Name: dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers
Uploaded: 2017-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
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DFG (1116/17-1) 및 "BuildMoNa" (GSC 185) 자연 과학의 라이프 찌 히 학교에 의해 자금을 인정 합니다. 이 작품은 프라운호퍼 유치 프로젝트 601 683 통해 지원 되었습니다. T. H. 유럽 사회 기금 (ESF-100077106)에서 자금을 인정 합니다.

1. n HTs의 준비 참고: 여기, n 다른 단일 DNA 가닥을 특정 크기의 나선 관의 형성에 관여의 수를 나타냅니다. N = 8, 8 개의 다른 단일 DNA 가닥 단위 링 메이크업.
<ol><li>구매 DNA 시퀀스 (HPLC 순도 등급 이상) 적당 한 DNA 합성에서 서비스 또는 높은-품질 합성 및 정화 (모범적인 시퀀스를 표 1에 주어진).</li>
	<li>정화 물에 따라 더 물의 resuspension resuspend 동결 건조 된 oligonucleotides 단계는 회사에서 해당 설명서에 주어진. 200 µ M의 최종 농도 얻을 수의 양을 조절.</li>
	배포자에 의해 주어진 값을 확인 하 긴 <li>단일 DNA의 농도 결정 (예: 260에 대 한 UV 분광학을 통해 nm) 이기 때문에 정확한 산출할 어셈블리 프로세스에 대 한 중요 한. 특정 어 금 니 무게 및 각 단일 가닥 DNA oligonucleotide에 대 한 소멸 계수 oligonucleotides의 농도 계산. 
	참고: 소멸 계수 값 본질적으로 다를 다른 시퀀스에 대 한 및 상업적으로 구입한 DNA의 설명서에서 진술 된다. 그들은 또한 가까운 이웃 모델 수 자유롭게 사용할 수 있는 온라인 도구를 사용 하 여 계산할 수 있습니다. 분석기의 선형 범위를 준수 농도 결정을 위해 사용 하는 샘플을 희석 하십시오.</li>
	<li>Micropipette를 사용 하 여 혼합 DNA 가닥-각 농도에서 동시에 원하는 n HTs를 thermocycler (예를 들어, 200 µ L PCR 튜브)에 대 한 적합 한 컨테이너 (최종 버퍼 조건: 1xTE (10 mM Tris 및 1 m m EDTA, pH 8) 및 12.5 m m MgCl 2). 
	참고: 최종 DNA n HT 샘플 구성 n-1 가닥, U 1 &#8722; U n &#8722; 1, 고 1 T n 가닥. 스트랜드 당 농도 사용자의 요구에 따라 하위-micromolar 이상 10 µ M에서 다를 수 있습니다 (예를 들어, &#60; 단일 필 라 멘 트를 관찰 하는 후속 희석에 대 한 가닥 또는 높은 농도의 시험에 대 한 당 1 µ m 조밀한 네트워크 역학).</li>
	<li>교배 n HTs thermocycler (65 ° c 이후 빠른 드롭과 90 ° C에서 10 분 변성, 느린 온도 65 ° C에서 30 분-0.5 K의 20 온도 단계에서 보완 기본 페어링으로 55 ° C 감소에 각; 그리고 한 빠른 방울 55 ° C에서 20 ° C); 그림 2A 참조. 
	참고: 65 ° C에서 느린 감소 단계 평균 튜브 길이; 증가를 길게 할 수 있습니다. 그러나, 20 ° C에 이후 빠른 드롭 생산 튜브의 집계를 피하기 위해 중요 하다.</li>
	<li>감지 저하 없이 4 ° C에서 최대 3 주 동안 교배 n HTs 저장. 
