우리는 박사 발-민-Thein-Oo, 박사 한-Thiri-Zin, 부인 H. Tsurutani 그들의 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 프로젝트는 젊은 과학자 (홍콩 및와에 스), 과학 연구 B (D.M.), 과학 연구 C (D.M.), 그리고 과학적인 연구에 혁신적인 지역 (D.M.), 교육, 문화, 스포츠, 과학에서 대 한 보조금에 의해 지원 되었다 고 일본의 기술입니다.

모든 동물 주택 외 과적 동물 실험의 야마구치 대학의과 대학에 대 한 지침에 따라 했다와 기관 동물 관리 및 사용 시 위원회에 의해 승인 되었다 대학.
 1. 동물 <ol><li>4에 5-주-오래 된 남성 Sprague-Dawley 쥐 (나이의 출생 후 28 ~ 31 일)를 사용 하 여.</li>
	<li>12 h 명암 주기에서 일정 한 온도 (23 ° C ± 1 ° C)에서 유지 개별 플라스틱 케이지 (40 ㎝ × 25 ㎝ × 25 ㎝)에 쥐를 집. 게 쥐 광고 libitum 액세스 물과 음식.</li>
</ol> 2. 로 터 로드 테스트 <ol>모터 기술 학습, 회전자 막대 시험에 각 쥐 주제 조사 <li>(막대 직경 7 cm, 차선 폭 8.9 cm;가 높이 26.7 cm) 1 개 또는 2 일 연속 ( 그림 1A 2016 국방 외에 7). 조용 하 고, 온도 제어 룸 (23 ± 1 ° C)에서 작업을 수행 합니다. 방해 하지 않거나 처리는 테스트 전에 쥐</li>
	<li>4 회전/분 5 분에 40 회전/min (8 π/분 80 π/min)에서 선형으로 증가 하는 가속 모드로 회전자 막대 설정</li>
	<li>휴식 회전 막대에 쥐를 넣어. 막대에 모든 사지 되는지 확인.</li>
	<li>모터 성능을 평가 하기 위해 회전 막대에서가을 대기 시간을 측정.</li>
	<li>허용 각 쥐 30의 간격으로 10 시도 (재판).</li>
	<li>쥐 회전 막대에서 떨어지면, 설정 막대에 10-20의 간격 후 다시.</li>
	<li>최종 재판 후 30 분 pentobarbital (400 mg/kg)의 과다와 쥐 희생. 자신의 집 새 마 취의 동일한 복용량 일반인된 제어 쥐를 주입.</li>
</ol> 3. 금지 회피 시험 <ol><li>조사 상황별 학습 주제 쥐 금지 회피 (IA) 테스트 ( 그림 1D에 Mitsushima 그 외 여러분, 2011, 2013 10 , 11) 피와 같은 실험의 날에 어떤 에피소드 경험 사람들과, 케이지 변경 또는 청소 문의. 조용 하 고, 온도 제어 룸 (23 ± 1 ° C)에서 작업을 수행. 
	참고: IA 교육 기구는 2 연 발 아크릴 상자 (길이 33cm, 폭 58cm, 높이 33 cm). 그것은 조명 안전 측면과 트랩 도어 ( 그림 1D)으로 구분 된 어두운 충격 측.</li>
	<li>조명된 상자의 안전 (조명된) 사이드에 쥐를 배치합니다. 스트레스 없이 부드럽게 쥐 처리.</li>
	<li>대기 짧은 시간 (10 ~ 20 s) 환경에 쥐를 적응.</li>
	<li>자유로이 어두운 상자 입력 쥐 수 있도록 슬라이딩 도어를 엽니다.</li>
	<li>쥐 소설 어둠 상자를 입력 하기 전에 대기 시간 (s)를 측정 합니다. 첫 번째 재판의 대기 시간을 나타냅니다는 쥐 &#39; 훈련 전에 s 성능.</li>
	<li>어둠으로 입장, 후 문을 닫고 스크램블된 전기 발 충격을 적용 (2 s, 1.6 mA) 설정 상자의 바닥에 전기 강철 막대를 통해. 실습 쥐 충격된 되지 않고 1 분 동안 훈련 장치를 탐험 하실 수 있습니다. 대 한 몇 가지 조명된 충격 장에 집 짝이 없는 쥐 일 갑자기 줄 에피소드 경험 없이 충격. 어떤 그룹에서 스트레스 없이 부드럽게 처리.</li>
	<li>10 어둠 상자에 각 쥐를 계속 집 케이지를 반환 하기 전에 s.</li>
	<li>에서 30 분 발 충격 후 다시 조명 상자에 쥐를 놓습니다. 어두운 면을 입력 대기 시간 측정.</li>
	<li>홈 케이지를 쥐 반환.</li>
	<li>에서 60 분, 충격 후 pentobarbital (400 mg/kg)의 과다로 쥐를 희생. 쥐를 부드럽게 처리 하 고 intraperitoneally 마 취 주사. 훈련 되지 않는 통제 쥐에 있는 위에서 설명한 경험 없이 자신의 집 새에 마 취 주사.</li>
</ol> 4. 해 부 버퍼 <ol><li>0.195 g NaH 2가 4-2 H 2 O, 0.188 g KCl, 0.074 g CaCl 2, 1.423 g MgCl 2-6 H 2 O, 12.579 g 콜린 염화 초순 (950 mL 900 mL)의 결정을 분해 . 표 1을 참조 하십시오.</li>
	<li>2.340 g 아 스 코르 빈 산, 0.342 g pyruvic 산 나트륨 소금, 2.100 g NaHCO 3 및 4.500 g 포도 당 결정을 분해.</li>
	<li>추가 최대 1000 mL 물. Osmolality의 범위 사이 있을 것입니다 290 mOsm/L 및 300 mOsm/l. 조정 osmolality 초순, 추가 하 여 범위 라면.</li>
	<li>5% CO 2 솔루션 거품 / 95% O 2 가스 사용 하기 전에 5 분 동안 차가운 온도에서 혼합.</li>
</ol> 5. 인공 뇌 척수 (실제) <ol><li>0.186 g 6.700 g NaCl, KCl과 0.156 g NaH 2 포의 해산 결정 4-2 H 2 O 초순 (950 mL 900 mL)에. 표 2를 참조 하십시오.</li>
	<li>5 분에 대 한 가스 혼합물으로 거품</li>
	<li>1.800 g 포도 당 및 2.184 g NaHCO 3의 결정을 분해 한 다음 4 mL MgCl 2와 4 mL CaCl 2 1 M에서 재고 솔루션 추가.</li>
	<li>추가 최대 1000 mL 물. Osmolality의 범위 사이 있을 것입니다 290 mOsm/L 및 295 mOsm/l. 조정 osmolality 초순, 추가 하 여 범위 라면.</li>
	<li>거품 사용 하기 가스 혼합물 전에와.</li>
</ol> 6. 세포내 솔루션 <ol><li>전류 클램프 녹음 (표 3), 0.0746 g KCl 해산, 대 한 6.089 g K-구 루 콘, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA, 500 µ L MgCl 2 1 M에서 주식 180 mL 초순에 솔루션 (pH 7.2 코와를 조정).
