이 작품은 영 조사 프로그램 (NRF-2015R1C1A1A02036464), 공학 연구 센터 프로그램 (NRF-2015R1A5A1037668) 및 글로벌 프론티어 프로그램 (CAMM-2014M3A6B3063708)에 의해 재정적으로 지원, M.K., S.S., I.K. 인정 글로벌 박사 과학기술부, 정보 통신 및 미래 계획 (MSIP) 한국 정부에 의해 자금 한국 국립 연구 재단 (NRF) 부여를 통해 장학 (NRF-2017H1A2A1043204, NRF-2017H1A2A1043322, NRF-2016H1A2A1906519).

1. 기판 준비 <ol><li>얻기 매우 정제 된 석 영 웨이퍼. 보고는 제조에 대 한 여기, 500 µ m 두께 웨이퍼를 사용.</li>
	<li>스핀 코트 2000 rpm 및 빵 60에 대 한 긍정적인 감광 제와 석 영 웨이퍼 s 90 ° c. 
	참고: 긍정적인 감광 레이어 후속 가공 단계에서 손상을 방지 하기 위해 코팅입니다.</li>
	<li>Dicing 기계를 사용 하 여 크기가 작은 조각 20 x 20 m m 2으로 포토 레지스트와 웨이퍼 절단.</li>
	<li>가공 단계에서 발생 하는 미 립 자 제거 압축된 질소 총을 사용 하 여 불어.</li>
	<li>드 이온된 (DI) 수 45에서 5 분 동안에 초음파 목욕에 배치 ° C. 제거 45에서 5 분 동안 아세톤에는 초음파 목욕을 사용 하 여 감광 레이어 ° C. 청소 2 개의 초음파 목욕, 아세톤과 이소프로필 알코올, 각각에서 5 분을 사용 하 여 기판 45 ° c.</li>
	<li>압축된 질소 총 기판 건조.</li>
</ol> 2. 마스크 패턴을 에칭 <ol><li>부하는 깨끗 한 석 영 기판에 높은 진공 전자 빔 증발 시스템. 기판 회전을 사용할 수 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>예금 2의 증 착 속도와 크롬 레이어 Å/s의 
	참고: 레이어 적어도 100 nm 두께 에칭 마스크 증 착에서 만든 핀 홀 방지를 위해 입금 해야 합니다.</li>
	<li>버튼을 눌러 환기를 챔버 환기 및 집중 된 이온 빔 (FIB) 소유자 구리 테이프 실시를 사용 하 여 샘플을 탑재.</li>
	<li>거짓말 챔버로 거짓말 홀더 로드.</li>
	<li>챔버 문 닫고 철수 챔버를 펌프 단추를 누릅니다.</li>
	<li>선택 &#34;에 빔 &#34; 빔 제어 탭 및 설정에서 이온 빔 전류 (7.7 pA) 및 가속 전압 (30 kV) 거짓말 모드.</li>
	<li>이온 빔 시스템을 켭니다.</li>
	<li>선택 &#34;에 빔 &#34; 전자 빔에 설정 하 고 소프트웨어를 사용 하 여 낮은 확대와 함께 이미지를 초점 빔 제어 탭.</li>
	<li>4mm 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 모드에서 탐색 탭 작동 거리 (WD) 설정.</li>
	<li>52 ° 소유자의 기울기 각도 설정 하 고 구멍 배열 마스크 패턴 제작 전에 다른 확대 SEM 이미지를.</li>
	<li>패턴 탭을 모방 하는 지역을 선택 하 고 50 nm 구멍 배열 크롬 레이어에. 
	참고: 간단한 패턴 도구 패턴 탭에서 액세스할 수 있습니다. 더 복잡 한 형상 및 노출 컨트롤 비트맵을 가져오거나 생성 하는 스크립트에 의해 달성 될 수 있다.</li>
	<li>마친 후, 전자 빔, 이온 빔 시스템을 해제 하 고 시스템을 진정.</li>
	<li>환기 버튼 누르고 질소 가스 챔버를 환기. 챔버는 홀더를 꺼내.</li>
	<li>챔버 문 닫고 펌프 버튼을 눌러 챔버 철수.</li>
</ol> 3. 습식 에칭 프로세스 및 제거 마스크 레이어의 <ol><li>넣어 1시 10분으로 패턴화 된 기판 버퍼링 5 분에 대 한 산화 현상 
	참고: 석 영 선택적으로 그리고 isotropically 습식 에칭은 현상에 의해 이며 둥근 모양을 형성 합니다. 렌즈의 모양 에칭 마스크 얻어질 수 있다 그리고 직경은 정확 하 게 에칭 시간에 의해 제어 됩니다. 더 둥근 모양 작은 패턴 직경으로 형성 될 수 있습니다. 1.5 µ m 직경 반구는 5 분 안에 얻어질 수 있다</li>
	<li>버퍼링 된 산화 현상 (5 분, 두 번)을 청소 디 물에 넣어 패턴화 된 기판. 
	참고: 버퍼링 된 산화 현상 위험할 수 있습니다,이 현상을 사용 하 여 때 조심 해야.</li>
	<li>건조 압축된 질소 가스 샘플.</li>
	<li>크롬 마스크 레이어를 제거 하는 CR-7 크롬 현상으로 패턴화 된 기판 넣어. 
	참고: 크롬 층을 제거한 후 구형 패턴화 된 기판 1.5 µ m 직경에서 얻어질 수 있다.</li>
	<li>패턴화 된 기판 (5 분) 청소 디 물에 넣어.</li>
</ol> 4. 멀티 레이어 증 착 및 나노 크기의 개체 비문 참고: 레이어의 쌍 구형 석 영 기판에 입금 됩니다. 여기, Ag와 티 오 2 착 자료로 사용 됩니다. Ag와 티 오 2는 15의 두께 또는 입금 nm.
<ol><li>전자 빔 증발 시스템의 환기 버튼 누르고 환기 이상 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>환기 후 높은 진공 전자 빔 증발 시스템으로 패턴화 된 기판 로드.</li>
	<li>챔버 문 닫고 펌프 버튼을 누르면 10 -7 Torr의 진공도를 챔버 철수. 
	참고: 진공 상태에서 10 -7 Torr 표면 거칠기에서 산란을 줄이기 위해 보관 해야 합니다.</li>
	<li>Ag 레이어 1의 성장 율을 가진 예금 Å / s 및 보증금 15 nm 두꺼운 Ag 레이어.</li>
	<li>5 분에 대 한 기판 진정 Ag 층의 증 착 후</li>
	<li>다른 도가니를 선택 하 여 전자 빔 증발 시스템의 주머니를 변경 하 고 예금 성장률 1 Å/s의 예금의 티 오 2 레이어 15 nm 두꺼운 티 오 2 층. 
