Name: pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
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저자 감사 Benoit Sorre, Damien Cuvelier, 피에르 Nassoy, 프랑수아 Quemeneur, 및 그들의 필수 기여에 대 한 길 Toombes 그룹에서 나노튜브 메서드를 설정 합니다. 샌드위치 그룹 속하는 CNRS 컨소시엄 CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), 그리고 파리 과학 외 Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai EMBO 장기 친교 (ALTF 1527-2014)과 마리 퀴리 행동 (H2020-MSCA-IF-2014, 프로젝트 막 ezrin 말라)에 의해 투자 되었다. 석사 시 몬스 사회 휄 로우의 주니어 연구원 이다.

저자는 공개 없다.

하지만, 막의 기본적인 기계적 특성 측정을 의미 하지만 단백질 및 막 간의 결합에 빛을 발산 하는 데 도움이 막 단백질 시스템에 풍부한 정보를 제공 하는 GUVs에서 튜브를 당기기의 방법 곡률입니다. 소개에서 설명 했 듯이, 다른 기술을 서브 미크론 리19 세 표면18,곁에와 단백질을 배양 하거나 관찰 하 여 막 커브 단백질의 효과 측정 하기 위해 존재 합?...

Endocytosis, 인신 매매, filopodia, 감염 등의 형성 등 많은 세포질 과정 세포 막1,2의 모양에 있는 극적인 변화를 함께 제공 됩니다. 셀에 다양 한 단백질 막에 바인딩 및 그들의 모양을 변경 하 여 이러한 프로세스에 참여 하 고. 가장 주목할 만한 보기는 본질적으로 도메인3,,45,,67바 곡선 특성을 포함 하는 빈/Amphiphysin/Rvs (바) 단백질 가족의 일원. 일반적으로, 그들은 표면에 그리고, 많은 경우에, 또한 얕게 삽입은 bilayer amphipathic 나선 바 도메인 준수는 막으로 작용. 모양, 크기, 및 amphipathic 나선 수와 함께 바 도메인의 결정: (1) 막 곡률의 방향 (즉, 여부 그들은 invaginations 또는 돌출을 유발 한다), 및 (2) 막의 크기 곡률의5,8. 노트, 여기 긍정적인 곡률 달리 곡선된 막, 즉, 상호 작용 입자, 그리고 부정적인 돌출의 볼록한 쪽으로 정의 됩니다. 또한, 단백질 바의 양적 연구는 막에 그들의 효과 물리적 매개 변수 집합에 따라 달라 집니다 공개: 표면 단백질, 막 긴장, 그리고 막 모양 (평면 대 관 대 구형의 밀도 모양)7. 단백질 바 이러한 매개 변수에 따라 수 있습니다: (1) 막 곡률의 센서 역할 (2) 구 부 막, 또는 (3) 유도 막 절단7.
막 셀에 재편 endocytosis, 같은 현상의 양적 측면을 공부에 관련 된 부품의 투명 한 수 비보에 매우 도전 이다. 최소한의 구성 요소를 셀에 곡선된 막을 흉내 낸의 생체 외에서 재구성 어떻게 막 커브 단백질의 작동 기계 이해를 얻기 위하여 수단을 제공 합니다. 이 문서는 막 나노튜브에서 생체 외에서 micromanipulation, confocal 현미경 검사 법, 광학 핀셋을 사용 하 여 다시 구성할 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 공부 하 고, 양적 방법, 단백질, 지질, 또는 작은 분자 곡선된 막 상호 작용 하는 방법을 사용할 수 있습니다. GUVs 지질 누구의 곡률 막 커브 상호 작용 분자의 크기에 비해 무시할 수은 세포 막의 모델로 사용 됩니다. 그들은 electroformation 방법9 는 소포 지질 영화를 수 화와 교류 전류 (AC)10에서 GUVs로 붓기 형성 된다를 사용 하 여 준비 된다. 가장 일반적인 기판 GUVs 재배 되는 인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 중 반 전도성 격판덮개 또는 백 금 철사 (Pt-전선)11. 이 작품에서는, GUVs는이 방법은 버퍼12소금의 면 전에 서 GUVs를 만드는 대안 보다 훨씬 더 잘 작동 하도록 표시 되었습니다로 Pt-전선에 재배 됩니다. Electroformation 프로토콜은 여기에 설명 된 그것을 재현 하는 충분 한 세부 사항에, 하지만 우리는 비슷한 다른 메서드와 GUVs를 만드는 세부 사항13,14에서 설명 되었습니다 이전 기사에 독자를 참조 하십시오. 우리 손에 Pt 전선에 electroformation는 성공적으로 나왔고 GUVs 또는 자연 지질 합성 지질의 혼합에서 ~ 100 m m NaCl을 포함 하는 버퍼에 추출 물. 또한, 성장 하는 동안 GUVs 내부 단백질을 캡슐화 가능 했다 또한. 예를 들어 electroformation 챔버는 그림 1A;에 나와 그것은 2 ~ 10 cm 긴 Pt-와이어 홀더 유리 coverslips와 양쪽에 밀봉 될 수 있다 소계 (PTFE)에서 만든 삽입 구성 ~ 1-2 c m 간격 (그림 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> 그림 1: 실험적인 체제. Pt-와이어에 연결 된 전기 커넥터 (A) 우두머리 electroformation 챔버. (B) 왼쪽: 현미경을 보여주는 실험 시스템, 목표 및 2 개의 micropipettes (왼쪽 및 오른쪽) 위 실험 챔버는 micromanipulators에 연결 된 고 튜브 고 단백질에 대 한 실험 챔버에 삽입 사출입니다. 오른쪽: 실험 챔버의 근접 보기는 포부와 삽입 분사 micropipettes의 끝을 보여주는 목표 위에 탑재. (C) 주사기의 백 엔드에 micropipette 삽입 얇은 디스펜서 장비. 하단의 파란색 점선 개요는 micropipette micropipette 내부 디스펜서의 근접 보기입니다. 이 시스템은 카 세 인 유리 표면 passivate 하 고 필요할 때 미네랄 오일 칠을 다시 하는 micropipette 채우기 위해 사용 됩니다. (D) A 시스템 µ L 양의 단백질 해결책을 발음 하는 데 사용 합니다. 바늘은 주사기와 주입 micropipette에 연결 된 튜브에 연결 되어 있습니다. Micropipette 팁 신중 하 게 단백질 해결책에 몰입 하 고 그렇게 발음 하는 micropipette 팁을 채우기 위해. micropipette 다음 다시 채워집니다 미네랄 오일 패널 C.에에서 표시 하는 시스템을 사용 하 여 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
막 나노튜브, 7에서 반경에 이르기까지 몇 백 nm nm는 우두머리에서 외부 힘으로 당길 수 있다. 이 방법은 처음 세포 막 및 소포, 휨 강성15,16등의 탄성 속성 측정 하도록 설계 되었습니다. 가장 최근 작품, 메서드 가져온된 나노튜브7,17근처 단백질 microinjecting 곡선된 멤브레인과 단백질의 상호 작용 연구를 확대 되었다. 다른 방법 막 커브 단백질 연구 개발 되었습니다. 한 방법에서는, 단백질 세 표면에 닿는 곳에 다르게 크기의 리와 알을 품는. Confocal 현미경 검사 법은 단백질 바인딩 곡률을 이용한 정렬18,19를 나타낼 수 있는 liposome 직경의 함수로 측정 하는 데 사용 됩니다. 다른 방법에서는, 단백질 tubules20,21을 자발적으로 유도 하는 능력을 측정 하기 위해 마이크로 발음 하는 우두머리 근처 주입 됩니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 막 커브 단백질 endocytosis에 관련 된 공부에 특히 적합 한은 대부분 단백질이 일반적으로 미리 형성한 막 나노튜브와 함께 화물 포함 된 막 invagination 연결을 발생 합니다 평면 플라즈마 멤브레인 기본 또한,이 방법에서는, 달리 곁된 작은 리와 분석 결과에 막 나노튜브는 지속적으로에 연결 막; 따라서, 그것은 한 상황으로 예상 vivo에서우두머리와 기계적 평형 에입니다. 따라서, 근본적인 막 물리학 적용 하 고 우리가 우리의 측정22,,2324에서 기계적 특성의 과다를 추정할 수 있다.
