우리를 통해 초기 cloacal 마사지, 호세 Noguera를 감사 하 고 제프리 Kittilson 연구소에 대 한 지원. 이 작품을 BJH ND EPSCoR FAR0022429 수상에 의해 지원 되었다. 출판 비용 아낌없이 NDSU 학과 생물 과학을 지원 했다.

이 프로토콜은 척추 동물 주제를 포함 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 다코타 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 정액 passerine 새 cloacal 마사지를 사용 하 여 컬렉션
참고: Cloacal 마사지 재생산으로 활동적인 새만, 효과적인 정액 컬렉션 기법 이지만, 적절 한 조임 상황에서 번 식 시즌 밖에 성공적으로 수행할 수 있습니다. 생식 활동 cloacal 마사지를 사용 하 여 이전 대상 종에 대 한 결정 되어야 합니다. 캡처 시 야생 조류 또는 조류 포로에서 개최에이 기술을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>(사육 조건)에 남성 새부터 손바닥 (그림 1)를 만지고 그것의 복 부 측으로 지배적인 손을 비 지배적인 손에 bander의 그립 전송 새.<ol>
<li>새의 머리는 손바닥의 측면 가장자리에 가까운 인지 확인 합니다. 가볍게 머리와 몸을 핑 키, 반지, 그리고 가운데 손가락을 사용 하 여 보호 합니다. 이것은 조류의 환기와 꼬리 노출.</li>
		<li>느슨한 또는 가볍게 손바닥을 사용 하 여 절제 된 새의 다리를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> 그림 1 : Cloacal 마사지에 대 한 그립. 새는 복 부 쪽 손바닥과 머리 핑 키 손가락에 의해 보안 감동 지배적인 손에 가볍게 확보 된다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>지배적인 검지와 엄지는 cloaca의 우수한 끝의 양쪽에 놓고 가볍게 함께 ( 그림 2) 꼬리 쪽으로 아주 약간의 압력을 적용 하는 동안 손가락을 꼬집어. cloaca cloacal 점 막 (핑크 인테리어) 노출 evert 것입니다. 참고: 새 하지 않으면 정액, 현재 생산 cloacal 융기 작은 수 고는 cloaca evert 어렵다. 경험, 재생산으로 활성 및 비활성 남성5,11의 cloacas 사이 분화 하기 쉽습니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> 그림 2 : 손가락 위치와 cloacal 융기. 우수한 끝 (A)을 약간의 압력을 적용 하 여는 cloaca evert. 재생산으로 활동적인 남성 참새목 cloacal 융기는 분명 하 고 회사 (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"><li>비 지배적인 손을 가진 안정 손, 꼬리의 기지의 등 쪽 측에 검지 손가락의 패드를 놓고 나왔으며 cloaca 바로 아래 엄지손가락의 끝을 놓습니다. 참고: 짧고 부드러운 축소판 cloacal 마사지를 수행 하기 위한 유리한 이며 실수로 부상에서 새를 보호 한다.</li>
	<li>아래는 cloaca 머물고, 중간 압력으로 반복적인 움직임에 cranially 깊은 비 지배적인 엄지 이동. 새는 사정 될 때까지 계속 합니다. 개인에 따라이 일반적으로 1, 몇몇 다스 선 사이의 걸립니다.</li>
	<li>최대한 빨리 사정 하는 새, microhematocrit 튜브에 정액을 수집 합니다. 여러 ejaculates 얻기 위해 cloacal 마사지를 반복 합니다. 참고: Passerine 정액은 밝은 갈색 및 일반적으로 다소 두꺼운 견실 함이 있다. cloaca에서 배출 하는 흰색 또는 어두운 물질 정액, 고 정액 샘플을 오염 시킬 수 있습니다. cloaca에 혈액의 작은 금액의 외관에 혼합 또는 정액 일반적으로 마사지 하는 동안 너무 많은 압력에 의해 발생.</li>