	참고: 증 착 하는 동안 영화 성장 율은 유지 표면 거칠기 균일성을 유지 하기 위해 낮은.</li>
	<li>티 오 2 층의 증 착 후 5 분에 대 한 기판 진정</li>
	<li>반복 단계 4.4 4.7 Ag와 티 오 2의 다층 입금 하는 사이클의 수만. 
	참고:이 시점에서, hyperlens 제조가 끝났습니다. 다음 단계는 hyperlens 이미징 능력을 테스트 하기 위한 임의의 하위 diffraction 제한 기능을 만들기 위한 것입니다. 나노미터 크기의 금속 및 슬릿 새겨 거짓말 밀링 여.</li>
	<li>전자 빔 증발 시스템의 주머니를 변경 하 고 50의 두께에 크롬 레이어를 입금 nm.</li>
	<li>Cr 층의 증 착 후 전자 빔 증발 시스템 해제. 환기 버튼을 누르고 질소 가스를 도입 하 여 챔버 환기.</li>
	<li>는 환기 후 챔버 문 열고 챔버 마운트 홀더를 꺼내. 조작된 hyperlens 장치 스트립.</li>
	<li>챔버 문 닫고 펌프 버튼을 눌러 챔버 철수.</li>
	<li>밀링 시스템 거짓말에 크롬 입금 hyperlens를 탑재 하 고 패턴 제조 업체 당 나노 크기의 구조, &#39; s 지침.</li>
</ol> 5. 설정을 이미징 시스템 및 이미징 절차 광학 테이블에 <ol><li>장소는 기존의 전송 형 광학 현미경. 
	참고: 여기, 거꾸로 광학 현미경 본체로 사용 되었다.</li>
	<li>어댑터를 사용 하 여 현미경 조명 경로에 백색 광원을 연결.</li>
	<li>장소 가운데 410에 광 대역 통과 필터 nm. 
	참고: 대역 통과 필터; 빛의 특정 파장을 선택적으로 침투 여기, 410 nm 빛 샘플에 조명입니다. Ag와 티 오 2의 구성 된 hyperlens 410 nm 파장에서 고성능을 있다. 시뮬레이션 결과 ( 그림 2c) 410 nm 빛에서 하이퍼볼릭 분산 관계식을 만족 하는 hyperlens의 성능을 보여준다.</li>
	<li>는 고배율 기름 침수 렌즈를 선택합니다. 높은-품질 CCD 카메라는 이미지를 사용 하 여. 
	참고:이 광학 설정을 그냥 둔다 금지를dpass 410 nm 파장의 빛 밖으로 정렬 하려면 빛 조명 경로에 필터. 빛의 특정 파장 백색 광을 사용 하지 않고 샘플에 조명 될 수 있지만 일반 실험실, 광학 현미경 밝은 필드 또는 형광 이미징 통해 샘플의 관찰에 대 한 화이트 라이트 소스 있을 수 있습니다.</li>
	<li>대물 렌즈에 침수 오일 한 방울을 놓습니다. 샘플 단계 및 캡처 이미지에는 hyperlens 배치. 
	참고: 내접된 나노 크기의 개체는 hyperlens의 내부 표면에 410 nm 빛으로 조명 될 수 있습니다. Hyperlens와 나노 크기의 개체 확대 및 대물 렌즈에 의해 체포 되며 CCD 카메라에 의해 촬영.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitr&#228;ge+zur+Theorie+des+Mikroskops+und+der+mikroskopischen+Wahrnehmung.">Beitr&#228;ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.</a> Archiv f&#252;r mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).</li><li>D&#252;rig, U., Pohl, D. W., Rohner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field+optical-scanning+microscopy.">Near-field optical-scanning microscopy.</a> J Appl Phys. 59 (10), 3318-3327 (1986).</li><li>Pendry, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Refraction+Makes+a+Perfect+Lens.">Negative Refraction Makes a Perfect Lens.</a> Phys Rev Lett. 85 (18), 3966-3969 (2000).</li><li>Fang, N., Liu, Z., Yen, T. -. J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+evanescent+waves+from+a+silver+superlens.">Regenerating evanescent waves from a silver superlens.</a> Opt Express. 11 (7), 682-687 (2003).</li><li>Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-Diffraction-Limited+Optical+Imaging+with+a+Silver+Superlens.">Sub-Diffraction-Limited Optical Imaging with a Silver Superlens.</a> Science. 308 (5721), 534-537 (2005).</li><li>Melville, D. O. S., Blaikie, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+through+a+planar+silver+layer.">Super-resolution imaging through a planar silver layer.</a> Opt Express. 13 (6), 2127-2134 (2005).</li><li>Taubner, T., Korobkin, D., Urzhumov, Y., Shvets, G., Hillenbrand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-Field+Microscopy+Through+a+SiC+Superlens.">Near-Field Microscopy Through a SiC Superlens.