This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

참고 : 약 2 35mm 요리 또는 두 개의 라이브 영상 요리, 그래서 계획 mattings, 해부, 따라서 코팅 (단계 2.6)에 대한 하나의 마우스 수익률 충분한 근육 아세포. (10) 동물 - 근육 아세포가 순차적 회 원심 및 예비 도금을 통해 고립되어 있기 때문에, 프로토콜은 5 일괄 적으로 수행해야합니다. 동물 주제와 관련된 모든 절차는 연구소의 드 Medicina 분자와 대학의 피에르 등의 마리 퀴리의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다 신생아 쥐 뒷다리 - 사지 근육의 1. 해부 <ol><li> 사전 (재료 표)의 모든 솔루션을 준비하고 여과 (0.22 μm의 필터)에 의해 소독. 모든 미디어가 기저막 매트릭스 (예를 들어, 마트 리겔)를 포함하는 제제를 제외하고, 세포에 추가하기 전에 37 ° C에 있는지 확인합니다. </li><li> 곡선 가위, 바로 가위, 일반 집게 : 해부 물질 (하나의 각을 소독미세 팁 포셉) 및 70 % 에탄올로 닦아 워크 벤치입니다. </li><li> 근육 수집 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) 5 mL를 가진 100mm 페트리 접시를 준비하고 닦지 단계까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 직선 가위 P8 마우스 및 70 % 에탄올로 피부를 소독 - P6을 참살. </li><li> 다시 피부에 절개를하고 완전히 뒷다리 - 사지 근육을 노출, 제거 될 때까지 뒷다리쪽으로 부드럽게 잡아 당깁니다. </li><li> 근육을 손상시키지 않고 지방 조직을 제거하는 집게를 사용합니다. </li><li> 지느러미 뒷다리 - 사지 근육을 제거하려면 뻗어 사지를 유지하고 발 뒤꿈치 힘줄을 노출하는 발을 구부. 부드럽게 슬라이딩 위쪽으로 절단하여, 힘줄에서 시작, 뼈에서 별도의 근육에 곡선 가위를 사용합니다. 근육을 절제하고 아이스 DPBS에 배치합니다. </li><li> 좋은 팁 집게로 근육을 곤란 및 대퇴골 또는 무릎 관절에 손상을주지 않고 주위 절단하여 대퇴사 두근을 분리합니다.</li><li> 모든 동물을 해부 한 후, 다음의 모든 단계를 수행해야 멸균 층류 세포 배양 후드를 진행합니다. </li></ol> 2. 근육 모세포 분리 <ol><li> DPBS의 초과를 제거합니다. 일정한 질량을 얻기 위해서는 멸균 곡선 위 조직을 말하다. </li><li> 소화 혼합물 5 mL를 이용하여 50 ㎖의 원추형 원심 분리 튜브에 다진 조직을 수집하고 90 분 동안 37 ℃에서 교반하여 배양한다. </li><li> 나머지 조직을 펠렛 (75) XG에서 해부 매체와 원심 분리기 5 분 동안 정지를 6 mL로 추가하여 소화를 중지합니다. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 수집합니다. 조직 파편을 수집하지해야합니다. 5 분 350 XG에 그것을 원심 분리기; 해부 배지 5ml에이를 재현 탁. </li><li> 40 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터. 25 ㎖ 해부 매질에 추가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 (37 ℃, 5 % CO 2 &lt;하는 150mm의 접시를 preplate/ 서브&gt;) 섬유 아세포가 준수 할 수 있도록. </li><li> RT에서 1 시간 동안 차가운 IMDM 100 : 예비 도금 동안 기저막 매트릭스 500 μL 코트 접시 1 희석. DPBS로 한번 세척하고 즉시 세포를 플레이트 (2.8 단계) 또는 도금까지 성장 매체로 둡니다. </li><li> 예비 도금 후, 상등액을 수집하고 10 분 동안 350 × g으로 원심 분리하여 그것을. </li><li> 성장 배지에 재현 탁하고을 혈구 세포의 수를 계산. 15 만 내지 25 만 세포가 기저막 매트릭스 코팅 접시 당 도금되도록 볼륨을 조절합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 유지한다. </li></ol> 3. 근섬유의 차별화 참고 : 3 일 후, 세포가 약 70 %의 컨 플루 (그림 1B)에서 퓨즈 및 양식 myotubes로 시작해야합니다. <ol><li> 원하는 경우,이 시점에서, 또는 관심의 siRNA와 DNA, 세포를 형질. 세포를 형질 전환 할 수없는 경우, 분화 배지로 직접 변경 스키p는 3.4로 진행한다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 형질 전환 시약과 형질. siRNA의 지질 복합체 5 시간 동안 세포 (시약 20 nM의 + 1 μL) 또는 DNA 지질 복합체 (1 μg의 시약 + 1 μL)을 품어. 필요한 경우의 siRNA 및 DNA 농도를 최적화합니다. </li><li> 차별화 매체로 한 번에 세척 한 후 새로운 차별화 매체로 전환합니다. </li><li> 다음 날, 기저막 매트릭스 1을 희석 : 2 얼음처럼 차가운 차별화 매체에. 기존 매체를 제거하고 각 접시에 얼음처럼 차가운 행렬의 200 μL를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 인큐베이터에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 아 그린과 차별화 매체 (100 NG / ㎖)을 보충 조심스럽게 셀에 2 mL를 넣어. </li><li> 조심스럽게 항상 100 NG / μL의 최종 농도 아 그린과 보완, 매체의 반마다 2 일을 변경합니다. </li><li> 세포 분화 및 생존 능력을 모니터링합니다. 이러한 FBS와 C 등의 요인 (다양한에 따라전체 성숙 (그림 2)에 도달하는 10 분화 D - hicken는 배아 추출물 기원), 세포는 5 ~ 걸릴 수 있습니다. </li></ol> 유리 바닥 요리 4. 면역 염색 <ol><li> 면역 염색에 대한 관심의 시간 지점에서, 10 분 동안 실온에서 4 % PFA로를 DPBS로 한 번 세포를 씻어 수정합니다. </li><li> DPBS로 두 번을 씻으십시오. 이 시점에서, 세포를 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> RT에서 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100을 Permeabilize 하시려면. </li><li> PBS로 두 번을 씻고 RT에서 30 분 동안 차단 솔루션으로 차단합니다. </li><li> 솔루션 O / N 4 ℃에서 차단에 희석 차 항체를 품어. </li><li> 실온에서 5 분간 DPBS 씻을 배. </li><li> 이차 항체와 실온에서 1 시간 동안 DAPI의 0.2 μg의 / mL로 그들을 품어. </li><li> 실온에서 5 분간 DPBS 씻을 배. </li><li> 설치 매체의 200 μL를 추가하고 이미지로 이동합니다. </li></ol>