	<li>DNA 추출에 대 한 1 x PBS (pH 7.4)의 20 µ L 가진 microcentrifuge 관에 정액을 놓습니다. 참고: 1 x PBS에 저장 된 정액 인공 수정에 적합 하지 않습니다 하지만 DNA 추출 나중에 사용할 수 있습니다-80 ° c.에 저장 될 때 PBS 실내 온도 될 수 또는 냉장, 있지만 정액 샘플 예금 될 때 액체 상태에 있어야 한다.<ol>
<li>적은 양의 화합물 현미경 (그림 3) 희석된 샘플을 보고 샘플에서 정자의 존재를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>추출까지-80 ° C에 희석된 정액을 저장 합니다.</li>
</ol>2입니다. 새 정액에서 DNA 추출
참고:이 프로토콜 여러 상업 DNA 추출 키트, 테스트 되었습니다 하지만 단지 하나의 DNA 키트12와 함께 사용 하면 성공 했습니다. 단계를 수정 키트 프로토콜에서 표시 됩니다 *.
<ol><li>물에서 dithiothreitol (DTT)의 1 분 솔루션을 준비 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 혼합<ol>
<li>약 수 DTT 솔루션 사용 직전까지-20 ° C에서 그것을 저장 하 고. 각 샘플 추출에 필요한 1 M DTT solution.*의 10 µ L</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mM Tris-Cl, pH 8.0;을 포함 하는 버퍼를 준비 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; 그리고 4 %SDS. 각 샘플 추출에 필요한이 buffer.*의 90 µ L<ol>
<li>실 온에서 버퍼를 저장 합니다. 그것은 시 켰 던 경우 dissolve.*에 56 ° C에 따뜻한</li>
	</ol>
</li>
	<li>포함 하는 로커 또는 65 흔드는 인큐베이터를 예 열 ° C.*</li>
	<li>바로 시작 하기 전에 추출, 10 µ L DTT 솔루션 10 샘플을 추출 하는 경우 각 샘플을 추출, 예: 900 µ L 버퍼 플러스 100 µ L DTT 솔루션 단계 2.2에서에서 준비 하는 버퍼의 90 µ L 믹스. 이 혼합물 DTT buffer.* 라는 것입니다.</li>
	<li>70 µ L 1 x PBS 전체 희석된 정액 샘플을 추가 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 잘 혼합</li>
	<li>100 µ L를 추가 DTT 버퍼 및 10 µ L 성분 K 솔루션 샘플을. 20 초간 소용돌이 다음 품 어 따뜻한 인큐베이터에서 1 시간 로커 또는 shaker.*에 대 한</li>
	<li>200 µ L 버퍼 알 및 200 µ L 추가 신선한 EtOH (100%)와 20 seconds.*에 대 한 소용돌이</li>
	<li>전체 샘플 스핀 열을 전송 하 고 원심 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브.</li>
	<li>새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW1를 추가 합니다. 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브 원심.</li>
	<li>새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW2 추가 합니다. 6000 x g.에서 1 분간 원심 분리기는 흐름을 통해 장소와 열 튜브에 다시 삭제 합니다.</li>
	<li>원심 20000 x g. 삭제 3 분 컬렉션 튜브 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 열을 놓습니다.</li>
	<li>피펫으로 35 AE의 µ L 열 막에 직접 버퍼 및 5 신속성에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>원심 1 분 14000 x g. 삭제에서 스핀 열 고-80 ° c.에서 추출한 샘플을 저장</li>
</ol>