</a> Science. 313 (5793), 1595-1595 (2006).</li><li>Jacob, Z., Alekseyev, L. V., Narimanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Hyperlens:+Far-field+imaging+beyond+the+diffraction+limit.">Optical Hyperlens: Far-field imaging beyond the diffraction limit.</a> Opt Express. 14 (18), 8247-8256 (2006).</li><li>Lee, H., Liu, Z., Xiong, Y., Sun, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+optical+hyperlens+for+imaging+below+the+diffraction+limit.">Development of optical hyperlens for imaging below the diffraction limit.</a> Opt Express. 15 (24), 15886-15891 (2007).</li><li>Liu, Z., Lee, H., Xiong, Y., Sun, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Hyperlens+Magnifying+Sub-Diffraction-Limited+Objects.">Far-Field Optical Hyperlens Magnifying Sub-Diffraction-Limited Objects.</a> Science. 315 (5819), 1686-1686 (2007).</li><li>Kim, M., Rho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metamaterials+and+imaging.">Metamaterials and imaging.</a> Nano Converg. 2 (1), 22 (2015).</li><li>Byun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+nanoimprinted+hyperlens+array+for+high-throughput+sub-diffraction+imaging.">Demonstration of nanoimprinted hyperlens array for high-throughput sub-diffraction imaging.</a> Sci Rep. 7, 46314 (2017).</li><li>Shekhar, P., Atkinson, J., Jacob, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbolic+metamaterials:+fundamentals+and+applications.">Hyperbolic metamaterials: fundamentals and applications.</a> Nano Converg. 1 (1), 14 (2014).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction+demagnification+imaging+lithography+by+hyperlens+with+plasmonic+reflector+layer.">Sub-diffraction demagnification imaging lithography by hyperlens with plasmonic reflector layer.</a> RSC Advances. 6 (98), 95973-95978 (2016).</li><li>Sun, J., Xu, T., Litchinitser, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+demonstration+of+demagnifying+hyperlens.">Experimental demonstration of demagnifying hyperlens.</a> Nano Lett. 16 (12), 7905-7909 (2016).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sub-wavelength+nanofocusing+of+UV-visible+light+by+hyperbolic+metamaterials.">Deep sub-wavelength nanofocusing of UV-visible light by hyperbolic metamaterials.</a> Sci Rep. 6, 38645 (2016).</li><li>Rho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+hyperlens+for+two-dimensional+sub-diffractional+imaging+at+visible+frequencies.">Spherical hyperlens for two-dimensional sub-diffractional imaging at visible frequencies.</a> Nat Commun. 1, 143 (2010).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-thin+ultra-smooth+and+low-loss+silver+films+on+a+germanium+wetting+layer.">Ultra-thin ultra-smooth and low-loss silver films on a germanium wetting layer.</a> Opt Express. 18 (5), 5124-5134 (2010).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