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	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. 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저자는 공개 아무것도 없어.

기본 아세포의 배양이 프로토콜의 사용은 크게 근섬유의 개발을 육성 특별한 틈새가 발생한다. 이것은 매우 적은 수에 존재하는 다른 유형의 세포에 부분적으로 기인한다. 근원 세포 농도와 문화의 순도 사이의 균형을 달성해야합니다. 좋은 세포 배양 물은 배지 조성물에 사용되는 제품의 품질에 의존한다. 동물의 소스에서 파생 된 모든 제품은 철저하게 테스트해야합니다. 우리의 경험에 의하면, 소화 상태도 모니터링해야합니다. 차 문화에 대한 평소와 같이, 실험적인 변화는 고립 된 섬유 또는 불후의 근육 아세포와 연구에 비해 높을 수있다. 이 변화는 매체 및 소화 구성 요소, 마우스의 나이와 크기 및 문화 조작 및 결과 수집에 대한 시점의 표준화에 의해 감소 ​​될 수있다. 그럼에도 불구하고, 복잡한 메커니즘 실시간 면밀히 장점근섬유 개발에 필요한 크게 변동의 단점을 능가한다. 이 프로토콜은 세포 분화를 손상시키지 않고 생체 외 접근법의 이점을 부여한다. 화음이 형성되고 수축 칼슘 스파크에 결합 될 때까지 근섬유 성숙. 이 기능 출력은 다른 실험 조건에 액세스 할 수 있습니다. 또한, 상기 프로토콜에 대한 다양한 기술 변형이있을 수있다. 근육 아세포는 근육 발달에 관한 관심의 돌연변이와 신생아 생쥐에서 수확 할 수 있습니다. 세포 분화 다른 시점에서의 생화학 적 분석에 용해 될 수있다. 칼슘 지표의 역학을 수행하는 문화에 추가 할 수 있습니다. Optogenetic 구조는 특정 신호 전달 경로를 적용하거나 특정 지역 응답을 유도하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 근섬유가 상호 작용을 연구하는 다른 세포 유형과 함께 공동 배양 될 수있다.

