This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. 세포 배양 및 형질 <ol><li> 성장 미디어에서 마우스 신경 모세포종의 2A (N2A) 세포를 유지한다. <ol><li> 높은 혈당 200 ml의 둘 베코의 이글 배지 (DMEM)에서 500 ml의 N2A 성장 미디어를 확인, 250 ml의 혈청 미디어, 50 ml의 소 태아 혈청 (FBS)를 감소, 5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 배). </li><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 T75 플라스크에 세포를 유지한다. </li><li> 분할 세포 1시 15분 필요한 경우, 또는 약 80~90%의 포화 상태. 이것은 일반적으로 2 ~ 3 회입니다. </li></ol></li><li> 코트 35mm 유리 폴리 D 라이신과 바닥 접시. <ol><li> 층류 바이오 안전성 캐비닛에 멸균 35mm 요리의 유리 바닥 지역에 0.1 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 DDH으로 2 O 3 ~ 4 회 접시를 씻어. </li><li> 이상 1 시간 동안 요리에 완전히 건조 할 수 있습니다. </li><li> Steril필요한 경우 바이오 안전성 캐비닛에 UV 광을 사용하여 요리를이지는. </li></ol></li><li> TIRFM 이미징 N2A 세포를 플레이트. <ol><li> 부착 세포에서 성장 미디어를 제거합니다. </li><li> 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 5 분 동안 1 ㎖의 1X 트립신 (+ EDTA)로 배양하여 플라스크로부터 세포를 분리. </li><li> 9 ml의 성장 배지를 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. 피펫을 사용하여 미디어, 트립신 및 분리 된 세포를 섞는다. </li><li> 시각적으로 혈구를 사용하여 세포 수를 계산하고 각 폴리 D 라이신 코팅 유리 바닥 접시에 90,000 세포를 추가 할 수있는 올바른 볼륨을 계산합니다. 이 밀도는 효율적인 형질 전환 및 단일 세포 TIRF 이미징이 필요합니다. </li><li> 90,000 세포를 포함하는 각각의 유리 바닥 접시에 2 ml의 성장 매체를 추가합니다. </li><li> 16 ~ 24 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 접시를 품어. </li></ol></li><li> N2A 형질 전환 <ol><li> 인용의 SEP 형광 물질을 함유하는 플라스미드 구조체를 구하는관심있는 단백질의 세포 외 영역으로. 이러한 PCR 증폭 5 표준 클로닝 기술이 구조를 생성하는데 사용될 수있다. 주 : 소포체 또는 피킹 소체의 루멘 내에 존재하고 세포막의 세포 외 용액에 노출되도록 9월 멤브레인 단백질의 세포 외 영역에 포함되어야한다. GFP와 유사한 클로닝 전략을 사용할 수있다 SEP에서 크기가 유사하다. </li><li> 1.5 ㎖의 혈청 감소 배지 도금 세포상의 성장 배지를 교환 (예하는 Opti-MEM), 약 30 분간 형질 감염 시약을 첨가하기 전에. 주 : 수용체에서 약물 유도 된 변화를 연구하기 위해, 약물의 적절한 농도가 트랜시에 첨가 할 수있다. </li><li> 250 μL로 감소 혈청 미디어 구성 원하는 각 플라스미드의 500 NG를 추가 (튜브 1). </li><li> 별도의 튜브 C로 형질 전환 시약의 2 μl를 추가감소 혈청 미디어의 ontaining 250 μL. 5 분 동안 실온에서 튜브 (2)를 부화. 플라스미드 DNA를 형질 전환 시약의 비율은 관심있는 각각의 단백질을 발현하도록 최적화되어야한다. </li><li> 형질 전환 시약 플라스미드 혼합물 500 μl를 함유 한 용액을 만들 튜브 1과 2를 결합. 25 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 접시 당 2 ML의 총 부피의 500 ㎕를 형질 혼합하는 사전 도금 셀을 추가합니다. </li><li> 24 시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 24 시간 후, 형질 믹스를 제거하고 성장 배지로 세포를 씻어 각 접시에 성장 배지 2 ㎖를 추가합니다. 