우리는 인정 오스틴 Cyphersmith 및 Mayandi Sivaguru (게놈 생물학에 대한 칼 R. Woese 연구소, 어 바나 - 샴페인 일리노이 대학) 현미경에 대한 지원과 관대 현미경의 핵심 화면과 비디오 캡처를 수용.

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

실험에서는 가장 일반적인 실패가 제조 어레이의 품질과 관련된 불완전하게 관심있는 생물학적 시스템에서의 반응을 특징으로하는 것을 발견 하였다. 우리는 세포 마이크로 어레이 실험의 일반적인 고장 모드 및 관련 문제 해결 단계 표 1에 독자를 참조하십시오. 특히 배열의 품질에 관해서는, 우리는 다음을 추천합니다. 이러한 로다 민 - 복합 덱스 트란과 같은 형광 표지 된 분자를 사용하는 프로그램, 매개 변수 및 버퍼으로 배열의 기술적 품질과 견고성을 확인합니다. 전이나 더 시각적으로 제조업체의 지침에 따라에 배열 이후 어느 철저히 핀은 핀 채널을 광학 현미경을 이용하여 이물질이 명확 있는지 확인합니다. 일반적으로 단백질 얼룩 또는 immunolabeling를 사용하여 배열 된 생체 분자의 보유를 확인합니다. 70 kDa의 아래 분자량 생체 분자가 자주 하이드로 겔 (23)에 유지되지 않습니다, </<html> SUP&gt; 31. 여러 종류의 세포를 사용하여 배열 된 생체 분자 세포 기능을 확인합니다. 만 부착 세포 배열과 호환합니다; 또한, 배열에 접착 두 세포 고유의 특성 (예를 들어, 인테그린 발현 프로파일) 및 선택한 ECM 단백질에 따라 달라집니다. 때문에 제한된 공간에, 우리는 여기에 배열 디자인, 레이아웃, 및 제조의 광범위한 치료를 제공하지 않은 이전 23 일에, 25 독자를 참조하십시오. 우리는 일반적으로 10 ~ 20 고유 한 생체 분자 조건 (즉, 5 ~ 10 점 / 상태)로 구성된 100 자리 서브 어레이 (150 μm의 스폿 직경 450 μm의 중심 간 거리)를 사용합니다. 하나의 배열의 서브 어레이의 수는 편안하게 한 25 × 75mm 현미경 슬라이드에 1,280 개까지 확장 할 수 있습니다 관심의 생체 분자 상태의 수에 따라 달라집니다 (~ 64 서브 어레이에서 6,400 점)외부 참조 &quot;&gt; 25, 31 파라미터는 상기 추가의 관심의 패턴의 크기에 따라 달라질 수는]. (75)로부터 패턴을 발생하는 핀 - 450 ㎛의 용이하게 이용할 수있다. 어레이 실험은 가장 다른 문화 형식을 사용하여 관심의 높은 점수를 배열 조건, 분석 판독 및 생물학적 모델 시스템의 유효성 검사에 의해 보완된다. 특히, 우리는 또한 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, QRT-PCR, 면역 블) 또는 표준 TFM와 함께 대량 배양을 사용하여 선택 배열 조건의 효과를 검증하는 것이 좋습니다. 유전자 조작 할 수도 어레이에서 관찰 된 효과를 확인하는 역할을 적절한 생물학적 모델 시스템에 대한 관심의 인자 (예를 들어, 최저 또는 과발현). 생체 내 동물 모델이 검증의 또 다른 방법을 나타내는 최근의 galectin-3 galectin-8의 중심 역할을 확인하기 위해, 예를 들어, 사용 된폐암 전이 틈새는 등의 초기 셀 마이크로 어레이 (31), (49)을 통해 확인했다. 다른 방법의 수는 2 차원 미세 시스템 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 3 차원 설계 생체 시스템 (56)의 종류, 57, 58을 포함한 세포 기능의 미세 환경 규제를 조사하는데 사용되어왔다 59, 60, 61. 다른 방법과 비교하여, 여기에 설명 된 셀 마이크로 어레이 플랫폼의 특별한 장점은 다음과 같이 구성한다 : (1) 최대 스루풋수백 또는 상호 작용 효과의 분석을 가능 요소의 다른 조합의 수천; (2) 액세스 자동화 영상 분석; (3) 배열 요소의 제어 프리젠 테이션을 모두 생화학 및 생물 물리학 판독의 통합; (4) 기판의 재료 특성을 변경하는 능력; 세포 운명 기능 (5)가 높은 콘텐츠 단일 세포 분석. 요약하면, 가변 기판 강성의 기판 상에있는 셀 TFM 마이크로 어레이의 조합 모두 생화학 및 생물 물리학 적 큐 완전한 특성화를 가능하게한다. 여기에 제시된 바와 같이,이 플랫폼은 일반화하고 용이 세포 분화 및 mechanotransduction의 조합 미세 환경 조절의 개선 된 이해를 향해 부착 세포 유형 및 조직 다양한 상황에 적용될 수있다.

