우리는 phaESC 라인의 파생 에 대한 줄리오 디 미닌 박사와 유동 세포 측정 작업에 대한 박사 레모 프레이만 감사합니다. 우리는 또한 미켈 레 샤프너 씨와 토마스 M. 헤네크 씨가 배아 전이와 기술 지원을 인정합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (보조금 31003A_152814/1)에 의해 지원되었다.

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체세포 핵 전달(SCNT)에 의한 포유류 복제는1990년대,20,21년에개척되었다. 이러한 발전은 30년 전에 양서류22에서실시한 복제 연구를 따랐다. 상당한 지연은 포유류에서 배아학 및 게놈 각인의 어려움을 반영합니다. 포유류 SCNT의 발달은 이 프로토콜에 상세히 기술된 정액을 대체하기 위한 haESC의 적용을 위한 기초입니다.
세포 주기 동기화는 SCNT23의성공을 위한 중요한 요소입니다. 이것은 또한이 프로토콜에서 haESC의 주입에 대 한 경우. 기증자 게놈을 수령인으로 도입하려면 배아 발달을 중단하는 염색체 파손 또는 골수 계수를 피하기 위해 세포 주기 단계가 일치하도록 요구합니다. 반 클로닝은 두 개의 게놈과 세포 세포가 호환되어야 한다는 추가복잡성을 가지고 있습니다. 이전 보고서는 M-phase 체포 및 rorogenetic haESC의 주입이 난모세포7에G1 상 haESCs의 주입 보다는 반 복제된 태아의 더 나은 발달 비율을 산출했다는 것을 보여주었습니다. 이 보고서는 M-phase를 반 복제에 적합한 동기화 지점으로 제안합니다. 이에 따라, phaESC는 미토티컬디드 디메콜신과 메타단계에서 체포되어 MII 난우세포의 난소에 주입되었으며, 이는 메이오증의 메타페이오 II에서 자연적으로 체포되었다. 중요한 것은, M-위상 체포는 기증자와 수령인 세포 주기 사이 우수한 동기화를 제공하는 고효율마우스 ESC에서 달성될 수 있습니다.
미토시스 동안 핵막이 분해되고 복제된 염색체가 부착되는 스핀들 형태가 형성됩니다. M-phase DKO-phaESC를 주입한 후, 자매 크로마티드는 의사 극체와 zygote7(그림 3E)으로분리된다. 따라서 DKO-phaESC의 단일 염색체 세트는 반 복제 된 배아에 기여합니다. DKO-phaESC 염색체의 자매 크로마티드는 주사 후에 정확하게 분리될 수 있다는 것이 중요합니다. 손상되지 않은 DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인은 의사 극성 체체로의 분리를 방지합니다. 우리는 실제로 DKO-phaESC의 혈장 막이 파열되지 않은 드문 경우를 관찰했고, 배아는 주입 후 ooplasm에서 그대로 DKO-phaESC를 나타냈다(도 3D). 따라서, 파이프팅에 의해 DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인을 제거하기 위해주의를 기울여야한다. 주입 하는 동안, 염색체의 메이 오 틱 스핀들의 중단을 방지 하 고 염색체 분리 결함으로 이어질 수 있는 동등 하 게 중요 한 결과 뿐만 아니라 aneuploidy를 유도.
