2에 해당)에서. 최대한 빨리 단일 분자 깜박이 잘 분리 각 프레임에 그래서 확률은 낮은 개별 신호 오버랩, 레이저 파워 ~0.7 kW/c m 2로 설정. 30000 프레임의 최소 인수 epifluorescence 모드에서 raw 이미지를 기록. 
	참고: 이러한 모든 매개이 변수 및 밀도 라벨 다른 표본에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>원시 데이터 로부터 재구성 이벤트 목록 (raw 이미지에 각 단일 분자 깜박임의 지역화) 생성을 클릭 하 여 30 광자 (샘플에 따라 조정 될 필요가)의 검출 임계값을 사용 하 여 &#34; 평가 &#34;에 &#39; t-시리즈 분석 &#39;에서 &#39; 도구 &#39;.</li>
	<li>가우스 피팅 16 4의 렌더링 픽셀 크기를 적용 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 시각화를 클릭 하 여 nm &#34; 이미지 만들기 &#34;에 &#39; 이벤트 목록 처리 패널 &#39;에서 &#39; 도구. &#39; 
	참고: 슈퍼 해결된 이미지 생성에 대 한이 연구에 사용 된 시스템의 통합된 소프트웨어 도구 채택 되었다. 그러나, 어떤 다른 단일 분자 기반 시스템에 설명된 슈퍼 해상도 이미지를 수행할 수 및 데이터는 오픈 소스 소프트웨어 도구와 뇌우 17로 처리 될 수.</li>
</ol> 4. 플래티넘 Shadowing <ol><li>실리콘 줄무늬를 제거 하 고 배양 접시에서 그것을 해제 하는 웨이퍼의 가장자리 가까운 PBS의 한 방울을 추가. 웨이퍼에 PBS, 2 x 2 분 5 분 2 분 2 배 세척 / PBS에 씻어 게시물 PBS에 0.1%도 함께 그것을 해결 하는 다음 씻어.</li>
	<li>품 5에 대해 두 번 웨이퍼 분/얼음 물에 스 2%의 1 방울에 부 화 원심 분리기 튜브에 웨이퍼를 삽입 하 고 원심 14100 x g에서 90 미 탑재 그것에 실시 하는 탄소 시멘트와 sem의 알루미늄 스텁.</li>
	<li>2 ~ 10의 레이어를 추가 전자를 사용 하 여 8 ° 회전 섀도잉 의해 샘플에 백 금/탄소 nm 빔 증발 장치 설정: 1.55 k v, 55 0.3 nm/s, 및 8 °, 회전 레벨 4의 각도에서 mA.</li>
</ol> 5. 스캐닝 전자 현미경 <ol><li>스캔 이미지 섹션 전자 microscope 1.5 k v, 2 mm 작업 거리와 렌즈 2 차 전자 검출기는 in.</li>
</ol> 6. 빛과 전자 현미경 이미지의 맞춤 <ol><li>오픈 두 종류의 이미지를 클릭 하 여 피지 18 &#34; 파일 | 오픈 &#34;. 클릭 하 여 캔버스 크기 조정 &#34; 이미지 | 조정 | 캔버스 크기 &#34;를 클릭 하 여 두 이미지 스택을를와 &#34; 이미지 | 스택 | 이미지 스택 &#34;. Tiff 파일 형식으로 스택에 저장.</li>
	<li>피지에서 클릭 하 여 새로운 TrackEM2 19 인터페이스를 열고 &#34; 파일 | 새로 만들기 | TrackEM2 (새로운) &#34;. 검은 창에 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 선택 하 여 두 이미지 스택 가져오기 &#34; 가져오기 스택 &#34;.</li>
	<li>맞춤 빛 현미경 이미지 랜드마크 이미지에 오른쪽 마우스 클릭을 사용 하 고 선택 하 여 수동으로 전자 현미경 이미지를 &#34; 정렬 | 랜드마크와 수동으로 레이어를 정렬 &#34;.
	랜드마크를 추가할 <ol><li>선택 선택 도구 (검은색 화살표). 참고로 핵의 형태를 사용 하 여 두 이미지 (보충 그림 1)에서 동일한 가장자리를 선택. (최소 3 포인트 선택 해야) 하는 몇 가지 포인트를 추가 합니다. 오른쪽 마우스를 클릭 하 고 선택 하 여 정렬 된 유사 모델 적용 &#34; 변환을 적용 | 관계 모델 &#34;.</li>
	</ol></li> <li>레이어 투명도 변경 (보충 그림 1 참조)는 정렬의 품질을 평가 하기 위해.</li></ol>

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	<li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Super-Resolution+Microscopy:+New+Dimensions+and+New+Opportunities.">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. 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저자는 공개 없다.