세포와 주변의 미세 환경 요인 사이의 상호 작용은 개발, 항상성 및 질병 병인 1, 2, 3, 4에 걸쳐 생물학적 과정의 많은 다양한 중재. 이러한 미세 환경의 상호 작용은 결합 리간드 - 수용체를 통해 세포 용해 인자의 전달, 바인딩 셀 매트릭스 및 세포 - 세포 상호 작용을 포함한다. 상기 생화학 적 고려 사항에 더하여, 예컨대, 기판의 기계적 성질 등의 생물 리 학적 매개 변수 (예, 영률, 기공율)과 셀 형상 및 관련 하류 mechanotransduction 점점 세포 분화 5, 6, 7, 8의 중요한 매개체로서 인식을 얻고, 9 <sup&gt; 10. 이러한 미세 환경의 상호 작용으로 인한 신호는 유전자 네트워크 및 신호 경로에 대한 입력으로서 역할을한다. 또한, 이러한 세포 고유의 구성 요소는 세포 고유의 유전 적 프로그램과 세포 외부 미세 환경 요인 5, 11, 12 사이의 복잡한 공동 규제 루프를 완료 분비 요인과 행렬 분해 효소를 통해 미세 환경에 대한 피드백을 제공합니다. 미세 환경 요소의 조절 프레젠테이션 설계 시스템의 사용은 다른 컨텍스트 13, 14, 15의 범위에 유용한 입증되었다. 특히 미세 가공 시스템은, 소형화 (13)을 통해 단백질 및 세포뿐만 아니라 고도의 병렬화 분석 정확한 공간적 패턴을 용이 한 <sup클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 세포 마이크로 어레이는 생체 분자의 조합은 접촉 인쇄 탄성 폴리 아크릴 아미드 겔 기판 23, 24, 25로되어있는 하나의 미세 가공 시스템을 나타낸다. 세포 접착 성분 (즉, 기질 단백질)의 포함은 자주 면역 세포 형광 기자를 통해 다운 스트림 분석 뒤에 마이크로 어레이에 지속적인 세포 부착과 문화를 가능하게한다. 세포 마이크로 어레이 생산적 간세포 표현형 23, 26, 신경 전구 분화 27 mammar의 개선 된 이해를 달성 지향 된Y 전구 세포 운명 결정 (28), 배아 줄기 세포의 유지 / 분화 23, 29, 30, 폐암의 전이 (31) 및 흑색 종 (32)의 치료 반응. 최근 내배엽 스펙 33 간 선조 분화 34, 35, 폐 종양 세포의 약물 반응 (36)의 세포 외 기질 (ECM) 단백질 조성물의 역할을 규정하는 셀 마이크로 어레이의 사용을 증명하고있다. 이러한 작업에서는 어레이 플랫폼의 조합 기능을 확장 및 세포 외 기질 성분과 세포와 생체 역학 극한 신호의 교점을 탐구에 초점을 맞추고있다. 또, 능력 정량적 charac에 제공하기 위해 배열 플랫폼 생물 물리학 판독을 구현분화 세포의 수축력의 terize 역할은 (35)을 처리합니다. 이를 위해, 우리는 세포에서 생성 된 견인의 높은 처리량 평가를 가능하게 세포 마이크로 어레이와 견인 힘 현미경 (TFM)를 통합. TFM 세포에서 생성 된 견인력을 측정하기 위해 널리 이용되는 방법 및 조성물 및 로컬 미세 37, 38, 39, 40의 역학과 단일 세포 및 조직 수준 함수의 조정에 관한 중요한 통찰력을 제공했다. 따라서, 셀과 마이크로 어레이 TFM을 결합하는 중요한 생리 학적 관련성 생 물리적 파라미터를 측정하기위한 고 처리량 시스템을 제공한다. 여기에 설명 된 셀 마이크로 어레이 플랫폼은 네 개의 섹션으로 구성되어 폴리 아크릴 기판, 어레이, 세포 배양 분석법 및 판독의 가공 및 데이터 분석의 제조. 만나다처음 세 개의 실험 구역의 개략적 인 요약 그림 1; 면역 형광 데이터의 분석에 초점을 맞춘 마지막 부분의 개략적 인 요약 그림 2를 참조하십시오. 역학적 세포 - 기질 상호 작용의 연구에 세포 마이크로 어레이 플랫폼에 적응하기 위해, 우리는 웬 동부 알 당 동조 영률이지만 유사한 다공성 폴리 아크릴 기판을 사용했다. 41. 자신의 기판에 세포에 의해 가해지는 힘의 TFM 측정을 가능하게하기 위해, 우리는 자주 다른 그룹에 의해 이용 슬라이드 두꺼운 유리 현미경 이외에 유리 바닥 페트리 접시 형식을 구현했습니다. 따라서,이 세포 마이크로 어레이 플랫폼은 별도의 유리 - 바닥 접시에 TFM 통해 현미경 슬라이드 및 셀에서 생성 된 힘에 대한 면역 세포 분화를 통해 병렬 측정 할 수있다. 우리는 또한 일반적으로 세포 마이크로 어레이에 사용 된 분석 방법에 몇 가지 개선 사항을 적용했습니다. SpecificalLY 대신 전체 섬 강도의 파라 메트릭 Z 점수를, 우리는 단일 셀의 강도를 측정 및 비 정규 분포를 설명하고 더 정확하게 세포의 동작을 설명하기 위해 분위수 정상화를 적용합니다. 우리는 이러한 개선은 생화학 및 생물 물리학 모두 단서가 중요한, 교차 역할을하는 생물학적 과정의 조사에 대한 특정 유틸리티를 제공 믿습니다. 