이 방법의 전체 구현에 대 한 필요한 장비는 confocal 현미경, 광학 핀셋, 그리고 하나 또는 두 개의 micropipettes 물 탱크 (그림 1B)에 연결을 포함 합니다. 모든 3 개를 결합해 서, 동시에 막 긴장, 막 곡률, 단백질의 표면 밀도 측정 하 고 힘25를 튜브에 가능 하다. Micropipette 포부 필수적 이며, 그것은 쉽게 액체 정역학 압력을 통해26포부 압력 제어 하는 물 탱크에 연결 홀더 유리 제 micropipette 삽입 하 여 구성 됩니다. micropipette 홀더는 제어는 micromanipulator 고, 이상적으로, 한 방향으로 정밀 운동 위한 압 전 액추에이터. 나노튜브를, microaspirated 우두머리는 짧게 미크론 크기의 구슬을 다음 멀리는 나노튜브를 만드는에 붙어 됩니다. 이 구현에는 구슬27게시 된 프로토콜 따라 생성 될 수 있다 광학 족집게에 의해 개최 됩니다. 그것이 비록 정확한 힘 측정 비용 다른 방법으로, 광학 족집게 및 풀 나노튜브의 분배 가능 합니다. 광학 트랩을 만들려고 너무 어려운 경우 또는 힘 측정은 중요 하지,와 같은 경우 단순히 곡선된 멤브레인에 대 한 단백질의 선호를 확인 하 고 싶어 하는 경우 튜브 발음 하는 두 번째 micropipette28의 끝에 비드를 사용 하 여 가져온 수 있습니다. 그것은 또한30,31흐름 또는 중력29 를 사용 하 여 튜브를 당겨 수 있습니다. 또한, confocal 현미경 검사 법 중요 하지 않습니다. 그러나, 그것은 단백질의 표면 밀도 측정 하기 위해 그렇게 선호. 그것은 또한 지질 막 힘 및 긴장은 별도로 따라서 튜브의 형광 강도에서 나노튜브 반경 측정 있습니다. 형광에서 추론 튜브 반경 이러한 수량 사이의 관계 막 준수 단백질25의 존재로 인해 잘 설립 방정식에서 일탈 하는 경우에 특히 중요 하다. 중요 한 것은, 하나로 튜브 곡률을 측정할 수 있을 것입니다 광학 트랩 confocal 현미경 검사 법의 분배 수 없습니다.
이 프로토콜에서 설명 된 대로 메서드 나노튜브는 바 가족25,,3233,34에서에서 주로 그들에 다양 한 주변 막 단백질의 곡률을 이용한 정렬 공부 하는 데 사용 되었습니다. . 그것은 또한 KvAP에 농축 conically 모양의 막 횡단 칼륨 채널 단백질35바 같은 방식으로 나노튜브 곡선을 표시 했다. GUVs 내부 단백질을 캡슐화 하는 메서드를 최적화 하 여 부정적인 곡률과 단백질의 상호 작용은 최근 조사 잘36로. 또한,이 메서드는 사용 단백질 건설 기계25,37 의 형성을 명료 하 고 중 선 긴장38단백질 dynamin39, 또는 바 막 절단의 메커니즘을 연구 하 단백질40,41. 뿐만 아니라 단백질, 작은 분자 또는 이온 곡률을 유도할 수 있다 또한. 이 메서드를 사용 하 여 칼슘 이온 소금 없는 조건42에서 긍정적인 곡률을 유도 하기 위해 표시 했다. 흥미롭게도, 그것은 또한 보였다 지질 demixing 포인트43,44근처는 작곡에만 있지만 정렬, 곡률을 받을 수 있습니다. 합계에서는, 연구원은 어떻게 중 정수 막 구성 요소 (예:, 지질 또는 막 횡단 단백질) 조사에 관심이 메서드를 사용할 수 있습니다 또는 주변 분자 바인딩 (중 내부 또는 외부 GUVs)와 상호 작용 기계 및 양적 관점에서 원통 곡선된 막 그것은 또한22,,2345막 자체의 기계적 성질 측정에 관심 있는 사람을 위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Example lipid used in data for Figure 3</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>biotinylated lipid</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>fluorescent lipid</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td></td><td>fluorescent lipid for protein density calibration</td></tr><tr><td>egg L-&amp;alpha;-phosphatidylcholine (eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>used for calibrating the tube radius constant</td></tr><tr><td>&amp;beta;-casein from bovine milk (&gt;99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>osmometer</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td><td>Goodfellow USA</td><td>PT005139</td><td>used for GUV electroformation</td></tr><tr><td>function generator</td><td></td><td>n/a</td><td>used to create current for GUV electroformation</td></tr><tr><td>putty sealant</td><td>Vitrex (from CML France)</td><td>CRIT 140013</td><td>used to seal the electroformation chamber</td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td></td><td>n/a</td><td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td></tr><tr><td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&amp;lambda; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&amp;lambda; &gt; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td><td></td><td></td><td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td></tr><tr><td>micromanipulators</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td><td>Harvard apparatus</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td>piezoelectric actuator</td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &amp;micro;m)</td><td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

