Name: a tandem liquid chromatography–mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
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이 작품은 독립 수상에 NIH 통로 (GM 099,893을 부여) 교수 시작 기금 SRB에,뿐만 아니라 연구 프로젝트 그랜트 (GM 042219 부여)에 의해 부분적으로 투자되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 해석, 또는 출판을 위해 작업을 제출하기로 결정에서 아무런 역할이 없었다.

버퍼 솔루션 1. 준비 <ol><li> 인산 완충 식염수 준비, 초순수로 1 배의 최종 농도로 10 배 PBS의 원액을 희석하여 (PBS pH를 7.4) (증류수 및 탈) 물. </li><li> 아세토 니트릴 2 ㎖, 메탄올 2 ㎖, 초순수 H 2 O 1 ㎖, 포름산 19 μL (0.1 mM의 최종 농도)을 조합하여 켄칭 용액을 준비한다. </li><li> LC-MS 초순수에 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 용매를 준비한다. </li><li> 아세토 니트릴, 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 LC-MS를 용제 B를 준비한다. 참고 : 모든 솔루션은 최고 순도의 시약을 사용할 수 (일반적으로 고성능 액체 크로마토 그래피 등급)로 작성한다. 솔루션은 각 실험 전에 신선 준비하고 사용하기 전에 얼음에 보관해야합니다. </li></ol> 정상 상태 S. 구균 성장 2. 설립 <ol><li> 행진 S.의 aureu냉동 글리세롤로부터 트립신 콩 한천 (TSA)에서 격리에 대한 관심의 변종. 16-24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 트립 틱 소이 브로스 (TSB) 각 균주의 단일 콜로니로 멸균 유리 배양 관의 다른 적합한 배지 4 mL로 접종한다. 경사 부화 (~ 70 ° 각도) 16-20 시간 동안 37 ° C에서 분 (RPM) 당 60 회전으로 회전. 주 : 세포 생리학에 영향을 미치는 단계 2.2에 기재된 것과 비롯한 표준 방법을 사용하여 하룻밤 배양시 산소 구배 쉽다. 따라서, 우리는 (참조 단계 2.4-3.2, 아래) 생물학적 정상 상태를 보장하기 위해 여러 백 희석 전략을 채택하고있다. </li><li> 600 나노 미터 (OD 600)의 단계 2.2에서 배양 물의 광학 밀도를 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 광학 기준 (공백)로 멸균 배지를 사용한다. 멸균 TSB 배지 0.05 50 용액의 OD 600에 이들 세포를 희석 별도의 250 ML 드롱 (37 ° C로 미리 예열). </li><li> 인큐BATE 280 rpm에서 진탕 수조에서 37 ℃에서 배양. </li><li> 30 분마다 600 개 OD 측정을; 광학 밀도가 증가함에 따라, 그들이 분광 광도계 흡광도의 선형 범위 내에 유지되도록 TSB와 배양액을 희석 할 필요가있다. </li><li> 단계 2.5에서 배양 ~ 0.8-1.0의 OD (600)를 획득하면, 0.01 ~ 0.05의 OD 600에 37 ° C TSB 50 ㎖로 계대를 반복 2.4 2.5 단계. </li></ol> 3. 시료 채취 설치 <ol><li> 적절한 용기에 분쇄 된 드라이 아이스의 침대를 준비 (예를 들어, 유리 접시, 얼음 통, 또는 냉각기). </li><li> 배양액의 광 밀도 수확 원하는 지점에 접근, ≥5 분간 미처리 35mm 페트리 접시 드라이 아이스에 미리 냉각 용액을 1 mL의 담금질을 추가한다. 