	참고: 형광에 대 한 현미경 검사 법, n HTs 표시 됩니다 때 교배 (부분적으로) 수정된 U1 Cy3 (표 1)와 u 1을 대체 하 여. 더 이상 관찰 시간, 설립된 안티 표백 에이전트의 추가 것이 좋습니다.</li>
	<li>신중 하 게 원하는 최종 농도에 샘플을 희석 (예를 들어, 4 네트워크 또는 20 µ M 단일 필 라 멘 트 관측에 대 한 nM) 필요한 경우 샘플 버퍼를 사용 하 여. 가능한 오류 소스를 최소화 하기 위해 원하는 최종 농도에서 샘플 조립.</li>
</ol> 2. 전단 유동 학 동적 전단 고분자에 대 한 <ol><li>선택 적절 한 형상 (-격판덮개 또는 콘 판). 콘 판 기하학을 사용 하는 작은 볼륨 (즉, 아래 200 µ L).</li>
	<li>동적 전단 고분자에 샘플 로드.</li>
	<li>잠재적인 증발 효과 방지 하기 위해 다음 단계를 사용 하 여 환경과 샘플의 공기-물 인터페이스 passivate.
	<ol><li>샘플 버퍼 목욕의 2.5 mL과 샘플을 둘러싸고.</li>
		<li>Micelle 농도 바로 아래 계면 활성 제를 추가.</li>
		<li>해밀턴 주사기를 사용 하 여 공기 샘플의 직접 접촉을 피하기 위해 지질으로 샘플을 둘러싸고.</li>
	</ol></li> <li>젖은 스폰지를 갖춘 모자와 함께 샘플 챔버를 봉인 하 고, 만약에 가능 하다 면, 추가 (샘플) 접촉 하지 추가 물 목욕과 증발을 억제.</li>
	<li>실내 온도에서 고분자 관련 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 시작, (해당 되는 경우 생리 조건 필요) 또는 37 ° C와 같은 서로 다른 온도에서 측정을 수행. 
	참고: 샘플을 냉각은 종종 함께 수증기의 응축 주변 공기에서 난방 리드 향상 된 증발 하는 동안 합니다. 두 효과 미친 듯이 샘플의 농도 시리즈에서 모든 측정은 일정 한 온도에서 수행 되어야 한다 변경할 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 2 h equilibrate을 샘플을 수 있습니다. 시간 진화 시간 청소와 모니터링할 수 있습니다 (데이터 분당 지점, 스트레인 γ = 5%; 주파수 f = 1 Hz).</li>
	<li>원하는 테스트 프로토콜 기계적 특성을 측정합니다. 주파수 스위프의 시리즈와 함께 시작 (f-스윕) 그들은 샘플 그대로 두고 더 많은 측정에 대 한 허용 하기 때문에. 
	참고: 또한, 짧은 f-더 이상 측정 전후 청소 밖으로 실행 되어야 한다 (긴 f 등-훨씬 더 높은 해상도와 스윕) 샘플 전체 측정 프로토콜에 걸쳐 변동 확인 하.
	<li>수행 짧은 <ol>f-스윕 (예를 들어, γ = 5%; f = 0.01 Hz 30 hz; 10 년 당 5 데이터 포인트).</li>
		<li>수행 긴 f-스윕 (예를 들어, γ = 5%; f = 0.001 Hz 30 hz; 21 데이터 요소 10 년 당); 측정 시간을 줄이기 위해 필요 하지 않은 경우 낮은 주파수 정권을 생략할 수 있습니다.</li>
		<li>짧은 f를 수행-스윕.</li>
		<li>Γ-스위프를 실행 (예: f = 1 Hz; γ = 0.0125% ~ 100%; 10 년 당 20 데이터 포인트). 
		참고: 사용 짧은 f-청소 처음, 그것은 일반적으로 이전 f 일치-스윕 네트워크는 일반적으로 γ-스윕 동안 파열 또는 격판덮개에서 분리 하기 때문에. 또는, γ-램프를 사용 하 여 (예: 0.025 s -1, t = = 60 s); 그러나, 경사로 일반적으로 변경할 필요가 모터 모드, 그래서 이후 짧은 f-스윕 위조한 것.</li>