	<ol>0.4408 g 나 2-ATP, 0.0418 g 나 3-GTP와 0.510 g Na-phosphocreatine <li>추가. 200 mL에 물을 추가 하 고 코와 함께 7.35에 pH 조정.</li>
		<li>초순 추가 하 여 약 290 mOsm/l osmolality 조정.</li>
		<li>1 mL aliquots 냉동 실 (-30 ° C)에 게.</li>
	</ol></li> <li>전압 클램프 녹음 (표 4), 5.244 g CsMeSO 3, 0.672 g CsCl, 해산 대 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA, 500 µ L MgCl 2 1 M에서 주식 180 mL 초순에 솔루션. 7.2 CsOH와에 pH를 조정 합니다. MEPSP 및 mIPSP 녹음, 수정된 농도 5.814 g CsMeSO 3와 0.252 g CsCl의 GABA A 수용 체 응답 11의 역 분개 잠재력을 조정 하려면 사용 합니다.
	<ol>0.4408 g 나 2-ATP, 0.0418 g 나 3-GTP와 0.510 g Na-phosphocreatine <li>추가. 200 mL에 물을 추가 하 고 조정 CsOH 함께 7.35에 pH.</li>
		<li>초순 추가 하 여 약 290 mOsm/l osmolality 조정.</li>
		<li>1 mL aliquots 냉동 실 (-30 ° C)에 게.</li>
	</ol></li></ol> 7. 준비를 슬라이스 희생, 쿨 다운 ( 그림 2A) 얼음으로 모든 해 부 도구를 <ol><li>이전. 접촉 표면 영역을 증가 얼음 용기에 냉 수의 약 500 mL를 추가 합니다. 이 절차를 설명 했다 이전 10 , , 11 12. 
	참고: 도구는 여기 있다: 큰가 위, 아이리스가 위, 주걱, 마이크로 주걱, 집게, 핀셋, 스테인리스 200 mL 비 커, 트리밍, 가스 혼합물으로 치료 해 부 버퍼 가득 120 mL 심장 관류 주사기 뇌에 대 한 블레이드는 일반된 18 게이지 바늘, 스테인리스 뇌 해 부 단계에 연결 된 실리콘 튜브 (20 cm) (두께 3 m m, ϕ = = 12 cm), 및 설치 단계는 vibratome에 대 한 (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>는 Pentobarbital (400 mg/kg 체중)의 과다와 함께 그것을 마비 하 여 행동 패러다임을 완료 한 후 30 분 쥐를 희생. 빠르게 되도록 조각 가능한 10 , , 11 12로 건강 슬라이스 준비를 수행 합니다. 두뇌 extr동작 프로토콜 우리 대학에 대 한 모든 수의 기준에 부합.</li>
	<li>차가운 해 부 버퍼 (표 1) 120 mL 주사기 5% CO 2 부풀어 채우기 / 95% O 2 가스 혼합물. 관류 전에 모든 기포를 제거.</li>
	<li>마음, 노출 후 좌 심 실의 후부 부분에 바늘을 삽입.</li>
	<li>수행 transcardial 관류 주사기를 사용 하 여 수동으로 하는 두뇌의. 큰 쥐 관류에 대 한 더 많은 해 부 버퍼를 필요로합니다. 5 분 거품 버퍼에 대 한 차가운 해 부 버퍼와 두뇌는 침수 동안 지속적으로 잠수함.</li>
	<li>트림 블레이드를 사용 하 여 대상 피 질 영역의 수지상 방향 각도 동시에 두뇌의 후부 측면. 때문에 두뇌는 컷된 끝 아래쪽으로 해 부 무대에 서 서, 초기 각도를 모든 후속 뇌 조각의 각도를 결정 합니다. 이 단계는 매우 중요 하다 ( 그림 2B). 잘못 된 각도 대상 피라미드 뉴런을 통해 잘라 수 있습니다. 
	참고: 여기에 도구는: 두뇌 트리밍에 대 한 블레이드, 필터 종이 (ϕ = 10 cm), 스테인리스 뇌 해 부 무대 (두께 3 m m, ϕ = = 12 cm), 주걱는 superglue, 스 포 이트, 및 설치 단계는 vibratome에 대 한 (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>는 350 µ m는 vibratome를 사용 하 여 두꺼운 코로나 뇌 조각 잘라. 얼음 처럼 차가운 버퍼와 해 부 챔버 5% CO 2 부풀어 채우기 / 95% O 2 가스 혼합물 ( 그림 2C). 뇌 조각 동안 지속적으로 버퍼를 거품.</li>
	<li>아이리스가 위를 사용 하 여 대상 영역의 주변 트림.</li>
	<li>세척 실제 실 온에서 부드럽게 손질된 조각 부풀어 5% CO 2 / 95% O 2 (표 2).</li>
	녹음 때까지 인터페이스 챔버를 <li>유지는 손질된 조각 ( 그림 2D 및 E)를 수행 합니다. 1 h는 챔버에 대 한 보육은 셀의 상태를 개선 하지만 고기 조각 이상 10 시간 동안 알을 품는 경우 변경. 묶을 가스 챔버의 뚜껑을 닫고 실제의 작은 액체 방울.</li>
</ol> 8. 전체 셀 패치 클램프 참고: 전체 셀 녹음 필요 앰프와 저역 통과 필터를 5 kHz의 컷오프 주파수로 설정 되어. 신호는 디지털화 하 고 PC에 저장. 저장 된 데이터는 분석 오프 라인 ( 그림 3A).