또한, 우리의 분석 개선은 단일 셀과 인구 수준의 문제가 발산되는 세포 기능의 범위의 연구와 세포 마이크로 어레이의 적용을 가능하게한다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td></tr><tr><td>100 &amp;times; penicillin&amp;ndash;streptomycin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &amp;times; 60 mm coverglasses</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Store under inert gas per manufacturer&#039;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td><td>Cell E&amp;amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td></tr><tr><td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6-well polystyrene microplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Collagen III, human</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV, human</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Used as a marker for array location.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant JAG1, rat</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope, inverted</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (&lt;em&gt;i.e&lt;/em&gt;., 37 &amp;deg;C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) is highly advisable for TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G with DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, mouse</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Microarray scanner</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.</td></tr><tr><td>Microscope slides, 25 &amp;times; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0.9 &amp;ndash; 1.1 mm thickness.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT15710</td><td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Protein A/G, recombinant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex drying tray, 2,000&amp;nbsp;mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Rectangular 4-chambered culture dish</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td></tr><tr><td>Stealth pin for arraying</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&amp;ndash;450 microns) as suited to your particular application.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

탄성 하이드로 겔 표면에 생체 분자의 접촉 인쇄 조합으로 구성 미세 세포 마이크로 어레이, 세포 분화에 배열 생화학 적 신호의 영향을 측정하기 위해 엄격하게 제어되는 높은 처리량 설계 시스템을 제공한다. 세포 마이크로 어레이를 사용하는 최근의 노력은 많은 미세 환경 요인이 병렬로 제공되는 조합 연구에 대한 자신의 유틸리티를 증명하고있다. 그러나, 이러한 노력은 세포 반응의 생화학 적 큐의 효과를 조사에 주로 초점을 맞추고있다. 여기서는 견인력 현미경 면역 및 생체 역학적 세포 기질 상호 작용에 의해 두 세포 분화를 평가하기 위해 가변 파장 재료 특성을 갖는 세포 마이크로 어레이 플랫폼을 제시한다. 이를 위해, 우리는 하나 현미경 슬라이드 또는 유리 바닥 배양 접시에 제작 된 탄성 계수 변화의 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔을 이용하여 두 개의 서로 다른 형식을 개발했습니다. 우리는 BES를 제공이러한 하이드로 겔 기판에 마이크로 어레이의 제조, 마이크로 어레이에 후속 세포 배양 및 데이터의 수집을위한 t 관행 및 문제 해결. 이 플랫폼이되는 생화학 적 (예, 세포 외 매트릭스 성분) 모두 및 생물 물리학에 대한 (예를 들면, 기판의 강성) 큐 역할 교차 상당한 재생할 수 생물학적 과정 연구에 사용하기 위해 적합하다.