	</ol></li> <li>빈 또는 부드럽게 가우시안 커널 원시 데이터.</li></ol>
 3. 형광 기반 분석의 DNA 어 닐 링 <ol><li>12의 준비 8 aliquots µ L 1-4 µ M를 사용 하 여 각 샘플에 대 한 DNA 가닥, TE 버퍼, x 12.5 m m 1에서 MgCl 2 및 1 핵 산 젤 x 10000 x DMSO에서 얼룩 주식입니다. 없는 DNA와 부정적인 제어 하지만 핵 산 젤 얼룩을 포함.</li>
	<li>실시간 PCR 플레이트에는 aliquots를 전송 하 고 접착 필름 (예를 들어, 96-잘 반응 플레이트)와 함께 인감. 
	참고: 프로토콜을 어 닐 링 열에 사용 된 높은 온도 샘플 증발 됩니다. 따라서, 우물은 특히 장기 실험 중 물 증발 및 농도 증가 방지 하기 위해 접착 필름으로 단단히 밀폐 된 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>가스 거품 제거를 실 온에서 1 분 x 100g에 격판덮개 원심; 가스 거품 확장, 우물 분석 될 수 없습니다.</li>
	<li>실시간 정량 PCR 시스템으로 밀폐 접시 로드.</li>
	<li>어 닐 링 프로그램을 실행합니다. 10 분 드롭 빨리 72 ° c.에 온도 90 ° C에서 DNA를 변성 다음, 0.5 ° C 마다 30 분으로 천천히 온도 감소. 후에 신호는 부식 가속 온도 램프. 
	참고: 72 ° C는 진짜 교 잡 온도; 위에 충분히 따라서, 신호는 광범위 한 온도 범위는 필요한 온도 범위를 결정 하기 위한 적합 한 기록.</li>
	<li>는 cycler 뚜껑 접착 필름에 증발된 샘플의 응축을 방지 하기 위해 100 ° c 이상가 열이 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>488에서 아르곤 이온 레이저 샘플 어셈블리, 동안 자극 nm 550에서 형광을 검출 하 고 nm 핵 산 젤 얼룩을 사용 하는 경우 (또는 괴기 하 게 비슷한). 다른 염료에 대 한 적절 한 여기/방출 조합을 선택 합니다. 전체 증가를 가능한 한 자주 형광 신호를 측정 내장 카메라를 사용 하 여 신호 품질. 
	참고: 여기, 측정 모든 9 찍은 s.</li>
	<li>미리 용 해 및 어 닐 링 프로그램 적용 하는 경우 데이터를 분석 하는 제공 된 소프트웨어를 사용 합니다. 그렇지 않으면, 형광 신호의 상대적인 변화를 각 온도 단계에 대 한 평균 값에서 이전 평균 값 빼기.</li>
</ol> 4. AFM 이미징 <ol><li>쪼개 운 모 (예: 운 모 &#34; V1 &#34;) 상용 접착 테이프를 부착 하 고 벗; 여는 운의 최고 층을 제거 해야 합니다.</li>
	<li>미리 형성 된 n HT Mg 2 + 갓 쪼개진된 운 모에 접는 버퍼를 포함 하 고 10 분에 대 한 정착 보증금 micropipette를 사용 하 여</li>
	<li>남은 액체를 제거 하는 작은 테이블 원심 분리기에 2000 x g 3-s 짧은 간격에서 샘플을 회전 합니다. 여러 n HTs 여전히 운 모 표면에 붙어 있어야 한다.</li>
	<li>외팔보 팁 높은 뻣 뻣 함 (예: 54 Nm -1) 사용 하 고 내부 AFM 소프트웨어와 함께 그것의 공명 주파수 결정.</li>
	<li>기록 모드 손상 또는 n HTs.를 전치 하지 않으려면 낮은 스캔 속도 (예를 들어, 1 선/s)에서 도청에서 공기에 afm 높이 프로 파일</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