<li>만들기 유리 전극 수평 끌어당기는 사람을 사용 하 여 <ol>. 적합 한 솔루션 (표 3 및 4) 전극 채우기 좋은 유리 튜브와 0.22 μ m 필터에 연결 된 일반 폴 리 에틸렌 1 mL 주사기를 사용 하 여.</li>
	<li>셀과 접촉, 이전 긍정적인 압력을 유지 하 고 전류 0를 피펫으로 조정.</li>
	<li>Gigaohm 물개를 형성 후 세포 막 ( 그림 3 층에 전체 셀 구성) 파열 부정적인 압력 적용.</li>
</ol> 9. 전류 클램프 분석 <ol><li>세포 막의 <ol><li>속성 입력 전류 클램프 녹음 (표 3)에 대 한 세포내 솔루션 펫을 기록 하는 패치. 4 m ω 및 7 m ω는 실제 사이 피 펫의 저항입니다.</li>
		<li>막 파열 후-60에서 막 전압을 잡고 mV V-클램프 모드에서. 다음,에서 전환 &#34; 목욕 &#34; 모드를 &#34; 셀 &#34; 막 커패시턴스, 저항 및 시간 상수 등 기본 셀 속성을 측정 하는 소프트웨어를 사용 하 여 막 테스트에서 모드.</li>
	</ol></li> <li>현재 주입 연구 <ol><li>기본 셀 속성을 기록한 후 트랙에 V-클램프에서 모드 전환 (나 = 0) 현재 분사에 대 한 /I-CLAMP 정상. 액체 접합 잠재력 여야 수정된 10.</li>
		<li>300 부인에 대 한 현재 셀에 넣기에서 stepwise 전류의 강도 변경할 &#8722; 50 pA 증가와 +550 pA 100 pA. 스파이크 (활동 전위) 현재 주사 하 여 elicited 개수.</li>
		<li>(이) 활동 전위를 유도 하는 데 필요한 최소 전압 측정.</li>
		<li>Afterhyperpolarization 진폭 스파이크 개시에서 전압과 최저 전압 afterhyperpolarization 7 동안 달성 간의 차이 계산.</li>
	</ol></li></ol> 10. 전압 클램프 분석 <ol><li>는 AMPA/NMDA 비율 참고: The AMPA/NMDA 비율은 glutamatergic 흥분 성의 시 냅 스 7 , 8에 postsynaptic 소성을 평가 하는 기존의 방법 , 9 , 10 , 그러나 11., 두 구성 요소에 있는 수 반하는 증가 비율 13을 변경 하지 될 수 있습니다 주의.
	<ol><li>Perfuse 생리 적인 솔루션으로 녹음 실 가스 혼합물으로 부풀어 및 GABA A-응답을 중재 하 고 4 µ M 2를 추가-차단 솔루션에 25 ° C. 추가 0.1 m m picrotoxin에 22 ° C에 온도 유지 chloroadenosine 안정 갖는 신경 응답 14.</li>
		<li>입력 전압 클램프에 대 한 세포내 솔루션 펫 녹음 패치 녹음 (표 4). 에 실제 기록 피 펫의 저항을 확인 하십시오. 4 m ω 및 7 m ω 사이 성이.</li>
		<li>M 1에서 레이어 II/III 피라미드 뉴런에 녹음 장소 바이 폴라 텅스텐 전극 200 µ m forelimb 표현의 영역에서 pial 표면 아래 기록에 있는 셀에 300 µ m 측면에 자극 (2 mm 옆에는 중간 선) 15 , , 16 17.</li>
		<li>CA1 피라미드 신경에 기록를 위해 300 µ m 측면 (Schaffer 부수적인 섬유)을 자극 전극 200 µ m 또는 중간 (temporoammonic 통로) 됩니다 셀에 기록 ( 그림 3B).</li>
		<li>시냅틱 응답까지 자극 강도 증가 &#62; 10 실바</li>
		<li>AMPA/NMDA 비율 계산에서 측정 된 피크 전류 비율 &#8722; 60 현재 mV 측정 + 40 mV 150에 자극 발병 후 밀리초. 비율을 계산 50 ~ 100 트레이스를 평균 한다 참고.</li>
	</ol></li> <li>미니어처 postsynaptic 현재 녹음 참고: 미니어처 흥분 성의 postsynaptic 전류 (mEPSCs) 조미료의 단일 기의 연 접 릴리스에 의해 elicited 응답에 해당 하 고 생각 된다 18 . 반면, 소형 금지 postsynaptic 전류 (mIPSCs) 해당 GABA 18의 단일 기의 연 접 릴리스에 의해 elicited 응답 하 생각 된다. MEPSCs 및 mIPSCs의 진폭에 있는 증가 반영 postsynaptic 전송 강화, 증가 하면서 주파수 기능 시 냅 스 연 접 릴리스 확률의 수에 있는 증가 반영 하는 이벤트에 11 .