포유류에서, 게놈 각인은 정액 보충으로 phaESCs의 적용을 제한합니다. Parthenogenetic haESCs는 유전체 각인의 모계 구성을 소유, 정자는 아버지 구성을 소유 하는 반면. 따라서, 전체 기간 새끼의 생성은 정자 대체로 야생 형 phaESC의 주입 후 발생하지 않았습니다. 이러한 제한을 극복하기 위해 IG및 H19-DMC의삭제는 phaESC에서 설계됩니다. 모계 Igf2-H19 및 Gtl2-Dlk1 loci에서 각인된 발현의 변형은 전송된 2세포 배아에 기초하여 5.1% 이상의 주파수를 가진 반 복제된 마우스의 생성을 허용하기 위한 게놈 각인물의 구성을 바꾸기에 충분하다. 이러한 관찰은 2개의 각인된 유전자를 표적으로 하는 것이 마우스에 있는 정액을 대체할 수 있는 기능적인 아버지 구성으로 phaESCs의 게놈을 전환한다는 것을 건의합니다. 그럼에도 불구 하 고, phaESCs의 영구적인 유전 수정이 전략에 대 한 필요. 대체 전략으로, 및 유전 적 haESC를 고려할 수 있습니다. Androgenetic haESCs는 정자 게놈에서 파생되고 친자 각인을 가지고 있습니다. 야생형 및 유전적 haESC가 정자 대체품으로 기여하여 전이 배아4,7,24의1.3%와 1.9%의 주파수에서 전체 기간새끼를생성하는 데기여했다는보고가 있었습니다. 전체 기간 새끼는 또한 IG의삭제와 함께 및 rorogenetic haESC를 주입하여 얻어졌습니다 - 및 H19-DMRs의주파수에서 20.2% 전송된 2 세포 배아24. 각인이 배양에서 불안정해질 수 있기 때문에 변형된 안드로유전학 적 haESC를 사용하여 반 복제의 효율성이 증가할 가능성이 높습니다. 각인 결함은 중요한 DMR의 유전 적 삭제에 의해 수정됩니다.
난소 또는 정자 게놈에 직접 유전자 변형을 도입하는 어려움을 고려, haESCs는 별도로 부모 게놈을 조작하기위한 가치있는 도구입니다. 정자의 대체로 haESCs를 사용하는 것은 마우스 생식선에서 게놈 편집을위한 놀라운 이점을 제공합니다. 최근 연구는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 배아 발달에 중요한 각각기 영역의 특성화를 위한 haESC의 적용과결합했다(12). 이 연구는 Bi임산부 마우스의 발달에서 H19-및IG-DMR과 병용으로 Rasgrf1-DMR의역할을 분석하고, 양성쥐의 발달에 있어 7가지 DMRs의 기능을 분석하였다. 정자에 대한 haESC를 대체하는 방법은 원시 세균 세포 발달에서 DND1 단백질 내의 주요 아미노산을 식별하고 뼈발달24,25,26에서유전자를 식별하기 위한 유전자 스크리닝 접근법의 기초를 형성하였다. 배아 발달의 주요 요인을 확인하기 위한 게놈 각인 및 유전 검열에 대한 연구는 게임 게놈으로 haESCs의 적용을 위한 상당한 접근입니다.