제대로 구성 된 네트워크를, DNA 나노튜브 조립은 중요 한 단계 이다. 합성 과정에서 오류 저하 튜브 품질; 따라서, HPLC 또는 더 엄격한 프로세스는 oligonucleotides 정화를 사용할 것이 좋습니다. 집합에서 n 구성 oligonucleotides의 아데닌 산출할 집계 DNA 나노튜브, 뿐만 아니라 그들의 길이 분포 보다 이산의 형성에 의하여 달려 있다, 이후 그것은 농도 측정 하는 데 필요한 구입한 가닥의 이후 값 주...

그들의 독특한 기계적 성질으로 사용 복잡 한 동작으로 인해 semiflexible 폴리머는 생활 문제의 근본적인 빌딩 블록. 유연한 고분자, 달리 semiflexible 폴리머 여전히 강한 열 변동1에 따라 하면서 자신의 비 사라지는 백본 강성 때문 뻗은 구성 채택. 따라서, 순전히 확률적 모델은 완벽 하 게 유연 하거나 딱딱한 폴리머의 극치와 마찬가지로 그들의 행동에 적용할 수 없습니다. 소위 벌레 같은 체인 모델2,,34 p l통해이 강성 필 라 멘 트4따라 접선 탄젠트 상관 관계의 붕괴 상수는 척도를 개발 되었다. Lp 는 윤곽선 길이 (lc)는 필 라 멘 트의 비교, 폴리머 semiflexible1를 간주 됩니다. 텐트의 기둥에 유사한, 그들의 준비 네트워크 또는 번들 안정화 낮은 볼륨 분수, 특이 한 점 탄성 속성5,6,7, 선도에서 전체 집단 시스템 8,9. 이러한 구조는 높은 신축성 대형 메쉬 크기10, 아직도 퍼지는 촉진 및 활성 전송 프로세스 동안 기계적 무결성을 유지 제공 합니다. 이 속성은 특히 골격 또는 기질, 생물 학적 시스템에 적합 하지만 그것은 식품 공학1,,1112에서 또한 널리 이용 된다.
생활 문제에 그들의 의미를 넘어가 고, 포괄적으로 생체 모방 재료 또는 소설 hydrogels 개발 도구 순서 이러한 구조체의 물성을 검토 하 결정적 이다. Semiflexible 폴리머의 관점에서이 단일 필 라 멘 트 속성 lp 설명 이론적 프레임 워크의 개발 등에서 발생 하는 네트워크의 집단 속성의 체계적인 결정을 의미 합니다. 선구적인 연구에서 세포 biopolymer 말라 semiflexible 고분자를 위한 모델 시스템으로 설립 되었다와 금5,13,,1415 에 아직도 널리 것으로 간주 됩니다. , 16 , 그러나 17., 철저 한 연구는이 시스템 제한 때문에 그들은이 단백질의 고유한 속성에 바인딩됩니다. 다양 한 이론적 접근 건물 단일 필 라 멘 트 수준에서 특수 기계 동작의 설명 목적으로 그리고 특히 다른 배율 예측에 의존에 대 한 선형 탄성 고원 전단 탄성 계수, G의 지도 0 (즉, 네트워크의 "신축성"), 농도 (c) 및 lp6,7,,1314, 15,18,19,20,21,,2223. 농도 스케일링은 걸 기반으로 실험 또는 다른 모델 시스템에 쉽게 액세스할 수 있으며 이론적인 예측을 엄격 하 게 되었습니다 확인13,,1624, 25, 실험적으로 접근 하기 어려운 남아 있다 lp 에 관하여 스케일링. 그러나 Lp 은 semiflexible 고분자의 정의 수량은 독립 변수 이기도 때문이,, 주요 한계입니다.