	<ol><li>-60에 수정 된 세포내 솔루션 (표 4) 조정의 GABA A 수용 체-중재 전류 반전 잠재력을 패치 기록 피 펫을 채우기 mV.</li>
		<li>자발적인 활동 전위를 막기 위하여 목욕에 추가 0.5 µ M 테트로도톡신.</li>
		<li>보류-60에서 전압 mV r ~ecord 5 분에 대 한 mEPSC 이벤트</li>
		<li>변경 0으로 잠재적인 지주 mV 5 분에 대 한 기록 mIPSC 이벤트 ~. M 1 뉴런의 mIPSCs + 15에 기록 됩니다 때문에 m 1 뉴런 약간 높은 반전 AMPA 수용 체-중재 전류에 대 한 잠재적인 표시, 0.1 m m APV mV.</li>
		<li>전류 안정화를 위한 몇 분 동안 기다려.</li>
		<li>5 분에 대 한 mIPSC 이벤트 기록</li>
		<li>는 소프트웨어를 사용 하 여 미니어처 이벤트를 감지 하 고 10 pA 위의 이벤트를 사용 하 여 분석에 대 한. 주파수를 결정 하기 위해 5 분 동안 mEPSCs 또는 mIPSCs 이벤트의 수를 계산 합니다. 평균 평균 진폭을 얻기 위해 이벤트의 진폭.</li>
		<li>목욕 치료 10 µ M CNQX 또는 10 µ M bicuculline methiodide mEPSCs 및 mIPSCs 이벤트를 각각 차단 여부 확인.</li>
	</ol></li> <li>쌍 펄스 분석 참고: 연 접가 소성 결합 펄스 분석을 사용 하 여 분석 될 수 있다. 짝 주파수 증가 제안 연 접 조미료에 감소 또는 GABA 해제 확률 7 , , 10 11.
	<ol>흥분 성의 시 냅 스를 분석 하 고, 0.1 m m picrotoxin를 추가 하 고-60에 대 한 응답을 기록 하는 <li>mV. 비록 우리가 목욕에 4 µ M 2-chloroadenosine를 추가, 우리는 약 연 접 릴리스 확률 14에 영향을 염두에 두어야 필요.</li>
		<li>억제 시 냅 스를 분석 하는 목욕을 0.1 mM APV 4 µ M 2-chloroadenosine를 추가 하 고 0 응답 기록 mV. M1 뉴런에 + 15에 응답 기록 mV.</li>
		<li>100 ms 또는 200 양 간 자극 간격 쌍된 펄스를 적용</li>
		<li>각 잠재적인 들고에서 50-100 순차적 추적을 기록 하 고 평균 값.</li>
		<li>Postsynaptic 현재 첫 번째 피크에 대 한 두 번째 피크의 비로 짝된 펄스 비율 계산.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Edwards, F. 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C., Sessle, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noxious+lingual+stimulation+influences+the+excitability+of+the+face+primary+motor+cerebral+cortex+(face+MI)+in+the+rat.">Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat.</a> J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).</li><li>Tennant, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+forelimb+representation+of+the+C57BL/6+mouse+motor+cortex+as+defined+by+intracortical+microstimulation+and+cytoarchitecture.">The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture.</a> Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).</li><li>Pinheiro, P. S., Mulle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glutamate+receptors:+physiological+functions+and+mechanisms+of+action.">Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).</li><li>Kwon, H. B., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex.">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).</li><li>Hess, G., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+of+horizontal+connections+provides+a+mechanism+to+reorganize+cortical+motor+maps.">Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps.</a> J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).</li><li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+theory+of+communication.">A mathematical theory of communication.</a> Bell Sys Tech J. 27, (1948).</li><li>Ono, K. M., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+creates+diversity+of+excitatory+and+inhibitory+synapses+in+the+hippocampal+CA1:+a+possible+amount+of+information+at+a+single+synapse.">Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse.</a> J Physiol Sci. 67, (2017).</li><li>Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+within+highly+specific+neuronal+populations+identifies+a+unique+parcellation+of+motor+learning+in+the+adult+brain.">Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).</li></ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다. 우리는 우리가 윤리적 게시에 관련 된 문제에 저널의 위치를 읽고 우리 긍정이 보고서는 그 지침과 일치 확인 합니다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 또는 분석, 게시, 결정 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다.

조각 패치 클램프 방법의 주요 한계에 비보를 어떻게 반영 되지 않을 수 있습니다 슬라이스 준비에서 기록 이다. 전류 클램프 분석 vivo에서 더 안정적 이지만, 그것은 기술적으로 의식이 있는 동물에서 충분 한 데이터를 얻는 도전 이다. 각 피라미드 뉴런의 속성이 다른 세포 때문 세포의 충분 한 숫자는 제대로 훈련 후 신경에 차이 분석 하 필요 하다. 또한, 전압 클램프 분석 postsynaptic 응답의 성격을 결정 하는 CNQX, APV, 또는 bicuculline 지속적인 약물 치료를 필요 합니다. 조미료 또는 GABA의 단일 소포에 의해 유도 된 미니어처 응답 분석, 테트로도톡신 연속 치료 자발적인 활동 전위를 차단 필요 합니다. 비록 최근 개발 된 다중 광자 이미징 기술을 흥분 성의 시 냅 스19에서 형태학 상 변화를 분석 하기 위한 강력한, 결합 된 패치 클램프 기술 vivo에서시 냅 스의 기능 분석 필요 합니다. 그것은 현재 가장 억제 시 냅 스는 등뼈를 형성 하지 않습니다 이후 억제 시 냅 스에서 형태학 상 변화를 분석 하는 매우 어렵습니다. 이 시점에서 조각 패치 클램프 셀 속성 또는 훈련된 동물에 흥분 성의 억제 시 냅 스의 기능 분석에 가장 적합 한 기술 될 것 이다.
전류 클램프 분석 (그림 4)를 사용 하 여, 우리는 최근 레이어 II/III 뉴런에 모터 학습 유도 내장 소성을 했다. 특히, 1 일 훈련된 쥐 스파이크 임계값에 막 잠재력 및 증가 휴식에 상당한 감소를 보여주었다. 2 일 훈련된 쥐 휴식 막 잠재력 증가 흥분 시킨 중요 한 증가 보였다. 이 결과 제안 하는 거기 훈련 된 쥐에 M1 층 II/III 뉴런의 본질적인 소성에서 동적인 변화를 했다. 추가 전압 클램프 분석 공개 1 일 훈련된 쥐, 연 접 GABA 릴리스 확률7에 일시적인 감소 했다 제안에 쌍 펄스 비율에 증가 했다. 그것은 따라서 가능한 II/III synapses 계층에서 GABA에서 그 disinhibition m 1에서 결과 학습 유도 소성 시킬 수도. 이 지원 m 1의 슬라이스 준비 LTP20유도 GABAA 수용 체 차단제와 목욕 치료를 필요 합니다.