포유류에서, gametes는 차세대로 유전 정보를 전송하는 유일한 세포입니다. 오키트와 정자의 융합은 성인 동물로 발전하는 디플로이드 zygote를 형성합니다. 게임성 게놈의 돌연변이는 자식에 의해 상속되고 종1의유전적 변이를 유도한다. 생식선에 돌연변이의 도입은 유전자 기능 및 질병 모델링의 특성화를 포함하여 다양한 생물학적 연구를 위해 유전자 변형 동물을 생산하기 위해 적용되었습니다. 난모세포와 정자 는 모두 말기 분화 하 고 증식을 중단 한 고도로 전문화 된 세포. 따라서 게임테를 직접 수정하는 것은 기술적으로 어렵고 전문적인 접근 방식이 개발되었습니다. 유전자 변형은 유전자 변형 된 ESC를 발아 세포로 주입하여 마우스 세균에 도입 될 수 있으며, 여기서 개발 배아에 통합되어 생식선을 식민지화할 수 있습니다. 또한 CRISPR/Cas9 시스템을 포함한 게놈 편집 접근법을 이용한 zygotes의 유전자 변형이 널리 채택되고있다 2.
최근에는 게임게놈3,4,5,6,7,8을대체할 수 있는 haESC를 적용하는 뛰어난접근법이보고되었다. HaESCs는 파르테노유전학 또는 및 rorogenetic haploid blastocysts의 내부 세포 질량에서 파생된 줄기 세포주이며 염색체4,7,9,10의단일 세트를 소유한다. 파르테노유전학과 안드로유전학 적 haESCs 모두 난모세포로 내트라토플라스믹 주입 후 반 복제 된 마우스의 게놈에 기여할 수 있음을 입증되었습니다. 다른 접근법과는 달리, haESCs의 게놈은 자기 갱신 능력 때문에 배양에서 직접 수정될 수 있습니다. 정자를 haESCs로 대체하여 생식선에 유전자 변형을 도입하는 것은 생물학적 연구를위한 중요한 방법입니다. 그것은 개별적으로 문화를 제공하고 각각 parthenogenetic 또는 androgenetic haESCs에서 파생되는 모계 또는 친자 게놈을 조작할 가능성을 제공합니다. HaESCs는 그 때 유전체 각인, 진상성 표현 및 부모 특정 프로세스의 연구 결과에 특히 유리한 게임 게놈 대체로 이용될 수 있습니다.
마우스에서는 정상적인 배아발달(11)에모계 및 친자 게놈 정보가 모두 요구된다. 따라서, 전체 기간 새끼는 야생형 파르테노유전학 적 haESC(phaESC)가 정자 게놈5,8을대체하기 위해 주입되었을 때 얻을 수 없었다. 발달 블록을 극복하기 위해, 파르테노유전학 적 haESCs의 모계 게놈의 게놈 각인은 아버지 구성으로 교정될 필요가 있다. 이는 차별화된 메틸화된 영역(DM)을 조작하여 달성할 수 있다. 현재까지 H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR및 Rasgrf1-DMR의표적 삭제는 phaESC3,5,8,12에서모성 발현 유전자를 억압하기 위해 연구되었다. 이러한 연구는 H19-DMR과 IG-DMR모두의 삭제가 정자 염색체를 대체할 수 있는 친자 각인 구성으로 모계를 변환하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 두 DMR 삭제를 난피세포로 운반하는 phaESC의 내트라피토프라진 주사는 전송된 2세포 배아의 5.1%와 15.5% 사이의 주파수를 가진 반 복제 새끼를 산출하였다.
이 프로토콜은 H19-DMR과 IG-DMR모두의 삭제와 phaESC의 응용 프로그램을 기반으로하며, 이는 이중 녹아웃 phaESC (DKO-phaESC)를 용어. 우리는 DKO-phaESC 라인을 확립하기 위해 phaESC에서 게놈 각인의 수정에 대한 자세한 지침을 제공합니다, 정자 게놈의 대용으로 난동구에 DKO-phaESC의 주입, 배반 복제 배아의 배양에 대한, 및 반 복제 된 마우스를 얻기위한. 이 프로토콜은 친자 게놈의 정확하고 직접적인 조작을 필요로 하는 연구원을 위한 참고및 반 복제된 태아 및 마우스의 생성입니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