이 중앙, 자연 제한 걸의 고정된 lp 또는 콜라겐 같은 다른 생물학으로 파생 된 중합체에 의해 부과 된 최근 타일 기반 DNA 튜브, 그들의 기계적 성질에 가변을 사용 하 여 해결 되었습니다. 9 , 26 , 27 , 28. (단위 링 내 가닥 구성 DNA의예를 들어, 서로 다른 숫자) 튜브의 아키텍처에 약간의 변화가 항복 lp, 형광 현미경 검사 법을 통해 평가 될 수 있는 고유 값 한 변동 튜브를 분석 하거나 여러 준수 튜브의 곡선된 구성을 평가 하 여,와 같이 설명한 이전9,28. 이러한 분석을 다른 튜브 인구의 lp 값 이상의 크기 순서에 따라 달라 지는 다른 평가 기술을 일관 된 결과9,28항복 공개 했다.
놀랍게도, 농도 및 lp 선형 탄성 고원 전단 계수 G0 의 전반적인 비율 보고 되었습니다 모든 이전 이론적 접근와 일치 하도록 9, 특히 훨씬 시연 시 lp예측된 의존 보다 강한. 이러한 연구 결과 semiflexible 폴리머의 중앙 속성을 공부 하는 새로운 모델 시스템의 가치를 강조 한다. N채용-헬릭스 DNA 튜브 극적으로 이러한 조사의 범위를 높 혔 습니다. 수 lp 기본 재료를 변경 하지 않고 자유롭게 변화 될 뿐만 아니라 DNA의 고유한 프로그래밍 가능한 특성 추가 요소, crosslinks 등 운동 스위칭 프로세스의 체계적인 검사를 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 튜브 물에 용 해 되며, 대부분의 단백질 달리 적절 한 pH와 이온 조건 감지 저하9없이 몇 주 동안 안정.
이러한 튜브 조립 DNA oligonucleotides의 개별 집합은 사용 되, 각각 포함 된 2 개의 이웃 물가를 보완 기본 시퀀스를 공유 하는 두 개의 도메인 (특정 시퀀스 때문에 한 가닥 형성할 수 없습니다 머리 핀 같은 구조). 상호 보완적인 시퀀스 교배 n 상호 더블 헬리컬 세그먼트의 동봉, 반 겹치는 반지를 형성, 순환 방식에서 (그림 1A 및 B). 개별 직경 (그림 1C), 및 그들의 반 중복 구성에서이 고리 형태로 축 끈끈한 끝 다른 링의 끈끈한 끝에 무료 제공합니다. 이 선택적 추가 oligonucleotides 일치의 크기 n (nHT)의 filamentous DNA 나선 관의 효과적인 중 합으로 이어지는 반지의 스태킹 트리거합니다. 그들의 윤곽선 길이 일반적으로 길이, 여러 미크론을 측정 하 고 그들의 길이 분포는 걸 필 라 멘 트9,26,,2728의 비교. 그것은 표시 되었습니다 유사한 DNA 나노튜브에 대 한 그들은 실제로 비슷한 걸 필 라 멘 트 및 microtubules의 중 합 속도 론을 전시<su></su>p class = "외부 참조" > 29. 기본 반지 구조를 구성 하는 개별 DNA 물가의 수 n , 따라 nHT 건축으로 그것의 원주와 직경, 수 수 controllably 다양 합니다. 반지/튜브의 둘레 증가 더 많은 DNA 가닥을 사용 하 고 해당 건축 변경 이동에 해당 하는 높은 강성 높은 lp 값 (그림 1C), 기계적 특성. 생체 규모 큰 lp 값이 높은 강성으로 인해 덜 구부러진된 conformations 변환 (그림 1D 및 E).