세 가지 주요 단계를 포함 하는 hyperlens의 제조: 금속과 유 전체 다층 전자 빔 증발 시스템을 사용 하 여 및 새 스태킹 습식 에칭 과정을 통해 석 영 기판으로 반구형 형상을 정의 Cr 레이어에 개체입니다. 가장 중요 한 단계가입니다, 두 번째는 hyperlens의 품질에 크게 영향을 미칠 수 있기 때문. 박막 증 착 과정에서 분명 슈퍼 해결된 이미지에 대 한 특별 한 주의 필요로 하는 두 조건이 있습니다. 중?...

살아있는 세포에 생체를 관찰 하고자 하는 현미경 검사 법의 발명품에 지도 하 고 현미경의 출현 지난 몇 세기 동안 다양 한 분야, 생물학, 병리학, 그리고 재료 과학, 혁명 전파. 그러나, 더 발전 연구의 제한에 대해 기존의 현미경의 해상도 회절에 의해 제한 되었습니다는 파장1의 절반. 따라서, 회절 한계를 극복 하기 위해 이미징 슈퍼 해상도 최근 수십 년간에서 흥미로운 연구 영역을 되었습니다.
회절 제한 됩니다 개체에 하위 파장 정보를 포함 하는 사라져 파도의 손실에으로, 멀리 퇴색에서 사라져 파도 유지 하거나 그들을 복구2,3초기 연구 실시 되었습니다. 회절 한계를 극복 하기 위한 근처-필드 전에 방탕된2개체에 가까운 근접에서 사라져 필드 수집 광학 현미경 검사와 함께 처음으로 알려졌다. 그러나, 전체 이미지 영역을 스캔 하 고 그것을 재구성 시간이 오래 걸립니다, 그것은 실시간 영상에 적용할 수 없습니다. "superlens," 사라져 파도 증폭을 기반으로 다른 접근을 제공 하지만 실시간 이미징의 가능성, 서브 파장 근처-필드 지역에서 수만 영상과 개체4, 보다 훨씬 도달할 수 없는 5 , 6 , 7.
최근에 hyperlens 실시간 멀리 필드 광학 이미징8,9,10,,1112에 대 한 새로운 접근으로 떠오르고 있다. 높은 이방성 하이퍼볼릭 분모가13이루어집니다, hyperlens 같은 위상 속도와 높은 공간 정보 지원 되도록 평면 하이퍼볼릭 분산을 전시 한다. 또한, 운동량 보존 법칙 때문 높은 가로 wavevector 점차 압축 파도 원통형 형상을 통해 간다. 따라서이 확대 정보 멀리 필드 지역에서 기존의 현미경에 의해 감지할 수 있습니다. 이건 실시간 멀리 필드 이미징, 특정 중요성의 모든 포인트 스캔 또는 이미지 재건을 필요로 하지 않습니다. 또한, 이미징, 나노리를 포함 하 여 다른 응용 프로그램에서 hyperlens는 사용할 수 있습니다. 반대 방향에서 hyperlens를 통과 하는 빛 시간 역 분개 대칭14,,1516인 하위 회절 영역에 초점을 맞춘 것입니다.
여기, 우리는 확대 표시 주파수에서 2 차원 정보를 구형 hyperlens에 보고 합니다. 기존 원통형 형상을 달리 구형 hyperlens 이미징 실용화 촉진 두 옆 차원에서 개체를 확대 합니다. 제조 방법 및 이미징 설치는 hyperlens와 함께 높은 품질 hyperlens의 재생산에 대 한 세부 사항에 선물 된다. 하위 파장 개체의 슈퍼 해결 능력 증명을 위해 hyperlens에 새겨져 있다. 그것은 hyperlens에 의해 새겨진된 개체의 작은 기능 확대는 확인 된다. 따라서, 명확 하 게 해결된 이미지 실시간으로 멀리 필드 지역에서 얻을 수 있습니다. 이 신형 구형 hyperlens, 전통적인 현미경 검사 법, 통합의 용이성과 생물학, 병리학, 그리고 일반 nanoscience에서 새로운 시대의 새벽에 이르는 실용적인 이미징 응용 프로그램의 가능성을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Focused Ion Beam milling machine</td><td>FEI</td><td>Helios Nanolab G3 CX</td><td></td></tr><tr><td>E-beam evaporation system</td><td>Korea Vacuum Tech</td><td>KVE-E4000</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscopy</td><td>Hitachi</td><td>SU6600</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscopy</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Light source</td><td>EXCELITAS Technologies</td><td>X-Cite 110 LED</td><td></td></tr><tr><td>Band pass filter</td><td>Chroma</td><td>ET405/30M</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Zeiss</td><td>Plan-Apochromat</td><td>NA=1.3, 100X</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td></td></tr><tr><td>Quartz wafer</td><td>CORNING</td><td>Fused Silica Corning 7980</td><td></td></tr><tr><td>Buffered oxide etchant</td><td>J.T Baker TM</td><td>J.T.Baker 5175</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>AZ electronic materials</td><td>GXR-601 PR</td><td></td></tr><tr><td>Chromium etchant</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>J.T Baker TM</td><td>UN1090</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>J.T Baker TM</td><td>UN1219</td><td></td></tr><tr><td>FEM simulation tool</td><td>COMSOL 5.1 Multiphysics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demonstration of a hyperlens-integrated microscope and super-resolution imaging