주 : 약물 트랜시에 첨가하면,이 단계에서 다시 보충 할 수있다. </li><li> 24 시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 이미지 세포 형질 전환 후 48 시간. </li></ol></li></ol> 전체에서 2. 라이브 셀 이미징영원한 반사 형광 현미경 (TIRFM) <ol><li> 이미징 설정 <ol><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 스캐닝 스테이지 반전 형광 현미경 설정하여 촬상을 수행한다. 이것은 488 나노 DPSS 레이저 소스의 정렬을 필요로하는, 스테퍼 모터는 488 nm의 빔 위치 및 높은 개구 수 (NA 1.49) 60X 또는 100X 오일 침지 목적을 조정한다. </li><li> 적절한 여기 필터 (대역 통과 10분의 488 ㎚)를 통해 레이저 빔을 통과한다. 스테퍼 모터에 장착 된 실행 프로그램에 연결된 단일 모드 광섬유를 통해 편광 된 레이저 빔을 맞추고. 표면 형광 모드에서 여기 빔은 대물의 뒤쪽 개구의 중앙을 중심으로한다. </li><li> 임계각에 도달되지 않고 빔이 더 이상 샘플 투과 대신 완전히 유리 CEL 반사까지 TIRF을 달성하기 위해, 대물 렌즈의 후방 개구에 걸쳐 레이저 광을 집광 번역 스텝 모터를 사용리터 인터페이스를 제공합니다. </li><li> 적절한 방출 필터 이미징 소프트웨어 (예 MetaMorph로부터)로 제어되는 EMCCD (512 X 512 픽셀)을 이용하여 캡처 이미지가 배출 통로에 설치 (50분의 525 ㎚). </li></ol></li><li> 이미징 솔루션을 준비 <ol><li> DDH 150 mM의 NaCl을 4 mM의 KCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를 10 mM의 HEPES 및 10 mM의 글루코스를 혼합함으로써 200 ㎖의 세포 외 용액 (ECS)를 준비 2 O. 원액의 NaCl, KCl을,의 MgCl 2, 및 CaCl2를 미리 준비하고, 촬영의 일 신선한 HEPES 포도당과 결합 될 수있다. </li><li> pH 7.4의 100 ml의 ECS를 포함하는 용액의 pH를 조정합니다. 5.4의 pH에 ​​ECS의 나머지 100 ㎖를 조정합니다. ECS 2 ㎖ (PH 7.4)로 형질 감염된 세포를 씻어. </li><li> 촬영하기 전에 형질 감염된 세포에 ECS의 2 ㎖ (산도 7.4)를 추가합니다. </li></ol></li><li> TIRF의 라이브 세포 이미징 <ol><li> includin, 전체 시스템을 켭니다g 488 nm의 레이저, 카메라, 번역 단계, 및 이미징 프로그램입니다. 표면 형광 빔을 초점과 60X 목표에서 약 1 mW의 전원을 조정합니다. </li><li> 목적에 기름을 추가하고 번역 무대에서 형질 감염된 세포의 접시를 배치합니다. 세포가 여러 차례 묘화 할 수 있도록 스테이지에 대하여 이동하지 않도록하는 단계 마운트를 사용하여 제자리에 고정 접시. </li><li> 표면 형광 모드에서, 초점 현미경 및 형광 형질 감염된 세포를 찾아. 세포는 여러 초점면에 걸쳐 초점을 맞춘 상태로 유지됩니다. TIRF를 진행하는 하나의 분리 된 세포를 찾습니다. </li><li> 촬상 프로그램에서 200 밀리 초에 대한 노출 시간을 설정하고, EM 게인을 설정함으로써, 형광 강도를 최적화한다. </li><li> 스텝 모터를 이용하여 단계적으로 대물 걸쳐 광을 변환하여 TIRF에 레이저 빔을 전환. 이 일에 수렴 할 때까지 임계각 방식으로, 상기 빔은 가시적 접시의 가장자리에 걸쳐 번역 할샘플 평면에 총 내부 반사의 전자 점. </li><li> 세포가 초점 노브를 조정하여 TIRF 모드에 있는지 확인합니다. TIRF에서, 셀의 한면은 세포막의 고해상도 매우 정의 이미지를 생성한다 (유리 인터페이스 즉, 약 150 나노 미터)에 집중 될 수있다. </li></ol></li><li> 세포 내 현지화를 결정하는 영상 9월 <ol><li> 이미징면에서 건강하고, 형질 전환, 단일 세포를 찾습니다. </li><li> pH가 7.4에서 셀의 초점을 맞춘 이미지를 획득. -9 월 표시되어야합니다 세포막과 소포체에 대한 수용체를 표시. </li><li> 신속 광표백을 방지하기 위해 시료에 도달하는 레이저 빔을 차단. </li><li> 다수의 XY 위치를 기록 할 수있는 현미경 영상 소프트웨어를 사용하여 각 셀에 대응하는 상기 스테이지의 위치를 ​​기억. </li><li> 소프트웨어를 사용하는 동안 접시 당 20 ~ 30 세포 단계를 반복 2.4.1-2.4.4 각 셀의 위치를 ​​기록합니다. </li><li> AFpH 7.4의 모든 셀 이미지 수집 터 수동 피펫을 이용하여 pH를 7.4 ECS 용액을 제거한다. 