<table><tbody><tr><td>AFM cantilever ACTA</td><td>AppNano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM - NanoWizard 3</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon DV887</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotides</td><td>Biomers.net</td><td></td><td>For sequences see Table 1</td></tr><tr><td>DNA Cy3-labeled oligonucleotides</td><td>Biomers.net</td><td></td><td>For sequence see Table 1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-9884</td><td></td></tr><tr><td>Epi-fluorescence micro-scope</td><td>Leica</td><td>DM-IRB</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>Mica &quot;V1&quot;, 12 mm round</td><td>Plano GmbH</td><td>50-12</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&amp;reg; Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&amp;reg; Optical Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x objective</td><td>Leica5</td><td>506168</td><td></td></tr><tr><td>Purified water</td><td>Merk Millipore - Milli-Q &amp;amp; Elix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sapphire PCR tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>683271</td><td></td></tr><tr><td>TProfessional Standard PCR Thermocycler</td><td>Core Life Sciences Inc.</td><td>070- Standard</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Rheometer</td><td>TA Instruments</td><td>ARES</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&amp;reg; Green I nucleic acid gel stain</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4661</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>X-100</td><td>Suppresses evaporation of sample at air-water interface</td></tr></tbody></table>

dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers

셀 또는 biopolymer 네트워크 같은 복잡 한, 폴리머 기반 부드러운 물질의 기계적 성질도 클래식 프레임 유연한 폴리머도 엄밀한 막대의 이해할 수 있습니다. 기본 필 지 속성 길이 (lp)를 통해 계량 되는 그들의 비 사라지는 백본 강성으로 뻗은 남아 있지만 그들은 또한 강한 열 변동 될 수 있습니다. 그들의 한정 된 굽 힘 강성 대량 네트워크, 큰 메시 크기를 제공 하면서 낮은 볼륨 분수에서 안정적인 장비의 형성을 활성화의 독특한, 특수 집단 역학 이끌어 낸다. 이 기본 원리는 (예를 들어, 셀 또는 조직), 자연에 널리 높은 분자 콘텐츠 및 따라서 퍼지는 촉진 또는 능동 이동 최소화. 그들의 생물 학적 영향 및 생체 hydrogels 잠재적인 기술 응용 프로그램, semiflexible 폴리머 상당한 연구 대상이 되었습니다. 그러나 그들은 자유롭게 조정 되지 않은 걸 필 라 멘 트 같은 천연 고분자에 의존 하는 때문에,, 이해할 수 있는 조사 도전 남아 있었다. 이러한 제한에도 불구 하 고 합성, 기계적으로 가변 및 semiflexible 폴리머의 부족, 말라 필 라 멘 트 일반적인 모델 시스템으로 설립 되었다. 주요 제한은 중앙 수량 lp 자유롭게 거시적인 대량 구조에 미치는 영향을 연구 조정 될 수 없습니다입니다. 이 한계는 강성 필 라 멘 트의 제어 변경 수 있도록 구조적 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브를 채용 하 여 해결 되었습니다. 그들은 부분적으로 보완 가닥의 개별 세트 개별 둘레와 반지 구조에서 교배 타일 기반 디자인을 통해 형성 된다. 이 고리 사용 필 라 멘 트에 효과적인 중 합 길이, 여러 미크론 끈끈한 끝 있으며 자연 biopolymers로 비슷한 중 합 속도 론을 표시 합니다. 그들의 프로그래밍 가능한 역학 때문이 튜브는 단일 분자 대량 규모에 lp 의 영향을 공부 다재 다능 한, 소설 도구입니다. 말라 필 라 멘 트, 달리 그들은 주 동안에, 주목할 만한 변성 없이 안정적으로 유지 하 고 그들의 처리는 comparably 간단.

온도 경사로 (그림 2)를 통해 DNA 나노튜브의 어셈블리 이러한 인공 semiflexible 폴리머를 형성 하는 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이러한 고분자 걸 필 라 멘 트, 등 그들의 자연적 사건 대응에 유사한 특성을가지고 있지만 훨씬 광범위 한 실험 프레임 워크를 그들의 기계적 특성은 controllably 될 수 있으므로 변경9,<sup class="xr...