골격근은 몸무게 1 40 %를 구성한다. 근육 관련 질환은 엄청난 건강과 경제적 부담이를 나타냅니다. 이 매우 복잡하고 조직화 된 조직이 형성 유지 및 재생하는 방법을 광범위하고 잘 확립 된 연구 분야를 구성한다. 6 - 특정 과학적인 관심에 따라 가장 적합한 방법은 생체 내 모델 3 복잡한 간단한 myotube 문화에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 실시간 영상 및 면역을 통한 근육 생성을 모니터링 할 수있는 시험 관내 시스템을 제공하는 것이다. 전통적인 접근 방법에 비해,이 시스템은 마우스 근육 조직 과정에 매우 완전한 동적 통찰력을 제공한다. 세포 횡단 화음 및 주변 핵 (7)를 표시하는 성숙한, 다핵 근섬유에 근원 세포 단계에서 따라 할 수 있습니다. 이 성숙 수준 수복잡한 자극 또는 기계 장치를 필요로하지 않고, 보통 세포 배양 장치를 이용하여 달성 될 수있다. 체외 시스템에 약간의 성공은 8,9를보고되었지만, 우리의 지식, 이것은 횡 근질 그물 자리 (SR)와 결합 T-tubules와 성숙 마우스 근섬유를 생성하는 유일한 프로토콜입니다. 따라서,이 시험 관내 시스템은 여전히 좋지 10 이해 트라이어드 형성의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 본 시스템의 또 다른 장점은 항체, 약물, 및 RNAi의 도구로서 유효 마우스 타겟 자원의 가용성이다. 비교적 간단한 프로토콜은 힘든 단계, 고도로 숙련 된 조작, 또는 고가의 전용 장비를 필요로하지 않습니다. 성숙 근섬유는 칼슘 스파크 (게시되지 않은 데이터)과 함께 수축력을 표시, 문화의 분화 (7)의 5 D 후 나타나는 시작합니다. 일주에서, 다른 개발포유 동물 신체에서 가장 복잡한 셀들 중 하나의 스테이지 등은 시험 관내 분석의 다양한 조합으로 연구 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase&amp;nbsp;type V</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>C9263</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Glutamax supplemented</td><td>Gibco</td><td>31980022</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth reduced factor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be &amp;lt;1.5</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>MP biomedical</td><td>2850145</td><td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td></tr><tr><td>Recombinant rat agrin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>550-AG-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>11581831</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>used to transfect siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX</td><td>Invitrogen</td><td>15338-100</td><td>used to transfect DNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668030</td><td>used to transfect siRNA plus DNA</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td><td>Science Services GmbH</td><td>E15710</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use at 200 ng/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions and Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Mix</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 5 mg/mL collagenase&lt;br/&gt; 3.5 mg/mL dispase&lt;br/&gt; sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dissection Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 10% FBS&lt;br/&gt; 1% Penicillin/Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Growth Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 20% FBS&lt;br/&gt; 1% Chicken Embryo Extract&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Differentiation Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 2% Horse Serum&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 10% Goat Serum&lt;br/&gt; 5% BSA&lt;br/&gt; add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

골격 근육은 근섬유 가장 큰 포유 동물의 체내에서 세포와 몇 syncytia의 한 구성된다. 어떻게 그것을 구성하는 복잡하고 진화 적으로 보존 된 구조를 조립하는 조사를 받고 남아있다. 크기와 생리 학적 기능은 종종 조작 및 이미징 응용 프로그램을 제한. 불멸화 세포주의 배양에 널리 사용되지만, 단지 분화의 초기 단계를 복제 할 수있다. 여기, 우리는 기본 마우스 근육 아세포에서 발생하는 근섬유의 쉬운 유전자 조작을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 차별화 일주일 후, 근섬유가 수축 정렬 근섬유 분절과 화음뿐만 아니라 주변 핵을 표시합니다. 전체 분화 과정은 라이브 영상이나 면역 형광 다음에 할 수 있습니다. 이 시스템은 기존의 생체 외 및 생체 외 프로토콜의 이점을 결합한다. 쉽고 효율적인 형질 전환의 가능성뿐만 아니라,모든 분화 단계에 대한 접근의 용이성 응용 가능성을 넓게. 근섬유이어서 관련 발생 및 세포 생물학 문제를 해결할뿐만 아니라, 임상 적 적용을위한 근육 질환 표현형을 재현 할뿐만 아니라, 사용될 수있다.