이 기억 된 무대 위치를 이동할 수 있기 때문에 접시를 만지지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 접시에 pH가 5.4 ECS 2 ㎖를 추가하고 10 분을 기다립니다. 이 기간 동안, 이전에 획득 된 영상을 저장합니다. </li><li> , pH 7.4의 영상을 수집 저장된 각 위치로 상기 스테이지를 이동하여 pH 5.4에서 동일한 셀의 이미지를 획득하는 데 사용되는 조건과 동일한 조건에서. 모든 검출 된 형광 수용체를 표시 9월 제한 소포체에서 발생하기 때문에 세포는 덜 정의 보일 것입니다. pH가 5.4 셀 이미지를 저장합니다. </li></ol></li><li> 라이브 세포 이미징 하나의 소포 삽입 이벤트 <ol><li> 2 ml의 pH가 7.4 ECS로 형질 세포의 성장 매체를 교체하거나 라이 보 비츠의 L-15 미디어. 라이 보 비츠의 L-15 미디어의 pH는 필요한 경우 화상을 장시간에 걸쳐 수행 될 수 있도록, CO 2 독립적이다. </li><li> PLAC현미경의 무대에 형질 전환 세포의 접시를 전자. 안전하고 위의 단계 2.3 다음 TIRF의 단일 셀을 초점을 맞추고있다. </li><li> 장착하면 초점이 영상의 기간 동안 표류하지 않도록, 자동 초점을 설정합니다. </li><li> 연속적으로 200 밀리의 프레임 레이트로 이미지를 캡처, 1000 일련의 프레임을 기록한다. 형광의 버스트는 세포 외 pH를 7.4로 9월 노출, 세포막과 융합 낮은 pH 밀매 소포에 해당하는이 시간 동안 볼 수 있습니다. </li><li> 또 다른 하나의 셀을 찾아 위의 단계를 반복합니다. 필요한 경우 자동 초점을 재설정합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 분석 및 데이터 처리 <ol><li> 9월 형광 분석은 세포 내 현지화를 결정 <ol><li> 이러한 MetaMorph로부터 또는 ImageJ에 (http://imagej.nih.gov/ij/)와 같은 영상 분석 소프트웨어를 이용하여 세포 영상을 연다. 롤링 볼의 설정을 사용하여 모두의 pH 5.4와 pH 7.4의 이미지에서 배경을 뺍니다.</li><li> 하나의 세포에서 형광을 정량화하는 강도 기반 임계 값을 사용합니다. 수동으로 pH 7.4의 이미지 셀 주위의 관심 영역을 선택합니다. </li><li> , 셀 면적을 측정 강도를 의미하고, 통합 밀도 ImageJ에있는 플러그인을 사용하거나이 분석 탭에서 &quot;측정&quot;기능 내장 사용. </li><li> 신중 마찬가지로 관심 강도 계 임계 영역과 조절, pH를 5.4에서 동일한 셀 3.1.1-3.1.3 단계를 반복한다. </li><li> 집적 밀도는 모두 7.4의 pH 5.4에서 세포 이미지 획득 후, pH 7.4의 값에서 5.4의 pH 값을 감산하여 세포막 집적 밀도를 계산한다. 차이점은 TIRF 여기 영역 내의 플라즈마 막에 대하여 수 수용체에 대응한다. </li><li> 피킹의 척도로 9 월의 상대적인 비율은 TIRF의 excitati 보이는 나머지 수용체에 비해 세포막에있는 수용체를 표지 계산100을 곱한 pH를 7.4 총 집적 밀도 밀도 집적 세포막을 분할하여 볼륨. </li></ol></li><li> 하나의 소포 삽입 이벤트를 분석 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 1000 TIFF 이미지 시리즈를 연다. 롤링 볼 설정을 사용하여 모든 프레임의 배경을 뺀다. </li><li> 삽입 이벤트 소포에 대응하는 강한 영역을 최대화하기 위해, 기록의 색 밸런스를 조정한다. 수동으로 이상 3 프레임 (&gt; 600 밀리 초)을 지속 형광의 버스트를 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to declare.