참고 : &quot;원하는 수확 포인트는&quot;실험 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 m를 조사했다etabolites 호기성 성장시에,이 상태의 주요 지표 아세테이트 배설 후 지수 성장기 (32, 33) 중 아세트산 다시 동화를 포함한다. 일반적으로,이 시점은 특정 성장 단계 (예를 들어, 지수 위상) 내에 있어야한다. 이 스테이지와 연관된 특정 OD 600의 값이 상이한 균주 및 성장 배지 사이에서 변할 수있다. </li><li> 고무 마개 (-20 ℃로 예비 냉각)을 스테인리스 필터 프릿을 배치하고 하우스 진공 또는 진공 펌프에 연결된 진공 플라스크 위에 배치. </li><li> 진공을 적용하고 상부에 혼합 된 셀룰로오스 에스테르 막 (0.22 ㎛의 공극 크기)을 배치했다. 주 : 상기 유리 재와 동등한 직경의 필터를 사용하고 적절하게 시료가 필터를 통과하기보다는 가장자리 위로 인출되도록이 필터를 중앙에 중요하다. 빙냉 멸균 H와 막의 습윤 2 O 도움멤브레인 포지셔닝. </li></ol> 4. 샘플 수확 <ol><li> OD 600 ~ 0.4-0.5에서 배양 플라스크에서 13 mL로 제거하는 혈청 피펫을 사용하여 필터에 시료를 적용. </li><li> 전체 샘플을 여과 한 후, 즉시 중간 관련된 대사 물질을 씻어 빙냉 PBS의 ≥5 ml로 필터를 세척 하였다. </li><li> 진공을 해제하고 프릿에서 필터를 제거하기 위해 무균 핀셋을 사용한다. 미리 냉각 된 용액으로 급랭 필터 (셀 측 아래) 전환. 액체가 신진 대사 활동을 체포, 세포의 급냉을 보장하기 위해 제거 된 즉시 (초, 즉) 신속 위의 단계를 수행하는 것이 중요하다 : 참고. </li><li> ≥20 분 동안 드라이 아이스에 종결 용액에 필터를 품어. </li><li> 페트리 접시 필터 (셀 측까지)를 반전 및 t 떨어져 세포를 헹구어 마이크로 피펫을 사용하여 무균 핀셋을 사용하여그는 종결 용액에 막. </li><li> 및 켄치 용액에 세포를 부유 한 후 다시 0.1 mm 실리카 비드 ~ 100 μL를 함유하는 멸균 2ml의 충격 내성 튜브에 세포 현탁액을 전송. 드라이 아이스 또는 -80 ° C에서이 보관하십시오. </li></ol> 5. 대사 추출 <ol><li> 젖은 얼음에 녹여 샘플 사이클 사이의 드라이 아이스 냉각 2 분주기와, 6000 rpm으로 30 초 네 버스트와 균질의 세포 파괴. </li><li> 최대 속도로 미리 냉장 · 냉동의 microcentrifuge에서 15 분 동안 용 해물을 명확하게 (즉, ≤4 ℃에서 18,213 XG). </li><li> 깨끗한 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 6 단계에서 잔류 펩티드 함량의 정량 마이크로 원심 튜브에 시료의 작은 부분을 전송; -80 ° C에서 나머지를 저장합니다. 주 : 예비 샘플의 부피는 단계 6.1에서 사용 된 BCA 분석에 따라 달라진다. 이샘플은 즉시 분석을 위해 젖은 얼음에 저장 또는 -80 ° C에서 냉동해야합니다. </li></ol> 6. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석법 <ol><li> 각 샘플에 대한 잔류 펩타이드 농도를 결정하는 단계 5.4의 샘플을 이용하여, 키트 제조업체의 지침대로 BCA 분석을 수행한다. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> LC-MS, 용매 B 75 μL 75 μL S. 