미니어처 postsynaptic 잠재력의 분석 IA 훈련 동물에 시 냅 스가 소성을 검출 하는 강력한 방법입니다. 기록 mEPSCs 및 mIPSCs에에서 순차 CA1 신경 각 개별 뉴런의 흥분 성의 억제 시 냅 스의 분석을 수 있습니다. 단일 이후 나 (I) PSC 응답은 조미료 또는 GABA, 증가 한 소포에 기인 나 (I) PSC 진폭 postsynaptic 강화 제안. 나 (I) PSC 분석을 사용 하 여, 우리는 각 CA1 신경 (그림 5C)에 흥분 성의 억제 입력의 강도에서 개별 차이 발견. IA 교육 명확 하 게 시 냅 스 강도, 다양성을 승진만이 아니라 다른 그룹 (표 5)에서 관찰 되었다.
시 냅 스 다양성 학습 유도 수학적으로 분석할 수 있습니다. 각 포인트의 출현 확률을 계산 하 여 각 뉴런에서 데이터 자체-엔트로피 (비트) Claude E. Shannon21의 정보 이론을 사용 하 여 변환할 수 있습니다. 매우 드문 확률 (이탈된 포인트) 점을 나타냅니다 높은 자기-엔트로피 (평균 수준)의 주위에 모양 높은 확률으로 포인트 낮은 자기-엔트로피, 나타냅니다. 익숙하지 않은 쥐에 비해 신경 당 자체 엔트로피 IA 훈련 된 쥐에 명확 하 게 증가 했지만 하지 짝이 없는 또는 도보 쥐22. 이 분석 내부 CA1 정보 상황별 학습 후에 증가 했다 나왔다.
조각 패치 클램프 기술 문장을 두려움 컨디셔닝 측면 편도9 연구 및 신 피 질8에서 감각 경험 연구에 사용할 수 있습니다. 또한,이 기술은 추가 조사에 대 한 다양 한 다른 기술을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 바이러스 중재 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그 유전자 전달 기술을 특정 분자의 기능을 분석 하는 패치 클램프 기술 결합 될 수 있다. 또한, 특정 신경 특정 영역을 그 프로젝트를 시각화 하는 역행 추적 프로그램의 초점 microinjection은 사용할 수 있습니다. 그런 다음 전류 클램프 기술을 사용 하 여, 휴대 전용 속성 분석할 수 있습니다 시각된 신경23에. 또한, 조미료의 2 광자 레이저 uncaging와 결합 2 광자 레이저 스캔 현미경 척추 관련 성장과 마우스 피 질에서 EPSC 응답 레이어 II/III 피라미드 뉴런19보여 주기 위해 사용 되었습니다. 따라서, 조각 패치 클램프 기술 소설 화학, 유전자 전달와 사진 조작 기술을 결합 하 여 향상 되는.

정치학자 그리고 Sakmann에 의해 개발 된 패치 클램프 기술 electrophysiological 실험1에 대 한 널리 사용 되었습니다. 전체 셀 패치 클램프 기술2 전류 세포내 또는 세포 막의 gigaohm 물개를 사용 하 여 전압을 기록 하는 데 사용할 수 있습니다. 전류 클램프 기술 잠재력, 저항 및 커패시턴스3휴식 같은 막 속성에 차이 분석할 수 있습니다. 전압 클램프 기술 흥분 성의 억제 시 냅 스에서 시 냅 스가 소성 학습 유도 분석할 수 있습니다.
기본 모터 피 질 (M1)은 숙련 된 자발적인 움직임을 만들기 위한 중요 한 중앙 지역 이다. 이전 electrophysiological 연구 시연 장기 potentiation (LTP)의 개발-같은 레이어 II/III 흥분 성의 synapses 숙련 된 모터 훈련4후에 소성. 또한, vivo에서 이미징 연구에 더 숙련 된 도달 작업5,6후 M1 모 수석 등뼈의 개장 시연. 그러나, 학습 유도 시 냅 스 하 고 본질적인 소성 되지 M1 뉴런에 표시 되었습니다.
우리는 최근로 터 로드 작업 승진 glutamatergic 동적 변화 및 GABAergic synapses 고 M1 층 II/III 신경7에 본질적인 소성 변경 했다. 여기 우리 학습 유도 소성 조사 조각 패치 클램프 기술 사용. 이 기술은 또한 다른 두뇌 지구에서 경험 종속 소성의 다른 종류를 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 총 신 피 질에 감각 입력 AMPA 수용 체-중재 흥분 성의 입력을 레이어 II/III 신경8, 강화 수 있습니다 하 고 문장을된 두려움 컨디셔닝 강화 측면 편도 뉴런에 흥분 성의 입력이 필요 메모리9공포. 또한, 상황별 학습 hippocampal CA1 신경10,11에 흥분 성의 억제 시 냅 스 입력 측면에서 다양성을 만듭니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Rota-Rod Treadmills</td>
			<td >Med Associates Inc.</td>
			<td >ENV577</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >inhibitory avoidance box</td>
			<td>Shinano Seisakusho</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blade</td>
			<td>Nisshin EM Co., Ltd</td>
			<td>LC05Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cardiac perfusion syringe</td>
			<td>JMS Co., Ltd</td>
			<td>JS-S00S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibratome</td>
			<td>&#160;Leica Microsystems</td>
			<td>VT-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Horizontal puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microfilm 34 gauge</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>MF34G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axopatch&#8211;1D amplifier&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digidata 1440 AD board</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pCLAMP 10 software</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Camera controller</td>
			<td>Hamamatsu Photonics K.K.</td>
			<td>C2741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td>Nihon Kohden</td>
			<td>SEN-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isolator</td>
			<td>Nihon Kohden</td>
			<td>SS-104J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motorized manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NMN-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td>Gilson, Inc</td>
			<td>MINIPULS&#174; 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass capillary</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ag/AgCl electrode&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>EP4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Slice Anchor</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>64-0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stimulus electrode</td>
			<td>Unique Medical Co., Ltd</td>
			<td>KU201-025B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection buffer/ 
			artificial CSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4 &#8226; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>C1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-00475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2 &#8226; 6H2O</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>135-00165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Choline chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ascorbic acid</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>190-01255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pyruvic acid Na</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>199-03062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>28-1850-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>07-0680-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Intracellular solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>346-01373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>348-01311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na2 ATP</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01072-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na3 GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>G-8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>P-7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CsMeSO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>C1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CsCl</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>033-01953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Drugs in aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-Chloroadenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>C5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Picrotoxin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>P-1675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tetrodotoxin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>207-15901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CNQX&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>C239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>A5282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slice patch clamp technique for analyzing learning-induced plasticity

조각 패치 클램프 기술 조사 특정 두뇌 지역에서 신경가 소성 학습 유도 위한 강력한 도구입니다. 모터-학습 유도 소성을 분석, 우리가 쥐 가속된 회전자 로드 작업을 사용 하 여 훈련. 쥐 1 개 또는 2 일에 대 한 10 번에서 30 s 간격으로 작업을 수행. 성능 첫 시험에 비해 훈련 일에 크게 개선 되었다. 우리는 다음 일반인 및 훈련 된 쥐에 기본 모터 피 질 (M1)의 급성 뇌 조각을 준비. 전류 클램프 분석 레이어 II/III 피라미드 뉴런에 막 잠재력, 스파이크 임계값, afterhyperpolarization, 고 막 저항 휴식에서 동적인 변화를 보였다. 현재 분사 유도 일반인된 컨트롤에 보다 2 일 훈련 된 쥐에 있는 많은 더 많은 스파이크.