9월의 pH 민감성은 세포막에 존재하는 수용체 소포체에서 세포 수용체와 구별 될 수있게하고, 그 삽입 이벤트를 해결하는 데 사용될 수 수용체 담지 소체 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . 표면 바이오 틸 리간드 등 여러 가지 기술이 널?...

수용체 발현, 배포 및 조립 변화는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 낭포 성 섬유증, 및 약물 중독 1, 2, 3, 4, 5를 포함하여 질병의 다양한 접속되어있다. 예를 들어, 니코틴 및 다른 니코틴 성 리간드 피킹, 식, 및 상향 조절 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10의 변화 선도 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)의 피킹에 영향을 미친다. 니코틴은 셀 내에 조립 nAChRs의 총 개수를 증가 원형질막으로 피킹을 증가시키는D 일부 아형 고감도 버전을 선호 단위체 어셈블리를 변화시킨다. 질병 모델에서 인신 매매, 어셈블리 및 수용체의 발현에 뚜렷한 변화를 해결하는 것은 약물 표적을 정의하는 데 필수적인 중요한 기계적인 세부 사항을 제공합니다. 이상적인 방법은 빠른 속도로 세포 내 수용체와 세포막에 지역화 된 그 구별 것이다. 이것은 특정 단백질의 대부분은 nAChRs와 마찬가지로, 세포 내에서 존재하는 경우에 특히 도전적이다. nAChRs의 대부분 소포체 로컬 라이즈되기 때문에, 기존의 측정은 분비 경로를 따라 위치 파악 및 피킹 변화를 파악하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도 부족하다. nAChRs의 수용체 인신 매매와 표현 연구는 주로 11 방사능 리간드 결합, 바이오 틸 분석 (12), 웨스턴 블롯 (13), 또는 면역 침전의 techniq를 사용하여 수행되었다<html> 단말 (12). 이러한 세포의 리포터 분자 또는 고정의 결합 특이성에 의존하는 동시에 세포막 거주자 세포 수용체를 구분할 수있는 능력이 부족하다. 따라서, 이온 채널 조립 및 소포 역학 연구는 크게 낮은 처리량 전기 생리학 기술 (14)에 의존하고있다. 뛰어난 공간 및 시간 해상도는 형광 현미경의 발전으로 가능하다. 이러한 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그 변종과 같은 유전자 인코딩 된 기자 분자는, 비특이적 결합 문제를 제거하고 감도 (15)을 증가시킨다. superecliptic pHluorin SEP ()로 알려진 GFP의 pH에 민감한 변형은, 현지화 5, 7, 8 결정하는 세포 내 구획 사이 고유의 pH 차이를 악용 할 수 있습니다REF &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. -9 월 pH가 6 이상이되면 형광, 그러나 낮은 pH에서 오프 상태로 유지된다. 따라서, 그 내강 측 9월 태그 수용체 소포체에 존재하는 경우 검출되는 ( 트래픽 관리 소포에 국한 ER) 또는 원형질막 (PM)에 삽입시 아니지만. 세포막에 수용체와 접촉하는 세포 외 pH를 조작하면, 결과적으로 형광이 수용체 따라서 검출 바꾼다. 동일한 셀이면 순차적 중성 세포 외 pH를 6보다 낮은 다음 pH가 양쪽에서 촬상되어 이미지 차이는 세포막에있는 수용체에 기인한다. 이것은, 동시에 세포 측정 (주연 ER) 및 세포막 상주 수용체 5 허용 7,8 </suP&gt; 9. 세포 외 pH가 중성 일 때 단일 소포 삽입 이벤트는 해결 될 수있다. 낮은 pH를 피킹 소포는 세포막과 융합되면 소포의 내강 측 형광 7, 18, 19, 20의 버스트로서 검출 전환을 일으키는 중성 세포 외 용액에 노출된다. -9 월 원형질막 주변 소포체에 국부적 수용체의 측정을 가능하게하고, 이들의 세포 내 영역 5, 7, 18 간 수용체의 피킹을 측정하는 수단을 제공한다. 세포막에서 높은 해상도를 달성하기 위해, 유 전적으로 인코딩 9월와 수용체는 전반사의 형광 현미경 (TIRFM)에 의해 이미징된다. 이 방법은 특히 인유용한 수용체의 대부분은 TIRFM는 세포막의 시인성을 향상하기 때문에, 세포 내 영역에 국부적 인 경우. TIRFM는 오후에 삽입시 9 월 표지 수용체를 들고 하나의 소포의 인신 매매 역학의 해상도를 할 수 있습니다. 전반사는 셀과 유리 커버 슬립 (21, 22) 사이에서 서로 다른 굴절률을 가진 재료의 계면에서 발생한다. 유리 세포 용액의 계면에서 전반사를 달성하기 위해 배향되는 488 nm의 여기, 조사시 -9 월 형광. 이 샘플이 볼륨 내에서만 흥미 진진한 형광으로 약 150 nm의 침투 소멸 파를 생성합니다. 음원이 범위 내에서 중성 pH 환경에서 수용체를 함유 만 9월는 세포막 또는 주변 소포체에있는 것에 대응하는 검출된다. 검출 한정 t이기 때문에세포 내 영역에서 소멸 파, 배경 형광에 의한 O 여기 감소하고 신호대 잡음비가, 22 (21)을 증가시킨다. 또한, 상기 셀의 대부분을 관통하지 않는 방사선 때문에, 광 손상은 시간에 걸쳐 라이브 세포 이미징을 허용하는 최소화된다. 그 결과, SEP를 TIRFM은 분비 경로를 따라 막 수용체의 세포 내 위치 파악 및 피킹 동역학을 측정하기 위해 요구되는 높은 분해능과 감도를 제공 유전자 코드와 결합된다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom Petri dishes, sterile</td><td>Cell E&amp;amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium&amp;lrm; (DMEM), High Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&amp;nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium, no phenol red</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>Gently mix; Do not vortex</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Objective immersion oil&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Type F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>60X, 1.49 NA oil immersion objective</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Prior</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>Motorized actuator (stepper motor)</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph (or other imaging program)</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser</td><td>Market Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single mode fiber</td><td>Thorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>Mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