성적 번식을 가진 유기체에서, 생식 세포는 새로운 개별으로 발전하는 강성 성 세포의 근원입니다. 마우스에서는 정자에 의한 난미세포의 수정은 완도성 zygote를 만듭니다. 최근, 몇몇 간행물은 haploid 배아 줄기 세포 (haESCs)가 게임 게놈을 대체하고 마우스로 발전하는 태아에 기여할 수 있다는 것을 보고했습니다. 여기서, 우리는 난모세포로 내트라토플라스믹 주입에 의해 배아를 구성하는 정액의 대용품으로 parthenogenetic haESCs를 적용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 정자 대체로 haESCs를 준비하고, 하ESC 염색체를 난모세포로 주입하고, 반 복제 된 배아의 문화를위한 단계로 구성됩니다. 배아는 배아 전달 후에 비옥한 반 복제 마우스를 산출할 수 있습니다. 정자 교체로 haESC를 사용하면 생식선에서 게놈 편집, 배아 발달 연구 및 게놈 각인에 대한 조사가 용이합니다.

이 프로토콜의 목적은 반 복제 배아와 마우스를 얻기 위해 정자의 대체로 haESCs를 적용하는 것입니다. 이를 위해, CAG-EGFP 트랜스진을 운반하는 DKO-phaESC 라인이 생성되어 MII 난모세포로 의 내트라토플라스믹 주입에 사용되었다. 친자 각인 구성으로 적합한 phaESC 라인을 얻기 위해 Cas9 뉴클레아제를 사용하여 유전 공학을 수행했습니다. haploid ESC 라인은 디플로이드 에대한 고유의 경향으로 인해 발생하는 haploid 및 디플로이드 세포를 함유하고있다 10. haploid 염색체 세트는 정액 게놈의 성공적인 교체를 위한 전제 조건입니다. 혈류 세포측정에 의한 DNA 함량 분석은 G0/G1-, S-및 G2/M-phases(그림2A)에서haploid 및 디플로이드 세포의 분포를 나타낸다.
DKO-phaESC 라인을 확립하기 위해 야생형 phaESC 라인은 안정적인 형질 전환 EGFP 발현을 위해 돼지박 트랜스포슨 구조와 H19및 IG-DMR의 삭제를 얻기 위한 CRISPR/Cas9 플라스미드로 전염되었습니다. DIPLOID ESC를 제외하고 EGFP를 표현하는 haploid ESC만 격리하기 위해 특정 정렬 게이트가 정의되었습니다(그림2A). 단일 haploid EGFP 양성 세포는 그 때 서브 클론을 얻기 위하여 96 웰 플레이트의 개별 우물로 도금되었다. MEF 피더는 트랜스페드 phaESC의 도금 효율 및 생존을 증가시키기 위해 사용되었다. 배양의 확장 후, PCR에 의해 초기 지노티핑 라운드가 수행되어 두 DMR의 삭제를 수행하는 하위 클론을 식별했습니다. MEF 피더가 배양에서 제거된 후, H19에서야생형 송계의 부재를 확인하기 위해 두 번째 유전자를 수행하였다- 및 IG-DMR(도2B). 총 135개의 서브 클론에서, 우리는 삭제된 송계를 운반하고 H19-DMR과IG-DMR 둘 다의 야생형 송계유전자가 없는 5haploid DKO-phESC 라인을 획득했습니다.
CAG-EGFP 트랜스진은현미경(그림 3A)에따라 녹색 형광의 시각화에 의한 반 복제 배아에 대한 기여를 연구하기 위해 DKO-phaESC에 도입되었다. 인트라토플라스혈 주사를 위해 DKO-phaESCs는 M-단계에서 그들을 체포하기 위해 데메콜신으로 치료되었습니다. 따라서, DKO-phaESC의 세포 주기는 MII 난모세포의 세포와 동기화되었다. 유동 세포측정 분석은 디메콜신(도3B)으로치료한 후 G2/M 상 체포 된 haploid (2n) 및 디플로이드 세포 (4n)에 해당하는 2명의 인구를 나타냈다. 1n haploid 피크의 부재는 세포 주기 체포가 크게 완료되었다는 것을 표시했습니다. M-위상 haploid ESC는 그 때 분류되고 난모세포로 주입되었습니다. 이를 위해, 단일 DKO-phaESC는 마이크로주입 파이펫에 적재되어 MII oocyte(그림3C)의세포질에 주입되었다. DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인은 미세 주입 파이펫의 끝으로 피펫을 주입하여 파열되었다.
주사 후, EGFP 발현은 DKO-phaESCs의 세포질이 난낭의 큰 세포질에 분산되었기 때문에 생성된 반 복제 배아에서 거의 검출되지않았다(도 3D). 드문 경우, 강렬한 EGFP 발현의 둥근 반점이 옴플라스내에서 관찰될 수 있다. 이 관찰은 손상되지 않은 DKO-phaESC의 부주의한 주입에 의해 발생했을 가능성이 있습니다. DKO-phaESC 세포막을 파열하지 않는 것은 추가 배아 발달과 호환되지 않을 가능성이 있으며 피해야한다. 주사 후 1시간 후, 배아는 염화염산염18로 치료에 의해 활성화되었다. 활성화개시 후 6시간 후,현미경(도 3E)하에서최대 3개의 극성 체체가 관찰되었다. 이러한 극지 체는 DKO-phaESC7으로부터난마세포 및 의사 극체의 제1 및 제2 극성 체에 해당한다. 또한, 2개의 프로핵은 정자와 정상 수정 후 zygotes의 프로핵 단계를 닮은 차동 간섭 대조 현미경의 밑에 관찰되었다.
발달 능력을 입증하기 위해 반 복제 된 배아는 배아 단계(그림 5A)로배양되었습니다. 더욱이, 전기 마우스는 반복제된 2세포 단계 배아를 받는 여성의 oviducts(도5B)로이송한 후 수득하였다. 예상대로, 반 복제 된 배아에서 파생 된 마우스는 난모세포나 난모세포 유래 phaESC가 Y 염색체를 운반하지 않는 여성이었다. 반 복제 된 마우스는 매우 정상이었고 야생 형 스위스 웹스터 남성과 짝을 이면 건강한 자손을 생산했습니다. 지금까지, 반 복제 된 마우스는 명백한 건강 문제없이 600 일 이상 살아있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> 그림 1: 정자 대체로 DKO-phaESC의 적용에 대한 개요. (A)프로토콜의 절차의 시간 프레임. (B)이 계획은 DKO-phaESC 선(1~6단계)을 설정하는 단계를 보여줍니다. (C)이 계획은 MiI oocyte(단계 7-14)로 DKO-phaESC의 내트라피토프라증 주입에 의해 반 복제 배아를 구성하는 단계를 보여줍니다. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; FACS = 형광 활성화 셀 분류; MEF = 마우스 배아 섬유아세포. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> 그림 2: CrispR/Cas9 매개 삭제 - 및 IG-DMRs에 의해 DKO-phaESC 라인의 설립. (A)안정적인 EGFP 발현을 위한 피기박 플라스미드와 4개의 CRISPR/Cas9 플라스미드를 통해 피기박 플라스미드로 트랜스포메이션한 후 phaESC의 유동 세포측정 분석. 비트랜스감염 된 phaESC는 대조군으로 표시됩니다. DNA 프로파일(상단)은 haploid 및 diploid 세포의 세포 주기 분포를 나타낸다. EGFP를 발현하는 G1/S상 haploid 세포는 녹색 게이트(아래쪽, 오른쪽)에 의해 표시됩니다. (B)MEFs(제1 기형)에서 재배된 phaESC 서브 클론의 지노티핑과 MEFs(제2 기형)의 제거 후. 서브 복제 된 phaESC 라인 1, 2, 3 및 4는 야생 형 세포, H19-DMR 삭제, IG-DMR 삭제 및 결합 된 H19- 및 IG-DMR삭제를 각각 나타냅니다. DKO-phaESC 라인 5-8H19-DMR및 IG-DMR삭제를 모두 소유 하 고 야생 형 알 것에서 무료입니다. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; DMR = 차별화된 메틸화 영역; MEF = 마우스 배아 섬유아세포; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; WT = 야생형. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> 그림 3: Mitotically 체포 된 DKO-phaESC를 MII 난미세포로 주입합니다. (a) H19-및 IG-DMR의 CAG-EGFP 유전자 및 삭제를 전달하는 DKO-phaESC 배양의 형태; 스케일 바 = 50 μm.(B)디메콜신 처리 없이 데메콜신으로 체포된 후 DKO-phaESC의 대표적인 유동 세포 분석이 대조군으로 나타났다. (C)미세 주입 파이펫에서 DKO-phaESC의 형태. 파이펫팅에 의해 플라즈마 멤브레인을 파열하기 전(왼쪽) 및 후(오른쪽) 단일 손상형 DKO-phaESC가 도시되어 있다. 스케일 바 = 20 μm.(D)MII 난모세포에 DKO-phaESC를 주입 한 후 1 h에서 배아를 구성. EGFP 형광 및 밝은 필드의 병합 된 이미지가 표시됩니다. 검은 색 화살촉은 피할 수 있어야 하는 손상되지 않은 DKO-phaESC를 주입한 후 강렬한 EGFP 발현의 둥근 반점을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm.(E)스트론튬 염화물로 활성화가 개시된 후 6h 반 복제 배아의 차동 간섭 대비 이미지가 나타났다. 백색 화살촉은 주입된 DKO-phaESC에서 1개의 의사 극성 바디를 포함하여 3개의 극성 바디를 가진 배아를 표시합니다; 스케일 바 = 50 μm. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> 그림 4: DKO-phaESCs를 난마세포로 주입하기 위한 설치 방식. (A)사출 피펫, 홀딩 파이펫 및 사출 챔버내 의 난미가 나타난다. α, 미세 주입 파이펫의 각도를 구부립니다. (B)내트라토플라스솜 주사를 위한 미세 조작 접시에 방울의 레이아웃. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> 그림 5: 반 복제 된 배아의 개발. (A)시험관내 반 복제 배아의 사전 이식 개발. EGFP 발현은 처음에 4세포 배아에서 관찰된다 2 일째 에 트라이토플라스믹 주사 후. 4일째에, 강렬한 EGFP 발현은 배반구체에서 관찰될 수 있다; 스케일 바 = 100 μm.(b)2세포 배아 전달 후 얻어진 반 복제 마우스가 받는 사람에게 전달된다. 74 dpp에서, 반 복제 마우스 (화살표 머리)는 야생 형 스위스 웹스터 남성과 짝짓기 후 자연 출생에 의해 그녀의 첫 번째 새끼 (별표)를 전달했다. 이 그림에 나타난 반 복제 배아 및 반 복제 된 마우스는 Aizawa 외3에서보고된 것과 동일합니다. 약어: EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; .dpp, 일 산후. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">젤라틴 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>젤라틴</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid 배아 줄기 세포 (HaESC) 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>LIF</td>
			<td>1 x 106 IU/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1,000 IU/mL</td>
		</tr><tr><td>페니실린-연쇄절제술</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC 유지 보수 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>HaESC 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES 솔루션</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">세척 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA 분획</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7.1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-메르카포에탄올</td>
			<td>14.3 몰/L</td>
			<td>3.9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>페니실린-연쇄절제술</td>
			<td>100x</td>
			<td>5.6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">리시스 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>8.25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>트리스-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100mM</td>