이 플랫폼을 사용하여, 우리는 간 선조 34, 35의 운명 사양 모두 생화학 및 생물 물리학 적 큐의 역할을 조사 하였다. 단백질 A / G 공역 노치 리간드가 폴리 아크릴 아미드 겔 (도 3A)에서 향상된 보존 및 클러스터링을 보여 담관 세포의 운명 (도 3b)를 향해 간 전구 세포의 분화를 구동 더욱이 능력이었다. 단일 세포 분석을 이용하여, 우리는 리간드 간 전구 세포의 반응은에 또한 의존한다는 것을 발견은 ECM 단백질 콜라겐 I, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 라미닌 (도 3C)에 대한 노치 리간드에 대한 반응을 정량화 ECM 컨텍스트. 마지막으로, 우리는 리간드 DLL1과 Jag1없이 간 전구 세포를 생성하는 shRNA를 최저를 이용했다. 배열 된 노치 리간드에 대한 반응은 PR에 따라 변하며어느 esence 리간드는 세포 - 외인성 리간드에 반응성이 세포 리간드 극한 표현 (도 3d)의 함수이기도 것을 확인. 또한, 우리는 이중 양성의 고유 한 하위 집단을 관찰 (ALB + / OPN +)를 DLL1 최저 (그림 3D) 세포. 함께, 이러한 대표적인 결과를 표시한다 : (1) 개인 리간드 최저 여러 배열 ECM 단백질 노치 리간드의 페어링에 의해 예시 된 바와 같이 어레이 형태의 조합 기능; (2)뿐만 아니라의 기능은 ECM 단백질 배열뿐만 아니라, 단백질 A / G 매개 결합을 통해 세포 - 세포 리간드 배열; 및 (3) 우리 단세포 분석하고 독특한 개체군을 식별 할 수있는 기능의 구현. 우리는 또한 간 전구 세포의 분화가 기판 강성 및 ECM 성분 (그림 4A 모두에 의존하는 것을 관찰 </str<html> 피브로넥틴은 딱딱한 기판 (그림 4B)의 분화를 지원하는 반면 옹&gt;), 특히 그 콜라겐 IV를 찾는 것은 모두 부드럽고 딱딱한 기판에 분화 지원합니다. TFM 측정의 대표적인 히트 맵은 콜라겐 IV에 낮은 기판 강성에 지속적인 견인 스트레스 담관 세포 (그림 4C), 평균 제곱 평균 제곱근 값 (그림 4D)에 의해 확인 발견로의 분화를 촉진하는 것이 좋습니다. 함께, 이러한 대표적인 결과는 표시 (1) 가변 강성 기판 상에 마이크로 어레이와 셀 TFM의 성공적인 통합 세포 표현형 및 트랙션 응력 모두를 평가하는 단계; (2) 매트릭스 조성물과 기판 강성 모두 간 전구 세포 운명의 조정; (3) 세포 마이크로 어레이 우리의 TFM 분석 및 일반적인 견인 스트레스 프로파일의 구현입니다. 전자 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 첫 번째 세 가지 실험 섹션보기 개요 도식. 제 1 절에서, 유리 기판 청소 및 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔의 제조를 용이하게하기 위해 실란 화된다. 섹션 2에서, 관심의 생체 분자의 조합은 384도 원 마이크로 제조된다. 로봇 Arrayer에 다음에 하이드로 어레이를 제조 깨끗 핀, 소스 마이크로 및 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔에 로딩되고 초기화된다. 제 3 항에있어서, 세포가 배열 된 영역에 시드와 명소 배양 프로토콜이 수행 된 후 부착 할 수있다. 엔드 포인트에서 세포 중 하나 TFM를 사용하여 면역 세포 / 면역 고정 또는 분석된다. 스케일 바는 75 μm의 수 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> = &quot;1&quot;&gt; 페이지 내에서 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> 그림 2 : 처리 및 배열에서 면역 형광 데이터의 분석. (A) 기와는 복합 32 비트 RGB 이미지는 제 비닝 후 개별 8 비트 채널로 분할된다. 배열 형광 마커와 세포 섬의 조합을 사용하여, 상기 어레이의 세 모서리가 자동 배향 및 배열 리딩 있도록 식별된다. (B) 단일 셀의 데이터는 입력 된 어레이의 각 채널에 대해 생성된다. 실험적 편차를 고려하기 위해 정규화 분위수 모든 복제에 걸쳐 단일 공유 분포를 생산 생물 복제에 적용된다. 