이해 막 단백질 인신 매매, 조립, 표현은 세포 내 소기관에 거주하는 사람들과 세포막에 지역화 된 그 구별 접근 방식이 필요합니다. 전통적인 형광 기반 측정은 다른 소기관에 존재하는 막 단백질을 구별하는 능력이 부족하다. 최첨단 방법론은 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 pH에 민감한 형광 물질을 결합하여 전통적인 방법을 초월. TIRF 조명 따라서, 배경 감소, 신호 대 잡음 비를 증가하고, 분해능이 향상 글래스 샘플 계면으로부터 약 150 nm의 최대 샘플을 여기시킨다. TIRFM의 여진 볼륨은 주연 ER로 세포막 근처 소기관을 포함한다. Superecliptic pHluorin (-9 월) GFP의 pH에 ​​민감한 버전입니다. 유전자 관심의 세포막 단백질의 세포 외 도메인으로 구월 인코딩하는 형광에 대한 위치 결정을응급실과 세포의 세포 외 영역에서의 내강 쪽. -9 월 pH가 6보다 큰 경우 형광, 그러나 더 낮은 pH 값에서 오프 상태로 남아있다. 따라서, (PM) 플라즈마 막에서 소포체 (ER) 또는 삽입에 거주하는 경우 만 인신 매매 소포 또는 골지 같은 다른 세포 소기관에 국한하지 않을 경우 9월의 형광 태그 수용체. 세포 외 pH를 세포막에 수용체의 형광을 지시하기 위해 조정될 수있다. 동일한 셀의 중성 및 산성 pH에서 세포 TIRF 형광 이미지 간의 차이는 세포막에있는 수용체의 상대적인 수에 대응한다. 이 세포 내와 세포막 거주자 수용체의 동시 측정을 할 수 있습니다. 세포 외 pH가 세포막과 융합 형광 상태로 전환 낮은 산도 피킹 소포에 대응 중성 일 때 단일 소포 삽입 이벤트는 측정 할 수있다. 이 versatil전자 기술은 막 단백질의 현지화, 표현, 인신 매매를 연구하기 위해 이용 될 수있다.

수용체에 9월 법인은 라이브 셀에서 그 수용체의 직접 검출 할 수있다. TIRFM와 결합이 세포막과 TIRF 여기의 영역의 세포 내 위치에서 특정 수용체의 분포에 상대적 발현 수준의 평가를 허용한다. 단일 소포 인신 매매 사건도 해결할 수 있습니다. 플라즈마 멤브레인에 9 월 표지 수용체의 상대 식 수준 <p class="jove_content" fo:keep-to...

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Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K 조회수.  University of Kentucky.  pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다. 

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Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

연구

신경과학

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

생체공학

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

생물학

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...