아우 레 우스의 추출물, 단계 1.4에서 제조 섞는다. </li><li> 소용돌이는 5 분 동안 13,000 XG에서 혼합 스핀합니다. </li><li> 액체 크로마토 그래피 (LC) 바이알로 상등액 100 μL를 배치하고 캡. 공기 방울이 샘플에 갇혀 있지 않은지 확인합니다. </li><li> LC-MS의 자동 시료 주입기에 액정 유리 병을로드하고 소프트웨어의 실행 목록을 편집 &quot;오프라인 작업리스트 편집기.&quot; <ol><li> &quot;샘플 이름&quot;을 작성합니다 (예를 들어, 야생형-1), &quot;샘플 위치&quot;(예를 들어, P1-A1), &quot;방법&quot;(예를 들어, 개미CID-부정적인 방법) 및 &quot;데이터 파일&quot;(예를 들어, 야생형-1) 열입니다. 버튼 &quot;저장 작업리스트&quot;버튼을 클릭합니다. 은 &quot;질량 분석 데이터 수집 워크 스테이션&quot;소프트웨어 및 입력 이전에 저장된 작업 목록을 엽니 다. 연속 LC-MS 측정을 시작하려면 &quot;시작 작업 목록 실행&quot;버튼을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 액정 시스템과 TOF 분석기를, 컬럼에 샘플을 분리 비행 (TOF) 분광계의 시간에 열을 연결, 커플. 다음 이동상 구배를 사용하여 0~2 분간, 85 % 용매 B 단계; 3-5 분, 80 % 용매 B; 6-7 분, 75 % 용매 B; 8-9 분, 70 % 용매 B; 10-11.1 분 50 % 용매 B; 11.1-14 분, 20 % 용매 B; 14.1-24 분 및 5 % 용매 B; 85 % 용매 B로 10 분간 재 평형 기간 및 0.4 mL의 최소-1의 유속으로 끝난다. </li><li> 등용 매 펌프를 사용하여, 동시에 대량 축 교정하도록 실행와 레퍼런스 질량 용액을 주입. 참고 :이 단계표준 TOF 분석기 설명서를 기반으로합니다. <ol><li> 아세트산 D4 및 헥사 키스 (1H, 1H, 3H-테트라 플루오) 레퍼런스 질량 용액으로서 포스 파진의 실시간 보정을 수행 혼합물을 사용한다. 2.5 mL의 최소의 유량과 등용 펌프 -1 주입 대를 사용한다. </li></ol></li></ol> 이온 카운트 8. 일괄 수정 <ol><li> (1 복제, 예를 들어, 야생형) 일괄 보정 기준 시료로 제공하는 임의의 샘플을 나타낸다. </li><li> 기준 샘플 내의 모든 대사에 대한 이온 개수의 합을 계산한다. 모든 샘플이 계산을 반복합니다. </li><li> 비율을 생성하기 위해 참조 샘플의 총 이온 카운트하여 각 샘플의 총 이온 수를 나눈다. </li><li> 각 대사 물에 대한 일괄 이온 보정 계수를 획득하기 위해 상기 샘플 / 기준 비율에 의해 시료 내의 각 대사 물질에 대한 이온의 수를 나눈다. </li></ol> 9. 펩타이드 정규화 <ol><li> 디각 대사 물에 대해 정규화 된 값을 생성하는 단계 6에서 BCA 분석으로 결정된 펩티드 농도 8 단계에서 얻어진 각 시료에 대하여 일괄 보정 이온 카운트 값 ivide. 주의 : 단계 9.1에서 얻어진 각 대사 물질의 정규화 일괄 배치 이온 보정 계수를 직접 변형을 비교 및 통계 분석 (-test 예, 맨 - 휘트니 U)을 실시 할 수있다. 대안 적으로, 공지의 대사는 변경하거나 치료 또는 유전 적 배경에 의해 분해 대사 물질 인한 변화를 검출하기 위해 정규화로서 사용될 수있다한다. 추출 완충액 L - 발린 또는 gluraric 산 기지 량의 포함은 시료 처리 (34) 중에 손실을 보정하기 위해 사용될 수있다. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