분위수 정규화 된 데이터는 연속적으로 또는 단일 셀 분포를 직접 분석 (라벨 백분율 양성 세포의 강도를 의미하는, 예를 들면, 셀 / 섬) 플롯 앙상블 측정의 계산을 통해 해석된다.m / 파일 / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> 그림 3 : 노치 리간드 프리젠 테이션에서 중재 간 전구 차별화. (A)는 노치 된 Fc 재조합 리간드 가변 -1- (JAG1) 델타 형 1 (DLL1)의 단백질 A / G로 배열 향상된 보존 및 클러스터링을 나타냈다. 스케일 바는 50 μm의입니다. (B) 간 선조는 노치 리간드을 제시 담관 세포를 분화. 4 &#39;, 6- Diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 핵 라벨 알부민 (ALB)는 간세포 마커이며, 오스테 오 폰틴은 (OPN)는 담관 세포 마커이다. 스케일 바는 150 μm의입니다. (C)이 ECM 단백질의 노치 리간드 JAG1, DLL1, 델타 같은 4 (DLL4)를위한 OPN 양성 세포의 비율의 정량은 I를 콜라겐, Collagen III, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 라미닌. 학생의 t의 -tests은 P &lt;0.05 (*)에 대한 표시 P-값으로 각 ECM 단백질 내의 각 배열 노치 리간드에 대한 제어 IgG에 대해 수행되었다. 노치 리간드 JAG1, DLL1 및 DLL4되게 콜라겐 III에 셀 ALB 및 OPN의 (D) 영상 세포 계측법. 노치없이 간 전구 세포는 DLL1과 Jag1 (즉, shDll1 및 shJag1가)의 shRNA 최저를 사용하여 생성 된 리간드. 평균은 ± SEM이 그림은 Kaylan 등에서 수정 된로 (C)의 데이터는 제시했다. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> 그림 4 : 매트릭스 구성 및 기판 강성 쿠간 전구 차별화를 rdinate. 덕트 세포를 담즙 (A) 간 전구 차별화 ECM 조성과 기판 강성 모두에 따라 달라집니다. DAPI는 ALB는 간 세포 마커이며, OPN은 담관 세포 마커 인 핵 라벨이다. (B) 탄성 계수의 기판 30 kPa로, 13 kPa로, 콜라겐 4 kPa의 I (C1), 콜라겐 IV (C4), 피브로넥틴 (FN), 그리고 모든 양방향 조합에 OPN 양성 세포의 비율의 정량 그 ECM 단백질. (C) 셀 견인 스트레스는 기판 강성과 ECM 성분 모두에 따라 달라집니다. (D)의 영률의 기판을 30 kPa로 콜라겐 4 kPa의 I (C1), 콜라겐 IV (C4), 피브로넥틴 (FN), 이들 모두 양방향 조합을 견인 응력 평균 제곱근 값 정량 ECM 단백질. (B) 및 (D)에서, 데이터는 SEM 및 스튜던트 t의 -tests 평균 ±로 표현 된P &lt;0.05 (*), P &lt;0.01 (**)에 대해 지시 된 P 값과 ECM 각 조합에 대해 30 kPa로 수행 하였다 P &lt;0.001 (***). 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다. 이 그림은 Kourouklis 등에서 수정되었습니다. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> 섹션 </td><td fo:width="1.5in"> 문제 </td><td fo:width="1.5in"> 잠재적 원인 </td><td> 해결책 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 폴리 아크릴 아미드 기판의 1. 제작. </td><td> 커브 글라스는 하이드로 겔에서 제거 할 수 없습니다. </td><td> Overpolymerization. </td><td> &lt;십분 (4 승 /의 평방 미터)에 중합 시간을 줄일 수 있습니다. 그 자외선 crossli 확인nker 출력이 기대 범위 내에있다. </td></tr><tr><td> 불량 폴리 아크릴 아미드 겔 중합. </td><td> Underpolymerization. </td><td> 중합 시간&gt; 십분 (4 승 /의 평방 미터)에을 늘립니다. 그 UV 가교제 출력이 예상 범위 내에 확인하십시오. </td></tr><tr><td> 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔은 커브 글라스의 제거 후 손상됩니다. </td><td> 소프트 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔은 손상하기 쉽다. </td><td> 우리는 특히 (즉, 4 kPa의) 하이드로 겔 가장 부드러운위한 하이드로 겔 제조 수율 (~ 50 %) 감소 관찰합니다. 