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DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K 조회수.  Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology. Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

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Scalable Nanohelices for Predictive Studies and Enhanced 3D Visualization

Spring-like materials are ubiquitous in nature and of interest in nanotechnology for energy harvesting, hydrogen storage, and biological sensing applications.&#160; For predictive simulations, it has become increasingly important to be able to model the structure of nanohelices accurately.&#160; To study the effect of local structure on the properties of these complex geometries one must develop realistic models.&#160; To date, software packages are rather limited in creating atomistic helical models.&#160; This work focuses on producing atomistic models of silica glass (SiO2) nanoribbons and nanosprings for molecular dynamics (MD) simulations. Using an MD model of &#8220;bulk&#8221; silica glass, two computational procedures to precisely create the shape of nanoribbons and nanosprings are presented.&#160; The first method employs the AWK programming language and open-source software to effectively carve various shapes of silica nanoribbons from the initial bulk model, using desired dimensions and parametric equations to define a helix.&#160; With this method, accurate atomistic silica nanoribbons can be generated for a range of pitch values and dimensions.&#160; The second method involves a more robust code which allows flexibility in modeling nanohelical structures.&#160; This approach utilizes a C++ code particularly written to implement pre-screening methods as well as the mathematical equations for a helix, resulting in greater precision and efficiency when creating nanospring models.&#160; Using these codes, well-defined and scalable nanoribbons and nanosprings suited for atomistic simulations can be effectively created.&#160; An added value in both open-source codes is that they can be adapted to reproduce different helical structures, independent of material.&#160; In addition, a MATLAB graphical user interface (GUI) is used to enhance learning through visualization and interaction for a general user with the atomistic helical structures.&#160; One application of these methods is the recent study of nanohelices via MD simulations for mechanical energy harvesting purposes.

Accurate modeling of nanohelical structures is important for predictive simulation studies leading to novel nanotechnology applications.&#160; Currently, software packages and codes are limited in creating atomistic helical models.&#160; We present two procedures designed to create atomistic nanohelical models for simulations, and a graphical interface to enhance research through visualization.

예측 연구 확장 Nanohelices 향상된 3D 시각화

Spring-like materials are ubiquitous in nature and of interest in nanotechnology for energy harvesting, hydrogen storage, and biological sensing ...

연구

공학

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

화학

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous solution. In a carbon nanotube/PEO105-PPO70-PEO105 (poloxamer 407) aqueous solution, the amphiphilic poloxamer 407 adsorbs onto the carbon nanotube surfaces and self-assembles into continuous layers, driven by intermolecular interactions between constituent molecules. The addition of 5-methylsalicylic acid changes the self-assembled structure from spherical-micellar to a cylindrical morphology. The fabricated poloxamer 407/carbon nanotube hybrid particles exhibit thermo-responsive structural features so that the density and thickness of poloxamer 407 layers are also reversibly controllable by varying temperature. The detailed structural properties of the poloxamer 407/carbon nanotube particles in suspension can be characterized by small-angle neutron scattering experiments and model fit analyses. The distinct curve shapes of the scattering intensities depending on temperature control or addition of aromatic additives are well described by a modified core-shell cylinder model consisting of a carbon nanotube core cylinder, a hydrophobic shell, and a hydrated polymer layer. This method can provide a simple but efficient way for the fabrication and in-situ characterization of carbon nanotube-based nano particles with a structure-tunable encapsulation.

A method for the functionalization of carbon nanotubes with structure-tunable polymeric encapsulation layers and structural characterization using small-angle neutron scattering is presented.