모든 작은 분자 대사는 중앙 대사 경로에서 공통의 기원을 통해 서로 연결되어있다. 기하 급수적으로 성장하는 동안 박테리아 세포는 특정 조건 하에서 생리 상태의 스냅 샷을 제공하는 생물학적 대사 안정 상태에있다. 코디 ILV와 GTP에 응답하여 영양 자족을 모니터링합니다. ILV 및 GTP 풀 강하 같이, 코디 활성 가능성 점진적 영양분 고갈 (30)의 증가에 적응하는 그것의 표적 유전?...

세균성 병원체는 호스트 환경에서 많은 도전에 맞설해야합니다. 면역 세포에 의한 직접 공격뿐만 아니라, 호스트는 세균의 생존과 복제, 생성 영양 면역 1, 2 필수 영양소를 담즙산이. 이러한 적대적 환경에서 살아 남기 위해, 세균성 병원균은 병원성 인자를 배포합니다. 이러한 요소 중 일부는 박테리아가 면역 반응을 회피 할 수 있도록; 다른 인자는 조직 유래 성분 3, 4, 5를 소비하여 누락 된 영양소를 보충 할 수 있도록 세균 등 히알루, thermonuclease, 리파제 등의 소화 효소를 분비를 포함한다. 실제로, 병원성 세균, 6 인자 (7)의 생산 세포의 생리 학적 상태를 묶어 규제 시스템 진화, <s<html> 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8, 9, 10까지. 증거의 성장 몸은 신진 대사 및 독성을 연결하는 중요한 레귤레이터로 코디를 가리 킵니다. 먼저 디 펩티드 퍼 미아 제 (DPP) 유전자 (11)의 리프레로서 고초균에서 발견되지만, 코디는 현재 거의 모든 낮은 G + C 그램 양성 세균 (12, 13)에 의해 생성되는 것으로 알려져 및 조절되는 탄소가 관여하는 유전자 수십 질소 대사 14, 15, 16, 17, 18, 19. 병원성 종에서, 코디는 가장 중요한 독성 유전자 (20), (21)의 일부의 발현을 제어하고,. EF &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 코디 리간드의 두 개의 클래스에 의해 DNA 결합 단백질로 활성화되어 분지 쇄 아미노산 (BCAA를, 이소류신, 류신 및 발린 [ILV])과 GTP 전사 이러한 영양소가 풍부하면., 코디 억압 (또는 어떤 경우에, 자극). 이러한 영양소가 제한 될 때, 코디 활동이 점차 감소되고, - 경로를 다시하는 것은 중앙 대사에 연결된 다양한 대사 경로를 통해 전구체하는 경사 전사 반응을 초래 28, 29, 30. 질량 분석기 (LC-MS)에 결합 된 액체 크로마토 그래피 탠덤 정확하게 저분자 세포 대사 (31)를 식별하고 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. transc와 결합 할 때riptome 분석 (예, RNA-SEQ)는이 분석 워크 플로우 환경이나 영양 스트레스에 반응하여 발생하는 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기서는 LC-MS를 통해 포도상 구균 세포 및 후속 분석 대사 추출을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 S. aureus에 생리학 코디의다면 발현 성 효과를 보여주기 위해 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material/Equipment&lt;sup&gt;a&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Culture Flask (250 mL)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>Sidearm Flask, 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>3-hole Rubber Stopper, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Filter holder/frit</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Not tissue culture treated</td></tr><tr><td>Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &amp;mu;m pore size</td><td>Millipore</td><td>GSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Impact-resistant tubes, 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>Silica Beads, 0.1 mm</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homogenizer</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Cogent Diamond hydride type C column</td><td>Agilent</td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td><td>Agilent</td><td>G6230B</td><td></td></tr><tr><td>Quat Pump, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G4204A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bin Pump, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G4220A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Valve Drive, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1107A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isocratic Pump, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1310B&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1316C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sampler, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G4226A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1330B&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemical&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, Granulated</td><td>Becton Dickinson</td><td>214530</td><td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Dilute fresh to 1x with ultra-pure water</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-500</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Optima LC-MS; toxic</td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318</td><td>For mass spectrometry, 98%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strain&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Species&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Strain&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Genotype&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>wild type</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>&amp;Delta;codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;sup&gt;a&lt;/sup&gt;Chemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td></tr></tbody></table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

세균성 병원균을 저지하기위한 노력의 일환으로, 호스트는 종종 감염의 사이트에있는 영양소의 이용을 제한 할 수 있습니다. 이 제한은 규제 요인은 세포의 신진 대사를 조절, 대응되는 키 대사의 존재비를 변경할 수 있습니다. 최근에는 단백질과 RNA의 숫자가 독성 유전자 발현의 중요한 규제로 등장했다. 예를 들어, 코디 단백질 분지 쇄 아미노산 및 GTP의 레벨에 응답하고 널리 낮은 G + C 그램 양성 세균에 보존된다. 황색 포도상 구균의 글로벌 레귤레이터로서, 코디 독성 대사 유전자 수십개의 표현을 제어한다. 우리는 황색 포도상 구균이 코디가 부분적으로 잠재적 호스트 환경에서 발생하는 영양소 제한 조건에 적응하기위한 노력의 일환으로 자사의 대사 상태를 변경하는 데 사용하는 가설을 세웠다. 이 논문은 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토 그래피를 이용하여 S. 구균에서 대사를 추출하여 분석하는 방법을 설명trometry,이 가설을 테스트하기 위해 개발 된 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 연속 chemostat 문화를 사용하지 않고 생물학적 정상 상태와 일정한 통기를 유지하는 등 엄격하고 재현성을 보장 모범 사례를 강조한다. USA200의 메티 실린 감수성 황색 포도상 구균에 대한 상대 UAMS -1- 모 균주를 분리은 동질 코디 돌연변이 아스파 테이트 (예를 들어, 트레오닌과 이소류신) 유래의 아미노산의 현저한 증가를 나타내 및 (그 전구체 감소 예, 아스파라긴산 및 O의 -acetylhomoserine ). 이러한 결과는 RNA-서열 분석으로 얻어진 전사 데이터와 상관 관계가 다음 코디 널 돌연변이의 10 및 800 배 사이의 상향 조절이 경로의 유전자가 있었다. 사체와 대사 체의 글로벌 분석을 커플 링하는 것은 환경이나 영양 스트레스에 직면했을 때 박테리아가 PHY를에 잠재적 인 통찰력을 제공하고, 신진 대사를 변경하는 방법을 밝힐 수영양 결핍과 관련된 iological 변화는 감염 동안 경험했다. 이러한 발견은 새로운 항 감염 제 및 치료제의 개발을위한 방법을 포장 할 수있다.