세포 막의 재편 endocytosis, 인신 매매, 등 filopodia형성 등 많은 세포 현상의 중요 한 부분입니다. 많은 다른 단백질 그들의 능력을 감지 하거나 유도 막 곡률 때문에 곡선된 멤브레인과 연결 합니다. 일반적으로 이러한 프로세스는 다양 한 단백질 셀에서 양이 많게 공부 하기에 너무 복잡 하 포함 한다. 우리는 endocytic 목 같은 곡선된 세포 구조를 흉내 낸는 곡선된 막에 생체 외에서다시 구성할 프로토콜을 설명 합니다. 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리)는 그의 내부 압력 및 표면 장력 micropipette 포부와 함께 제어 되는 세포 막의 모델로 사용 됩니다. 광학 핀셋을 사용 하 여 우두머리에는 포인트 당기는 힘을 적용 평면 막에 연결 된 높은 곡률의 나노튜브를 만듭니다. 이 방법은 전통적으로 굽 힘 강성 등 지질 막의 기본적인 기계적 특성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 단백질 막 곡률 및 그들은 모양과 막의 역학에 영향을 미칠 방법으로 상호 작용 하는 방법을 공부 하 확장 되었습니다. Micromanipulation, microinjection, 광학 핀셋, confocal 현미경 검사 법을 결합 한 시스템 동시에 막 곡률, 막 긴장, 그리고 단백질의 표면 밀도의 측정을 허용 한다. 이 측정에서 단백질 막 시스템의 많은 중요 한 기계 및 형태학 속성 유추 수 있습니다. 또한, 우리 하다 생리 소금 농도 형광 강렬 레이블이 단백질과 지질에서에서 막에 단백질의 표면 밀도 측정 하는 방법의 GUVs를 만드는 프로토콜.