이 방법은 결합 슈퍼 해결된 단백질 지역화 컨텍스트 정보는 세포 기관이에 단백질의 정확한 위치를 결정 합니다. 여기 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 처럼 다른 세포에 그것의 관계의 외부 막 또는 애벌레 zebrafish 망막에 포토 리셉터의 외부 세그먼트에 Tom20의 표현을 시각화 하는 실험의 완료 보여 줍니다.
Tokuyasu 곳을 알아내는-단면 잘 보존 된 섹션을 얻으려면 몇 가지 훈련이 필요 합니다. 그러나,이 방법은 시연된 성공21많은 실험실에서 고용입니다. 실리콘 웨이퍼는 섹션의 이전은 매우 간단 하 고 아무 특별 한 고려가 필요 하다. 이미지 버퍼에 글리세롤 사용 섹션의 건조를 피하기 위해 매우 중요 한 단계입니다. 최고 해상도 영상에 대 한 최상의 결과 얻을 수 있습니다 때 웨이퍼 페 트리 접시의 유리 바닥 매우 가깝습니다. 실리콘 줄무늬가이 위치에 웨이퍼를 유지 하는 데 도움이. 특별 한 주의 섹션의 손상을 방지 하기 위해 줄무늬를 제거 하는 동안 촬영 했다.
곳을 알아내는-섹션, 약 100의 두께 nm, Z 차원에서 광학 해상도 보다 얇은 또한 용이 하 게 상호이 방법의 정확도 슈퍼 해상도 현미경 신호가 얇은 층에서 오고 있다 고는 스캐닝 전자 현미경 신호는 샘플의 지형을 표시 합니다. 이 메서드는 멀티 컬러 이미징 또한 결합 수 있습니다. 그러나, 특별 한 주의 기울여야 합니다 샘플 같은 조건 (예: 이미지 버퍼) 몇 군데 수 및 크로스 토크를 방지 한다.
방법의 한 가지 한계는 그것의 2 차원 접근, 이후 직렬 섹션 (약 3 ~ 7 웨이퍼 당)의 제한 된 수만 수집할 수 있습니다. 따라서, 프로젝트 분석을 다루는 이상 하지 않을 것 이다. 그러나, 그것은 샘플의 간단한 단면에 의해 단백질 표정 모든 종류의 조직에서 검출에 적용 될 수 있는 방법입니다. 우리 같은 uranyl 아세테이트 또는 리드 시트르산 고전 조 영제의 사용 하지 않고 메서드를 제공합니다. 플래티넘 섀도잉 의해 대비 매우 유익한 지형 대조를 제공 하지만 경우에 따라 막 해결 하기 어려운. 이, 예를 들어 작은 소포에 있는 단백질의 식을 결정 하려면 프로젝트에 대 한 문제를 포즈 수 있습니다.
Tokuyasu 곳을 알아내는-섹션에 따라 우리의 프로토콜 표준 장비를 사용 하 여 슈퍼 해상도 스캐닝 전자 현미경에서 상호 결과 얻을. 실리콘 웨이퍼에 대 한 섹션의 컬렉션 및 대비에 대 한 백 금을 사용 하 여 간단한 단계를 제공 하는 안정성과 재현성 샘플 준비에 있습니다.