		</tr><tr><td>EDTA</td>
			<td>0.5M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS 솔루션</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>나Cl</td>
			<td>5M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>프로틴아제 K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">활성화 매체</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>염화 스트론튬</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>M2 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PVP</td>
			<td>-</td>
			<td>0.6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>hCG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">히알루로니다제 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>M2 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>히알루로니다제</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">약어: LIF = 백혈병 억제 인자; MEF = 마우스 배아 섬유아세포;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = 태아 소 혈청; DMEM = 덜벡코의 수정된 독수리 매체; BSA = 소 세럼 알부민;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = 에틸렌디아민테트라아세산; SDS = 도데킬술페이트 나트륨; EGTA = 에틸렌 비스 (옥시에틸렌니틸로)테트라아세트산;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = 인산염 완충식식염; PVP = 폴리 비닐피롤리돈; hCG = 인간 융기 생식선 호르몬;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = 임신 한 마레 혈청 생식샘 호르몬.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 중간, 버퍼 및 솔루션 레시피입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td colspan="2">시퀀스(5' ~ 3')</td>
			<td>신청</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT 개그 TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG 아가 ACC ACT GCT 개그</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG 개그 CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT 태그 AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 올리고뉴클레오티드 목록.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K 조회수.  ETH Zurich. 이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

비디오: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

연구

유전학

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

발생학

<meta charset="utf8"></head><body>배아 발달을 연구하기 위한 Murine Round Spermatid Injection Procedure

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>마우스 라운드 Spermatid 주입

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

마우스 라운드 Spermatid 주입

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

<meta charset="utf8"></head><body>포도당 대사에 대한 장기적인 영향을 연구하기 위한 ICSI-ET 마우스 모델

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 세포질 내 정자 주입이 자손에 미치는 장기적인 건강 영향 탐구

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

Single-Cell Sequencing을 위한 Gastrulating Mouse embryo의 분리 및 유전형 분석

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분해능에서 계통 특이적 돌연변이 배아를 분석하기 위한 파이프라인

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

요약

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유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

마우스 라운드 Spermatid 주입

마우스 라운드 Spermatid 주입

마우스 라운드 Spermatid 주입

세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링

세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링

세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지