근섬유 개발의 범위는 주로 절연 아세포의 순도 및 생존 능력에 의해 결정된다. 접착 증식 및 융합 용량 경험적 이러한 파라미터들 (도 1 A, B)에 액세스하기 위해 사용될 수있다. 확산 D2에서 근육 아세포가 준수해야하고 전형적인 방추형 모양을 표시해야합니다. 확산은 자연 myotube 형성 다음날 (그림 1B)로 이어지는,이 단계에서 광범위하게 일어날 것으로 예상된다. 셀 컨 플루는 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 근육 아세포 증식 및 퓨즈 이상 3 일이 걸릴 경우가 증가한다. 근섬유가 그들의 밀도로 성장하고 상대적으로 직선 신장 할 수 없습니다 경우이 감소한다. 가장 근섬유가 외측 영역으로 볼 수 있도록한다 포화 상태는 전형적으로 접시의 외주의 중심에서 감소된다. Myotubes 빠르게 신장 디스플레이 여러 중앙 정렬 핵 (도 1C을)한다. D5으로 일부 세포는 줄무늬를 획득하고 주변에 자신의 핵을 움직이기 시작. 성숙 특성 근섬유의 수는 시간뿐만 아니라, 셀 두께 (도 1D)으로 증가한다. 분화의 정도는 상기 면역 형광에 의해 관찰 될 수있다. 차별화 D8 본 횡단 화음에 고정 근섬유. 이것은 화음 (그림 2)에서 colocalize 것으로 예상되는 T-세관 (DPHR) 및 SR (triadin)의 이미징 구성 요소에서 확인할 수있다. 근섬유의 기능은 실제 촬상에 의해 해결 될 수있다. 이후 차별화 D3에서, 세포는 자연 경련을 표시합니다. 칼슘 센서 형질 저자 (예를 들어., GCaMP6f 11)는 수축 칼슘 피크 (도 3)에 결합되는 것을 관찰 할 수있다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 따라서 혁신적인 분자 요법 7의 신규 표적이 될 수 centronuclear의 근육 병증 및 근긴장 성 이영양증에서 파쇄 된 신규 분자 경로를 식별 할 수 있었다. 우리는 또한 신경 근육 접합부 (NMJ) 12의 개발을 연구하는이 방법을 적용하고있다. 쥐의 척수 절편와 공 배양을 통해, 우리는 NMJ 형성 13 네인의 역할을 설명했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> 그림 1 : 근육 모세포 문화의 발달 단계. A) 확산 D2에서, 근육 아세포가 부착 및 증식하기 시작했습니다. prolif에서 B)eration D3 60의 생장 - 80 %에 도달 한 아세포 자발적으로 융합 시작한다. 차별화 D3에서 C)는, 중앙에 위치한 핵을 포함 myotubes이 지배적이다. 이후 차별화 D5에서 D)는 (예를 들어, 하루 8), 근섬유는 줄무늬와 주변 핵을 전시 시작하고 두껍게하기 시작합니다. 스케일 바 : 50 μm의. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> 그림 2 : D8 근섬유 발현 사이의 대표 공 촛점 이미지. A) 하이드로 피리딘 수용체 (DHPR, 상단 패널)에 대한 면역 염색과 (TRDN, 중간 패널) triadin. DHPR, TRDN 및 DAPI 채널의 오버레이는 트라이어드 구성 요소의 colocalization을 보여줍니다. B)<html> A.의 C에 그려진 노란 선) α-티닌 (녹색) 및 DAPI (파란색)에 대한 스테인드 근섬유의 볼륨 렌더링의 3D 이미지의 강도 프로파일. 스케일 바, 그리드 폭 : 5 μm의. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> 그림 3 : 자발적인 경련과 근섬유의 칼슘 수준의 라이브 영상. 꿈틀 근섬유의 칼슘 스파크의) 고속 시간 경과 (20 밀리 프레임) 현미경. 칼슘은 GCaMP6f의 발현 (Addgene 플라스미드 # 40755)를 통해 검출되었다. 패널 A. 칼슘 센서 시간에 따른 형광 세기의 B) 정량&quot;_blank&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

라이브 영상에 대한 성숙한 근섬유의 체외 분화

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K 조회수.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

비디오: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

유전학

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

생물학

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

의학

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

광학 기반 시스템을 사용한 하이드로겔 내장 온전한 마우스 근육 섬유의 고처리량 수축 측정

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...