단백질 및 세포의 다른 구획을 그들의 관계의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법 그들의 기능 및 가능한 상호 작용을 이해 하는 필수적인 도구는. 슈퍼 해상도 현미경 전자 현미경과 함께에서1등 정보 제공합니다. 바닥 상태 고갈 현미경 개별 분자 반환 (GSDIM)에 의해 다음 다양 한 유기와 유전으로 인코딩된 fluorophores2 와 호환 하는 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 이며 20 최대 가로 해상도 달성 한다 nm 3. 표준 회절 제한 현미경 보다 높은 해상도로 방법의 상관 관계4,,56의 정확도 향상 시킵니다. 단백질 표정 특정 subcellular 구획의 가장 좋은 상관 관계를 달성 하기 위하여 불확실성7 빛과 전자 현미경 검사 법에 대 한 동일한 ultrathin 섹션의 사용의 볼륨을 줄일 것이 좋습니다. 다른 단면 방법 중에서 Tokuyasu 곳을 알아내는-섹션 프로토콜 탈수 또는 수 지 포함 필요 하지 않습니다 또한, 많은 epitopes의 antigenicity 보존 그리고, 좋은 조직 열 대권 외의8을 제공 합니다. 여러 가지 방법을 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)4,5,,910에서이 섹션의 적용을 설명 했다.
Zebrafish 망막 시각적 개발 및 척추에 걸쳐 매우 보존된 구조와 기능을 부여 하는 인간 질병 메커니즘 연구에 귀중 한 모델입니다. 특히, 망막 대뇌 디스플레이 포유류 대뇌, 기저 냅, apico-basally 길쭉한 핵과와 동일한 아키텍처 멤브레인의 구성 더 꼭대기 내부 세그먼트 외부 세그먼트에서 미토 콘 드리 아의 클러스터링 가장 꼭대기 위치11디스크. 다양 한 세포질 구획에 단백질 지역화는 제 브라 사이 보존 하 고 인간, 인간 질병 관련 단백질12,13의 생물학 기능의 조사를 허용 합니다.
여기 선물이 애벌레 zebrafish 상호 슈퍼 해상도 빛과 전자 현미경에 의해 미토 콘 드리 아 외부 막 단백질 Tom20의 지역화를 해결 하기 위해 망막 샘플을 준비 하는 프로토콜. 방법은 실리콘 웨이퍼에 수집 하는 곳을 알아내는-섹션에 기반 하 고 금의 얇은 층의 적용 후 생산 대비 지형 정보 취득. 이 단계는 사용, 재현성, 및 실험을 완료 하는 시간의 용이성 측면에서 분명 기술 개선. 우리는 최근에 마우스 조직14핵 숨 구멍 및 미토 콘 드리 아 단백질을 검출 하기 위하여 방법의 적용을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde EM Grade</td><td>EMS, USA</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Flat embedding molds</td><td>BEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Local food brand gelatin</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin type B</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Si-Mat Silicon Materials</td><td></td><td>Type: P/Boron; Orientation &amp;lt;111&gt; ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Cryo-pin</td><td>Baltic Preparation</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>Wired loop &quot;Perfect loop&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone stripes</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>glucoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C40</td><td></td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab&#039;)2 fragment donkey anti rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Switzerland</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom petri dish</td><td>Ibidi, Germany</td><td>u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158</td><td></td></tr><tr><td>SEM aluminium stub</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>Conducting carbon cement Leit-C</td><td>Plano, Germany</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160x 1.43 TIRF objective</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina

우리는 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법을 조합 하 고 스캐닝 전자 현미경 애벌레 zebrafish 망막에 단백질 subcellular 지 방화를 조사 하는 방법을 제시. 슈퍼 해상도 가벼운 현미경의 하위 회절 한계 해상도 기능 상관된 데이터의 정확도 향상 수 있습니다. 간단히, 110 나노미터 두꺼운 곳을 알아내는-섹션 실리콘 웨이퍼에 전송 되 고, 슈퍼 해상도 가벼운 현미경에 의해 몇 군데는 면역 형광 염색 법, 후. 그 후, 섹션 스와 백 금 영상 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 이전 그림자에 보존 됩니다. 이러한 두 현미경 형식에서 이미지 쉽게 오픈 소스 소프트웨어 조직 랜드마크를 사용 하 여 병합 됩니다. 여기는 애벌레 zebrafish 망막에 대 한 적응된 방법에 설명합니다. 그러나,이 방법은 또한 조직 및 생물의 다른 종류에 적용 됩니다. 이 상관 관계에 의해 얻은 보완 정보는 세포 막과 관계 있는 미토 콘 드리 아 단백질의 표현과 cristae 미토 콘 드리 아 뿐만 아니라 셀의 다른 구획으로의 해결할 수 설명 합니다.