상황별 학습 유도 소성을 분석, 우리가 쥐 금지 회피 (IA) 작업을 사용 하 여 훈련. 상자의 어두운 면에 발 충격을 경험한 후 쥐가 그것을 피하기 위해, 조명된 쪽에서 배웠습니다. 우리는 일반인, IA 훈련, 짝이 없는, 급성 hippocampal 슬라이스 및 실습 쥐 준비. 전압 클램프 분석 미니어처 흥분 성의 및 금지 postsynaptic 전류 (mEPSCs 및 mIPSCs) 동일한 CA1 신경에서 순차적으로 기록 하는 데 사용 되었다. 우리는 각 신경의 흥분 성의 억제 시 냅 스에서 다른 postsynaptic 강점 했다 제안 각 CA1 신경에서 다른 말은 mEPSC 및 mIPSC 진폭을 발견. 또한, IA 훈련 쥐 높은 mEPSC 및 mIPSC 진폭, 광범위 한 다양성을 했다 일반인 컨트롤과 비교. 이 결과 제안 상황별 학습 각 CA1 신경에서 흥분 성의 억제 시 냅 스에 postsynaptic 다양성을 만듭니다.
AMPA 또는 GABAA 수용 체 postsynaptic 전류 CNQX 목욕 치료 이후 중재 하 듯 또는 bicuculline 각각 mEPSC 또는 mIPSC 이벤트를 차단 합니다. 이 기술은 공부 감각 피 질, 편도 등의 다른 지역에서 배우기의 다른 종류를 사용할 수 있습니다.

우리가 설명 했 듯이 최근7, 회전자 봉 훈련 (그림 1A) m 1 층 II/III 피라미드 뉴런의 본질적인 소성에서 동적인 변화를 유도 한다. 대기 시간을 측정 하는 쥐 회전 막대에서가까지 쥐의 숙련 된 학습 성능을 측정 하 수 있습니다. 긴 대기 시간 더 나은 모터 성능을 나타냅니다. 교육의 날 1, 쥐 재판이 끝날 때까지 그들의 회전자 로드 성능 향상. 평균된 세션에서 하루 2, 쥐 달성 거의 점근 수준에 점수 (그림 1B). 첫 번째 재판에서 대기 시간와 비교 게시물-특별 분석 훈련 일 (그림 1C)에 최종 재판에서 상당한 개선을 보여주었다.
그림 4A 전류 클램프 분석 모터 기술 학습 후 신경 속성 변경의 예가 나와 있습니다. 400 pA 및 pA 전류 500의 각각 활동 전위 일반인된 그룹 및 1 일 훈련 된 쥐를 유도 하기 위해 필요 했다. 반면,만 150 파 전류 주입 2 일 훈련 된 쥐에 있는 활동 전위를 유도 하기에 충분 했다. 활동 전위의 수와 현재 강도 간의 관계는 그림 4B에 표시 됩니다. 작은 50 pA 현재 2 일 훈련된 쥐;에 스파이크를 유도 하기에 충분 했다 반면, 1 일 훈련된 쥐 350 pA와 더 높은 전류를 쌓지 않은 쥐 보다 적은 활동 전위와 반응. 또한, 그림 4C 는 1 일 훈련된 쥐 보였다 낮은 휴식 잠재력, 반면 2 일 훈련된 쥐 보여준 높은 휴식 잠재력 (그림 4C)와 막 저항 (높은 임계값, 그리고 깊은 afterhyperpolarization, 스파이크 그림 4D)입니다.
앞에서 설명한 우리11, IA 훈련 (그림 1D) hippocampal CA1 신경의 흥분 성의 억제 시 냅 스에 postsynaptic 소성을 유도 한다. 라이트 박스에서 대기 시간을 측정 하 여 쥐의 상황별 학습 성능을 예상 수 있습니다. 그림 1E IA 작업의 결과 보여 줍니다. 쌍을 이루는 전기 충격 후 쥐 상자의 어두운 면을 방지 하 고 그들은 일반적으로 선호 하지 조명된 측면에서 배워야만. 어둠을 피하기 위해 경향이 따라서 문맥상 기억의 인수를 나타냅니다.