부드럽게 하이드로 겔을 처리하고 원하는 수율을 달성하기 위해 시작 번호를 증가시킨다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 배열의 2. 제조. </td><td rowspan="2"> 불량 또는 일치하지 않는 지점 형태. </td><td> 일관성 가습기 기능. </td><td> 그 가습기를 확인하고 각 인쇄 실행을 통해 기능을 레오 미터 및 65 % RH을 유지한다. </td></tr><tr><td> 프린트 헤드 또는 막힘에 붙어 핀검정 고시. </td><td> 무료 핀 운동을 허용하도록 프린트 헤드를 청소합니다. 완전히 전에 각 인쇄 실행 후 청소 핀은 핀 채널에서 집계를 제거합니다. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. 세포 배양 및 분석 실행. </td><td rowspan="2"> 초기 부착 후 배열에 세포 분리 또는 사망. </td><td> Overseeding 과도한 증식. </td><td> 초기 시딩 밀도와 시간을 줄일 수 있습니다. 세포 증식을 감소시키기 위해 배열 문화 동안 &quot;유지 보수&quot;또는 &quot;차별화&quot;용지를 사용하십시오. </td></tr><tr><td> 하이드로 겔에서 독성 아크릴 모노머의 릴리스. </td><td> 아크릴 모노머의 확산 / 해제를 허용 세포 독성을 줄이기 위해 최소 3 일 동안 DH 2 O에서 하이드로 겔을 만끽 해보세요. </td></tr><tr><td rowspan="4"> 세포 배열에 연결하지 않습니다. </td><td> Underseeding. </td><td> 초기 시딩 밀도와 시간을 늘립니다. 더 강하게 부착 세포 유형을 사용합니다. </td></tr><tr><td> 가난한 증착매트릭스 또는 생체 분자 상태. </td><td> 입자 및 집계의 청소 핀, 인쇄 매개 변수를 확인하고, 형광 마커, 예를 들면, 로다 민 - 복합 덱스 트란의 얼룩을 평가한다. </td></tr><tr><td> 세포 - 기질 상호 작용의 특이성. </td><td> 다른 세포 유형의 일부가 아닌 다른 ECM 단백질에 특이 적 부착. 당신의 세포와 여러 다른 ECM 단백질을 테스트합니다. </td></tr><tr><td> 제작 후 최적 어레이 스토리지. </td><td> 우리는 동결 중에 상 변화를 방지하기 위해 부분적으로 65 % RH, 실온에서 밤새도록 제조 된 어레이를 저장 추천한다. 세포 접착 모두 습도, 온도, 저장 시간에 민감하다; 이러한 매개 변수는 실험을 위해 최적화 / 일치해야합니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 세포 배양 동안 유리 기판으로부터 박리 하이드로 겔. </td><td> 가난한 슬라이드 청소 및 실란 화. </td><td> 슬라이드 청소 작업 솔루션을 교체하고실란 화. </td></tr><tr><td> Overdehydrated 하이드로 겔. </td><td> 이상 15 ~ 30 분 동안 핫 플레이트에 탈수 하이드로 겔을 두지 마십시오. </td></tr><tr><td> 데이터 4. 분석. </td><td> 복제 관광 명소와 슬라이드 사이의 높은 변동성. </td><td> 어레이 제조의 가변성. </td><td> 핀과 프린트 헤드가 깨끗한 지 확인합니다. 가습기 기능을 확인합니다. 시각화 및 형광 마커를 사용하여 장소와 배열 품질을 정량화. 같은 저장소 배열은 위의 추천. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 문제 해결.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K 조회수.  University of Illinois at Urbana–Champaign.  세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다. 

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

의학

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

마이크로 패턴화된 엘라스토머를 이용한 단일 세포 수축성의 단순화된 고처리량 분석

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...