작은 각도 중성자 산란에 의한 열 가역적 블록 공중 합체 및 특성 단일 벽 탄소 나노 튜브의 기능화

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

생체공학

Grafting Multiwalled Carbon Nanotubes with Polystyrene to Enable Self-Assembly and Anisotropic Patchiness

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a free-radical polymerization strategy to enable the modulation of the nanotube surface properties and produce supramolecular self-assembly of the nanostructures. First, a selective hydroxylation of the pristine nanotubes through a biphasic catalytically mediated oxidation reaction creates superficially distributed reactive sites at the sidewalls. The latter reactive sites are subsequently modified with methacrylic moieties using a silylated methacrylic precursor to create polymerizable sites. Those polymerizable groups can address further polymerization of styrene to produce a hybrid nanomaterial containing PS chains grafted to the nanotube sidewalls. The polymer-graft content, amount of silylated methacrylic moieties introduced and hydroxylation modification of the nanotubes are identified and quantified by Thermogravimetric Analysis (TGA). The presence of reactive functional groups hydroxyl and silylated methacrylate are confirmed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Polystyrene-grafted carbon nanotube solutions in tetrahydrofuran (THF) provide wall-to-wall collinearly self-assembled nanotubes when cast samples are analyzed by transmission electron microscopy (TEM). Those self-assemblies are not obtained when suitable blanks are similarly cast from analogous solutions containing non-grafted counterparts. Therefore, this method enables the modification of the nanotube anisotropic patchiness at the sidewalls which results into spontaneous auto-organization at the nanoscale.

A procedure for the synthesis of polystyrene-grafted multiwalled carbon nanotubes using successive chemical modification steps to selectively introduce the polymer chains to the sidewalls and their self-assembly via anisotropic patchiness is presented.

자기 집합에 있도록 폴리스 티 렌과 이방성 Patchiness Multiwalled 탄소 나노튜브를 접목

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

생화학

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

감마 변형 펩타이드 핵산의 자가 조립을 유기 용매 혼합물의 복잡한 나노 구조로

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups may be utilized to study material-biomarker interactions i.e. act as biosensors with potential as single molecule detectors. We have developed an effective approach for preparing functional polymers where the functionality has the capacity of specifically binding with a model protein. In our model system, the functional group is 2,4-dinitrophenyl (DNP) and the protein is anti-DNP IgE (Immunoglobulin E). The functional polymer, &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenyl caproic][poly(ethylene oxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), is prepared by anionic living polymerization. The difunctional initiator utilized in the polymerization was prepared by electron transfer reaction of &alpha;-methylstyrene and potassium (mirror) metal. The 2-methoxystyrene monomer was added first to the initiator, followed by the addition of the second monomer, ethylene oxide, and finally the living polymer was terminated by methanol. The &alpha;,&omega;-dihydroxyl polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] was reacted with N-2,4-DNP-&isin;-amino caproic acid, by DCC coupling, resulting in the formation of &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenylcaproic][poly(ethyleneoxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). The polymers were characterized by FT-IR, 1H NMR and Gel Permeation Chromatography (GPC). The molecular weight distributions of the polymers were narrow (1.1-1.2) and polymers with molecular weights greater than 50,000 was used in this study. The polymers were yellow powders and soluble in tetrahydrofuran. A water soluble CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (dimethoxyethylene glycol) complex binds and achieves steady state binding with solution IgE within a few seconds. Higher molecular weight (water insoluble i.e. around 50,000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymers, containing 1% single wall carbon nanotubes (SWCNT) were processed into electroactive nanofibers (100 nm to 500 nm in diameter) on silicon substrate. Fluorescence spectroscopy shows that anti-DNP IgE interacts with the nanofibers by binding with the DNP functional groups decorating the fibers. These observations suggest that appropriately functionalized nanofibers hold promise for developing biomarker detection device.

An efficient approach for preparing nanofibers decorated with functional groups capable of specifically interacting with proteins is described. The approach first requires the preparation of a polymer functionalized with the appropriate functional group. The functional polymer is fabricated into nanofibers by electrospinning. The effectiveness of the binding of the nanofibers with a protein is studied by confocal microscopy.

Biofunctional Nanofibers를 제조 절차

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...