그림 5 는 미니어처 postsynaptic 전류 극적으로 상황별 학습 후 변경 된 전압 클램프 분석의 예가 나와 있습니다. 조사 학습 유도 소성, 자발적인 AMPA 중재 mEPSCs 및 GABAA-중재 mIPSCs 0.5 µ M 테트로도톡신 (그림 5A 와 B)의 순차적으로 기록 되었다. 2 차원 플롯 (그림 5C)에 표시 된 대로 각 CA1 신경 mEPSCs 및 mIPSCs에 대 한 다른 말은 진폭을 했다. 진폭 낮은 좁은 범위에 보였다 했지만 일반인, 홀, 도보 쥐 그 IA 훈련 쥐 (표 5)에 다양 한 했다. 다음 post hoc 분석 ANOVA 보였다 mEPSC의 평균 진폭에 있는 상당한 증가 및 mIPSC IA 훈련 쥐 (그림 5E) CA1 신경 세포에 postsynaptic 소성 학습 유도 제안.
또한, 각 CA1 신경 다른 mEPSC와 mIPSC 주파수 (그림 5D) 전시. 주파수 낮은 좁은 범위에 보였다 했지만 일반인, 홀, 도보 쥐 그 IA 훈련 쥐 (표 6)에 다양 한 했다. 다음 post hoc 분석 ANOVA IA 훈련 쥐 (그림 5 층)에서 mEPSC 및 mIPSC 이벤트의 주파수에서 상당한 증가 보였다. 이러한 결과의 2 개의 가능한 해석이 있다. 첫 번째는 상황별 학습 기능 시 냅 스는 신경 세포의 수를 증가 했다. 다른 상황별 학습 조미료와 GABA의 연 접 릴리스 확률 증가입니다.
추가 검사 연 접가 소성, 우리 또한 실시 짝 펄스 stimulations, 이전10,11보고.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2.jpg"> 
그림 1 : 학습 훈련 후. 
A: 실험 설계 회전자 봉 교육 및 코로나 뇌 조각을 보여줍니다. B: 가속 회전자 봉 총 신에서가을 대기 하는 평균 시간. C: 평균 대기 시간 막대의 첫 번째 훈련 1-2 일7에 최종 재판에가을. P&#60; 0.01 대 첫 재판. D: 금지 회피 (IA) 작업 및 코로나 뇌 조각의 스키마. E: IA 훈련11전후 어두운 상자를 입력 대기 하는 평균 시간. P&#60; 0.01 대 IA 훈련 하기 전에. 코로나 섹션으로 숫자 m m에서 bregma에 앞쪽 거리를 나타냅니다. 동물의 수는 막대의 아래쪽에 표시 됩니다. 오차 막대 표시 SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig2.jpg"> 
그림 2 : 슬라이스 절차. 
A: 사진 보여 급성 뇌 조각 준비. 해 부 도구는 사용 하기 전에 얼음에 냉각 했다. B: 뇌의 해 부와 트리밍. 참고 수지상 방향으로 동시에 후부 측면에서 트리밍의 각도 지향 합니다. C: vibratome 챔버에 두뇌를 슬라이스. 뇌 해 부 버퍼에 목욕 하 고 지속적으로 5% CO2/95% O2 가스 혼합물으로 부풀어. D: 인터페이스 챔버를 두 개의 플라스틱 식품 용기 및 실리콘 튜브의 만든. 챔버 인공 CSF로 가득 했 고 가스 혼합물으로 지속적으로 부풀어. E: 뇌 조각 챔버에서 필터 종이에 배치 했다.바 = 5 m m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig3.jpg"> 
그림 3 : 패치 클램프 절차. 
A: 신경에서 전기적 신호를 기록 하는 데 사용 하는 패치 클램프 시스템. 자극 하 고 레이어 II/III 뉴런에서 녹음 하는 전극의 위치는 쥐 모터 피 질에 표시 됩니다. B: CA1 피라미드 뉴런의 Schaffer 시 냅 스를 분석 하는 자극 전극 지층 radiatum에 배치 했다. Temporoammonic 시 냅 스를 분석 하는 자극 전극 지층 moleculare에 배치 했다. 대표 흔적 갖는 AMPA와 NMDA 수용 체-중재 흥분 성의 postsynaptic 전류 같은 CA1 신경에 표시 됩니다. C: 슬라이스 앵커 녹음 실에서 슬라이스를 안정화 하는 데 사용 되었다. D: 게시 된 논문15,,1617에 따라 모터 피 질에서 표현 지도. ML = 중간. E: M 1의 IR DIC 현미경 레이어 전에 II/III 신경 (위) 및 (낮은) 기록 하는 동안. 바 = 10 µ m. F: 터치 (상단) 전에 고 막 파열 (하단)에서 현재 피 펫에 변화. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig4.jpg"> 
그림 4 : 전류 클램프 분석7 의 대표적인 결과 . 