우리는 풍부하고 복잡한 배지에서 체외 성장 동안 S. 구균 세포 내 대사 풀을 분석 하였다. 원리 증명 된 바와 같이, 우리는 비교 메티 실린 감수성 S. 구균 골수염 간 대사 프로파일 UAMS -1- (야생형 [WT]) 및 글로벌 전사 조절 코디 (Δ 코디) (26)가없는 동종의 균주를 분리. 프로토콜의 단계 2에 기술 된 바와 같이 정상 상태에서, WT ?...

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K 조회수.  Georgetown University.  여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다. 

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

연구

화학

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

생화학

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석 분석을 위한 시아노박테리아에서 비단백질 아미노산 추출

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the cell&#39;s survival requirements. Alternatively, carrying out DBTL cycles in cell-free environments can accelerate this process and alleviate concerns with host compatibility. A promising approach to cell-free metabolic engineering (CFME) leverages metabolically active crude cell extracts as platforms for biomanufacturing and for rapidly discovering and prototyping modified proteins and pathways. Realizing these capabilities and optimizing CFME performance requires methods to characterize the metabolome of lysate-based cell-free platforms. That is, analytical tools are necessary for monitoring improvements in targeted metabolite conversions and in elucidating alterations to metabolite flux when manipulating lysate metabolism. Here, metabolite analyses using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with either optical or mass spectrometric detection were applied to characterize metabolite production and flux in E. coli S30 lysates. Specifically, this report describes the preparation of samples from CFME lysates for HPLC analyses using refractive index detection (RID) to quantify the generation of central metabolic intermediates and by-products in the conversion of low-cost substrates (i.e., glucose) to various high-value products. The analysis of metabolite conversion in CFME reactions fed with 13C-labeled glucose through reversed-phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (MS/MS), a powerful tool for characterizing specific metabolite yields and lysate metabolic flux from starting materials, is also presented. Altogether, applying these analytical methods to CFME lysate metabolism enables the advancement of these systems as alternative platforms for executing faster or novel metabolic engineering tasks.

The protocols describe high-performance liquid chromatography methods coupled to refractive index or mass spectrometric detection for studying metabolic reactions in complex lysate-based cell-free systems.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

생체공학

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

생물학

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

캡처 복합 질량 분석 - 소설의 C 디 GMP 이펙터 단백질을 식별 할 수있는 강력한 도구

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

High-throughput and Deep-proteome Profiling by 16-plex Tandem Mass Tag Labeling Coupled with Two-dimensional Chromatography and Mass Spectrometry

Isobaric tandem mass tag (TMT) labeling is widely used in proteomics because of its high multiplexing capacity and deep proteome coverage. Recently, an expanded 16-plex TMT method has been introduced, which further increases the throughput of proteomic studies. In this manuscript, we present an optimized protocol for 16-plex TMT-based deep-proteome profiling, including protein sample preparation, enzymatic digestion, TMT labeling reaction, two-dimensional reverse-phase liquid chromatography (LC/LC) fractionation, tandem mass spectrometry (MS/MS), and computational data processing. The crucial quality control steps and improvements in the process specific for the 16-plex TMT analysis are highlighted. This multiplexed process offers a powerful tool for profiling a variety of complex samples such as cells, tissues, and clinical specimens. More than 10,000 proteins and posttranslational modifications such as phosphorylation, methylation, acetylation, and ubiquitination in highly complex biological samples from up to 16 different samples can be quantified in a single experiment, providing a potent tool for basic and clinical research.

Presented here is an optimized high-throughput protocol developed with 16-plex tandem mass tag reagents, enabling quantitative proteome profiling of biological samples. Extensive basic pH fractionation and high-resolution LC-MS/MS mitigate ratio compression and provide deep proteome coverage.

Isobaric tandem mass tag (TMT) labeling is widely used in proteomics because of its high multiplexing capacity and deep proteome coverage. Recently, an ...

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근

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