Tom20, translocase 미토 콘 드리 아 외 막 복잡 한20, 소 단위 단백질의 표현, 애벌레 zebrafish 망막의 얇은 단면도에서 의해 결정 되었다 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법 (그림 1) 하 고이 정보는 동일한 섹션의 플래티넘 숨기기 후 전자 현미경을 스캐닝 하 여 얻은 지형 신호를 구비. 이러한 상호 데이터 연관 특정 구획, 외부 미토 콘 드리 아 막에 있는 단백질의 지 방화를 확인 하 고, 또한 셀의 다른 세포와 단백질의 관계에 대 한 정보를 제공.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
그림 1: 클레 멘 타인 zebrafish 망막에. A. 낮은 배율 widefield 이미지 부분의 5 dpf zebrafish 망막, 핵 DAPI (녹청)으로 물. B. 동일한 영역의 전자 현미경 스캐닝. C. B. 핵에 프레임의 높은 배율 widefield 이미지 DAPI (녹청)로 얼룩진 고 빨간색으로 나타납니다 Tom20 미토 콘 드 리아 얼룩. 높은 배율에서 같은 섹션의 D. Widefield 이미지. Tom20 식의 미토 콘 드리 아의 클러스터에서입니다. 중 식의 Tom20 (빨간 점) GSDIM 현미경 검사 법에 의해 감지. 핵은 DAPI (녹청)과 스테인드. F. 전자 상호 슈퍼 해상도 결합 하 고 스캐닝 전자 현미경 검사 법으로 동일한 섹션. Tom20 얼룩 (붉은 점) 미토 콘 드리 아의 바깥쪽 막에서 미토 콘 드리 아 클러스터 (M)에 나타납니다. SEM 이미지의 지형과 형광 DAPI 신호 핵 (N)에 해당합니다. G. f.에 프레임의 고배율 이미지 스캐닝 전자 현미경 이미지 GSDIM 이미지 (빨간 점)에 컨텍스트를 제공합니다. 미토 콘 드 리아 cristae 명확 하 게 볼 수 있으며 미토 콘 드리 아의 바깥쪽 막 지역화 Tom20 얼룩. 외부 세그먼트의 막을 대뇌 (OS) 명확 하 게 해결 됩니다. 이미지 픽셀 크기 5 nm 스케일 바: A, B, 및 c: 10 µ m; D: 2 µ m; E와 f: 1 µ m와 g: 0.2 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1: 빛과 전자 현미경 이미지의 정렬. A. SEM 이미지와 번호가 랜드마크 다른 핵을 따라 (노란색)와 TrackEM2 인터페이스에서 화면. B. 형광 이미지와 다른 DAPI 따라 번호 랜드마크 (노란색)와 TrackEM2 인터페이스에서 스크린샷 스테인드 핵. 레이어 투명도 변경 하려면 메뉴의 왼쪽된 상단 부분에 슬라이더를 사용할 수 있습니다. 눈금 막대: 1 µ m입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

이 정서의 결과 얻기 위해 단백질 subcellular 지역화 zebrafish 망막에 상관 빛 슈퍼 해상도 현미경 및 전자 현미경 이미지를 검색 하 여 필요한 단계를 설명 합니다.

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

correlative-super-resolution-electron-microscopy-to-resolve-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K 조회수.  University of Zurich. 이 정서의 결과 얻기 위해 단백질 subcellular 지역화 zebrafish 망막에 상관 빛 슈퍼 해상도 현미경 및 전자 현미경 이미지를 검색 하 여 필요한 단계를 설명 합니다.

비디오: Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

신경과학

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

생물학

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Synaptic Circuits Analysis and Protein Localization in the Mouse Retina(마우스 망막의 시냅스 회로 분석 및 단백질 국소화)

Investigating Retinal Circuits and Molecular Localization by Pre&#45;Embedding Immunoelectron Microscopy

The retina comprises numerous cells forming diverse neuronal circuits, which constitute the first stage of the visual pathway. Each circuit is characterized by unique features and distinct neurotransmitters, determining its role and functional significance. Given the intricate cell types within its structure, the complexity of neuronal circuits in the retina poses challenges for exploration. To better investigate retinal circuits and cross-talk, such as the link between cone and rod pathways, and precise molecular localization (neurotransmitters or neuropeptides), such as the presence of substance P-like immunoreactivity in the mouse retina, we employed a pre-embedding immunoelectron microscopy (immuno-EM) method to explore synaptic connections and organization. This approach enables us to pinpoint specific intercellular synaptic connections and precise molecular localization and could play a guiding role in exploring its function. This article describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including (1) retina fixation preparation, (2) pre-embedding immunostaining, and (3) post-fixation and embedding.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 생쥐의 망막 시냅스 연결성 및 신경전달물질 국소화의 초구조적 기초 이해

This protocol outlines the detailed steps of pre-embedding immunoelectron microscopy, with a focus on exploring synaptic circuits and protein localization in the retina.