기존의 현미경의 회절 한계를 극복 하기 위해 이미징 슈퍼 해상도 사용 하 여 생물학과 나노기술 연구자의 관심을 모으고 있다. 근처-필드 스캐닝 현미경 검사 법 및 superlenses 근처-필드 지역에서 해상도 향상, 실시간으로 멀리 필드 이미징 중요 한도 전에 남아 있다. 최근, 확대 하 고 사라져 파도 파도 전파 변환, hyperlens, 멀리 필드 이미징에 대 한 새로운 접근으로 떠오르고 있다. 여기, 우리는 구형 hyperlens 실버 (Ag) 그리고 티타늄 산화물 (티 오2) 얇은 레이어 구성의 제작 보고. 기존 원통형 hyperlens와는 달리 구형 hyperlens 2 차원 확대 수 있습니다. 따라서, 전통적인 현미경 검사 법으로 간단 합니다. 실시간으로 멀리 필드 지역에서 얻을 수 하위 파장 이미지에 대 한 수는 hyperlens와 통합 하는 새로운 광학 시스템은 제안 된다. 이 연구에서는 제조와 이미징 설치 방법을 자세히 설명 합니다. 이 작품 또한 접근성 및 hyperlens의 가능성 뿐만 아니라 살아있는 세포, 생물학과 나노기술 혁명으로 이어질 수 있는 실시간 이미징의 실용적인 응용 프로그램을 설명 합니다.