튜브를 당기 실험 멤브레인에 대 한 중요 한 기계적인 정보를 줄 수 있습니다. 단백질 또는 다른 분자를 막 곡률, 막와 커플 하 고 튜브 반경 막 긴장 Canham Helfrich 해밀턴을 적용 하 여 관련 될 수 없을 경우에는 튜브를 방정식 우두머리50,51에서 가져온 
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Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K 조회수.  PSL Research University, CNRS UMR168. 셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

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Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

연구

생화학

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to investigate the lipid raft hypothesis. Numerous studies, however, neglect the impact of physiological solution conditions. On that account, the current work presents the effect of high-salinity buffer and trans-membrane solution asymmetry on liquid-liquid phase separation in charged GUVs grown from dioleylphosphatidylglycerol, egg sphingomyelin, and cholesterol. The effects were studied under isothermal and varying temperature conditions.
We describe equipment and experimental strategies applicable for monitoring the stability of coexisting liquid domains in charged vesicles under symmetric and asymmetric high-salinity solution conditions. This includes an approach to prepare charged multicomponent GUVs in high-salinity buffer at high temperatures. The protocol entails the option to perform a partial exchange of the external solution by a simple dilution step while minimizing the vesicle dilution. An alternative approach is presented utilizing a microfluidic device that allows for a complete external solution exchange. The solution effects on phase separation were also studied under varying temperatures. To this end, we present the basic design and utility of an in-house built temperature control chamber. Furthermore, we reflect on the assessment of the GUV phase state, pitfalls associated with it and how to circumvent them.

Experiments on phase separated giant unilamellar vesicles (GUVs) frequently neglect physiological solution conditions. This work presents approaches to study the effect of high-salinity buffer on liquid-liquid phase separation in charged multicomponent GUVs as a function of trans-membrane solution asymmetry and temperature.

형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

화학

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

생체공학

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular recognition within biosensors for diagnosis, functional membranes for artificial cells, and development of bioinspired micro/nano-reactors. In all of these applications, the characterization of their membrane properties is of fundamental importance. Among existing characterization techniques, micropipette aspiration, pioneered by E. Evans, allows the measurement of mechanical properties of the membrane such as area compressibility modulus, bending modulus and lysis stress and strain. Here, we present all the methodologies and detailed procedures to obtain giant vesicles from the thin film of a lipid or copolymer (or both), the manufacturing and surface treatment of micropipettes, and the aspiration procedure leading to the measurement of all the parameters previously mentioned.

The goal of the protocol is to reliably measure membrane mechanical properties of giant vesicles by micropipette aspiration.

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

생물학

Cell-Free Expression of Membrane Proteins in Giant Unilamellar Vesicles

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

저자 스포트라이트: Membrane Protein Reconstitution in Synthetic Cells

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.