A: 활동 전위의 대표적인 흔적 현재 주사와 유도 후 기록. B: 말은 현재 입력 (pA) 뇌 조각에 활동 전위 출력 (스파이크의 수) 대 일반인된 (오픈 바), 1 일 훈련된 (회색 막대), 그리고 2 일 훈련된 쥐 (채워진된 바) 간의 관계. C: 휴식 잠재력, 임계값 및 레이어 II/III 뉴런의 afterhyperpolarization. D: 막 저항 및 신경 세포의 직렬 저항. 우리는 각 그룹에 9-10 쥐를 사용합니다. 셀의 수는 각 막대 내에서 표시 됩니다. 오차 막대 표시는 SEM. *P&#60; 0.05, * *P&#60; 0.01 대 일반인. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig5.jpg"> 
그림 5 : 전압 클램프 분석11 의 대표적인 결과 . 미니어처 흥분 성의 및 금지 postsynaptic 전류 (mEPSCs 및 mIPSCs) 일반인된 (A)와 억제 회피 (IA)의 대표적인 흔적-쥐 (B) 훈련. -60 mV, mV 테트로도톡신 (0.5 µ M)의 존재는 같은 CA1 피라미드 뉴런에서 순차적으로 측정 하는 0에서 mIPSCs에 mEPSCs. 세로줄 20 pA, 가로 바 = = 200 밀리초. C: 2 차원 플롯의 의미 나 (I) PSC 진폭에 일반인, IA-훈련, 홀, 및 도보 쥐. D: 나 (I) PSC의 2 차원 플롯 4 그룹에 주파수. 참고 각 CA1 신경 다른 전시 나 (I) PSC 진폭 및 주파수를 의미 합니다. IA 교육 뿐만 아니라 평균 진폭을 강화 했다 (E) 또한 증가 나 (I)의 주파수 PSC 이벤트 (F). 우리는 각 그룹에 4-6 쥐를 사용합니다. 셀의 수는 막대의 아래쪽에 표시 됩니다. 빨간색 더하기 기호 (C, D)과 수직 라인 (E, F)와 바 나타냅니다 평균 ± SEM. * *P&#60; 0.01 대 일반인 쥐. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55876/55876fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">해 부 버퍼 (총 1 L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2포4 • 2 H2O</td>
			<td>0.195 g</td>
			<td>1.25 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.188 g</td>
			<td>2.5 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>0.074 g</td>
			<td>0.5 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 • 6 H2O</td>
			<td>1.423 g</td>
			<td>7.0 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜린 염화 물</td>
			<td>12.579 g</td>
			<td>90 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>의약품</td>
			<td>2.340 g</td>
			<td>11.6 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic 산</td>
			<td>0.342 g</td>
			<td>3.1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2.100 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도 당</td>
			<td>4.500 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 해 부 버퍼에 대 한 제조 법
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">인공 CSF (총 1 L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>2.5 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>6.700 g</td>
			<td>114.6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH PO42•2H2O</td>
			<td>0.156 g</td>
			<td>1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도 당</td>
			<td>1.800 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2.184 g</td>
			<td>26 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 인공 뇌 척추 액체 (CSF)에 대 한 제조 법
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">전류 클램프 (총 200 mL)에 대 한 세포내 솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.0746 g</td>
			<td>5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-글 루 콘 산</td>
			<td>6.089 g</td>
			<td>130 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0.476 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0.0456 g</td>
			<td>0.6 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>500 Μ L</td>
			<td>2.5 m m o l/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나2 ATP</td>
			<td>0.4408 g</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나3 GTP</td>
			<td>0.0418 g</td>
			<td>0.4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphocreatine</td>
			<td>0.510 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3: 전류 클램프에 대 한 세포내 솔루션에 대 한 제조 법 기록
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">전압 클램프 (총 200 mL)에 대 한 세포내 솔루션</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO3</td>
			<td>5</td></tr></tbody></table>.244 g
			<td>(5.814) *</td>
			<td>115 m m o l/L</td>
			<td>(127.5) *</td>
		
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>0.672 g</td>
			<td>(0.252) *</td>
			<td>20 mmol/L</td>
			<td>(7.5) *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0.476 g</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0.0456 g</td>
			<td></td>
			<td>0.6 m m o l/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>500 Μ L</td>
			<td></td>
			<td>2.5 m m o l/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나2 ATP</td>
			<td>0.4408 g</td>
			<td></td>
			<td>4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나3 GTP</td>
			<td>0.0418 g</td>
			<td></td>
			<td>0.4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphocreatine</td>
			<td>0.510 g</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* 소형 녹음에 대 한 낮은 Cl- 농도</td>
		</tr>
	

표 4: 전압 클램프에 대 한 세포내 솔루션에 대 한 제조 법 기록
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>매개 변수</td>
			<td></td>
			<td>일반인</td>
			<td>IA 훈련</td>
			<td>짝이 없는</td>
			<td>안내</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC 진폭</td>
			<td>분산</td>
			<td>5.8</td>
			<td>32.1</td>
			<td>4.7</td>
			<td>5.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>표준 편차</td>
			<td>2.4</td>
			<td>5.7</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>변동 계수</td>
			<td>0.189</td>
			<td>0.326</td>
			<td>0.177</td>
			<td>0.190</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC 진폭</td>
			<td>분산</td>
			<td>17.1</td>
			<td>56.7</td>
			<td>31.8</td>
			<td>20.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>표준 편차</td>
			<td>4.1</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5.6</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>변동 계수</td>
			<td>0.279</td>
			<td>0.387</td>
			<td>0.367</td>
			<td>0.286</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 5: 미니어처 흥분 성의 금지 postsynaptic 현재 (mEPSC 및 mIPSC) 진폭 억제 회피 (IA)에서 다양성-쥐를 훈련
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>매개 변수</td>
			<td></td>
			<td>일반인</td>
			<td>IA 훈련</td>
			<td>짝이 없는</td>
			<td>안내</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC 주파수</td>
			<td>분산</td>
			<td>278</td>
			<td>2195</td>
			<td>188</td>
			<td>195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>표준 편차</td>
			<td>17</td>
			<td>47</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>변동 계수</td>
			<td>0.902</td>
			<td>1.198</td>
			<td>0.893</td>
			<td>0.874</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC 주파수</td>
			<td>분산</td>
			<td>3282</td>
			<td>27212</td>
			<td>1385</td>
			<td>5135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>표준 편차</td>
			<td>57</td>
			<td>165</td>
			<td>37</td>
			<td>72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>변동 계수</td>
			<td>1.195</td>
			<td>1.006</td>
			<td>0.955</td>
			<td>0.836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 6: 미니어처 흥분 성의 금지 postsynaptic 현재 (mEPSC 및 mIPSC) 주파수 억제 회피 (IA)의 다양성-쥐를 훈련

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Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

조각 패치 클램프 기술 기본 속성 및 흥분 성의 또는 억제 시 냅 스의가 소성 학습 유도 된 변화를 분석 하기 위한 효과적인 방법입니다.

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K 조회수.  Yamaguchi University Graduate School of Medicine. 조각 패치 클램프 기술 기본 속성 및 흥분 성의 또는 억제 시 냅 스의가 소성 학습 유도 된 변화를 분석 하기 위한 효과적인 방법입니다.

비디오: Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial 소포 막 패치 클램프 녹음을 공연&gt; ATPase의 소포의 준비와 기술

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.