하위 회절 기능 해결 hyperlens 장치 수와 높은-품질 제조의 균일성에 의존 합니다. 여기는 hyperlens Ag와 티 오2 교대로 입금의 다층 구성 됩니다. 그림 2a 는 잘 만들어진된 hyperlens17의 SEM 이미지를 보여 줍니다. 횡단면 이미지 Ag와 Ti3O5 박막의 다층 반구형 석 영 기판에 균일 한 두께와 입금 됩니다 보여 줍니다. ?...

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Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

hyperlens 사용 하 여 실시간 영상 및 기존의 광학의 간단한 구현에 그것의 장점으로 인해 새로운 슈퍼 해상도 이미징 기술로 간주 되었다. 여기, 우리 제조 설명 및 이미징 구형 hyperlens의 응용 프로그램 프로토콜을 제시.

Hyperlens 통합 현미경 및 슈퍼 해상도 영상

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

demonstration-hyperlens-integrated-microscope-super-resolution

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Engineering

7.7K 조회수.  Pohang University of Science and Technology (POSTECH). hyperlens 사용 하 여 실시간 영상 및 기존의 광학의 간단한 구현에 그것의 장점으로 인해 새로운 슈퍼 해상도 이미징 기술로 간주 되었다. 여기, 우리 제조 설명 및 이미징 구형 hyperlens의 응용 프로그램 프로토콜을 제시.

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Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

칩에 Lensless 형광 현미경

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

연구

생체공학

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

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Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

면역학 및 감염병학

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

발생학

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, however, the lateral resolution of super-resolution imaging is only ~100 nm. The low resolution is mainly due to the high autofluorescence background of photosynthetic cells caused by high-intensity lasers that are required for super-resolution imaging, such as stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, we describe a photobleaching-assisted STORM method which was developed recently for imaging the marine picocyanobacterium Prochlorococcus. After photobleaching, the autofluorescence of Prochlorococcus is effectively reduced so that STORM can be performed with a lateral resolution of ~10 nm. Using this method, we acquire the in vivo three-dimensional (3-D) organization of the FtsZ protein and characterize four different FtsZ ring morphologies during the cell cycle of Prochlorococcus. The method we describe here might be adopted for the super-resolution imaging of other photosynthetic organisms.

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Here we describe a photobleaching method to reduce the autofluorescence of cyanobacteria. After photobleaching, stochastic optical reconstruction microscopy is used to obtain three-dimensional super-resolution images of the cyanobacterial FtsZ ring.

Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

생물학

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures the interaction of homologous chromosomes is the assembly of the synaptonemal complex (SC) in meiotic prophase I. Even though there is little sequence homology between protein components within the SC among different species, the general structure of the SC has been highly conserved during evolution. In electron micrographs, the SC appears as a tripartite, ladder-like structure composed of lateral elements or axes, transverse filaments, and a central element. 
However, precisely identifying the localization of individual components within the complex by electron microscopy to determine the molecular structure of the SC remains challenging. By contrast, fluorescence microscopy allows for the identification of individual protein components within the complex. However, since the SC is only ~100 nm wide, its substructure cannot be resolved by diffraction-limited conventional fluorescence microscopy. Thus, determining the molecular architecture of the SC requires super-resolution light microscopy techniques such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated-emission depletion (STED) microscopy, or single-molecule localization microscopy (SMLM). 
To maintain the structure and interactions of individual components within the SC, it is important to observe the complex in an environment that is close to its native environment in the germ cells. Therefore, we demonstrate an immunohistochemistry and imaging protocol that enables the study of the substructure of the SC in intact, extruded Caenorhabditis elegans germline tissue with SMLM and STED microscopy. Directly fixing the tissue to the coverslip reduces the movement of the samples during imaging and minimizes aberrations in the sample to achieve the high resolution necessary to visualize the substructure of the SC in its biological context.