<ol>
	<li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+size+and+sperm+competition+in+birds.">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li><li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+life+histories:+the+long+and+the+short+of+it.">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li><li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+of+the+male+gamete.">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li><li>Burrows, W. H., Quinn, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).</li><li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs.">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li><li>Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Song,+sperm+quality+and+testes+asymmetry+in+the+sedge+warbler.">Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler.</a> Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).</li><li>L&#252;pold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds.">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li><li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+(Melopsittacus+undulates).">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li><li>Stelzer, G., Crosta, L., B&#252;rkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attempted+semen+collection+using+the+massage+technique+and+semen+analysis+in+various+psittacine+species.">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

재생산으로 활성 상태에 있는 중소 조류에서 정액을 수집 하 고 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.
설명된 정액 DNA 추출 프로토콜 편의상 키트에서 수정 했지만 조류 정액에서 사용 하기 위해 정제 된. 정자는 표준 추출 화학 물질9,13, 세포 및 passerines에서 수집 된 정액 샘플은 매우 작은 (?...

새 생물학 연구에서 널리 이용 되 고 정자 수 쉽게 샘플링할 cloacal를 사용 하 여 정자 품질 및 경쟁1, 정자 telomere 역학2, epigenetics3및 유사한 주제를 포함 하는 연구를 위한 이상적인 주제는 마사지. Cloacal 마사지 새4,,56에서 정액을 모으기를 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술입니다. 반복된 샘플을 쉽게 얻을 수 있습니다 그리고 특별 한 도구가 필요, 필드 또는 실험실에서 수행 하는 간단 하 합니다. Cloacal 마사지 수십 년 동안 사용 되었습니다, 비록 사용할 수 설명 작성에서 배울 하기가 어렵습니다. 이 게시는 시간과 cloacal 마사지 학습에 관련 된 불확실성을 줄일 것입니다.
Cloacal 마사지를 사용 하 여 새 들에서 수집 하는 정액 운동 성 평가4,7 또는8인공 수정 대 한 즉시 사용 하거나 고급 이미징, DNA 추출 등 다른 용도 대 한 동결 수 있습니다. Passerine 새에서 정액 샘플 작은 하지만 밀도가 포장된 정자를 포함. DNA는 정자9의 특수 보호 기능을 극복 하기 위해 수정 편의상 상업 추출 키트를 사용 하 여 추출 됩니다. 추출 후 정자 telomeres 정량10를 사용 하 여 측정 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Microhematocrit capillary tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Any</td><td></td><td>Used for storing semen samples prior to DNA extraction.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA micro kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

avian semen collection by cloacal massage and isolation of dna from sperm

정액의 컬렉션은 다양 한 정자의 품질, 정자 telomere 역학, 그리고 epigenetics 관련 된 연구를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 유용할 수 있습니다. 새 생물학 연구에 널리 사용 되는 과목 이며 반복된 정자 샘플을 포함 하는 연구에 이상적입니다. 그러나, 몇 가지 리소스는 그 수집 및 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 방법을 배울 하고자 현재 사용할 수 있습니다. 여기는 cloacal 마사지, 조류 정자를 수집 하기 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다. 비록이 기술은 문학에서 설립, 그것은 사용 가능한 설명에서 배울 어려울 수 있습니다. 우리는 또한 상업적인 추출 키트를 사용 하 여 수정 하는 조류 정액에서 DNA를 추출에 대 한 정보를 제공 합니다. Cloacal 마사지는 생식 상태에서 어떤 중간 소형 남성 조류에 쉽게 사용할 수 있습니다. 컬렉션, 다음 정액 운동 성 분석에 대 한 즉시 사용 하거나 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 DNA 추출에 대 한 동결 될 수 있습니다. 이 추출 프로토콜 조류 정자에 대 한 세련 되었고 여러 passerine 종 (통행 인 domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus및 Turdus migratorius에서에서 수집 된 샘플에서 성공적으로 사용 되었습니다. )와 1 개의 columbid (비둘기 리비아).

Cloacal 마사지 그리고 DNA 추출을 사용 하 여 설명된 프로토콜 여러 passerine 종과 한 columbid (표 1)에서 수행 되었습니다. 정액 샘플 cloacal 마사지에 의해 수집 된에 정자의 존재는 400 배 확대 (그림 3)에서 복합 현미경 희석된 샘플의 작은 금액을 확인 하 여 확인 되었다. 집 참새는 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여에서 수집 하는 정액 샘플...

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Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

이 프로토콜 cloacal 마사지를, 조류, 그리고 수정 상업 추출 키트를 사용 하 여 새 정자에서 DNA 추출에서 정액을 수집 하는 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다.

조류 정액 컬렉션 Cloacal 마사지와 정액에서 DNA의 분리

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

avian-semen-collection-cloacal-massage-isolation-dna-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K 조회수.  North Dakota State University. 이 프로토콜 cloacal 마사지를, 조류, 그리고 수정 상업 추출 키트를 사용 하 여 새 정자에서 DNA 추출에서 정액을 수집 하는 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다.

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A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

연구

발생학

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and maturation. As of yet, weekly injections of human chorionic gonadotropin (hCG) have proved to maturate males after just 5-6 weeks of treatment, producing high volumes of high-quality sperm during several weeks. In addition, sperm cryopreservation protocols using different extenders, cryoprotectants and cooling and thawing times have been previously described for European eel. Here, we show that Tanaka&#180;s extender solution can be directly used for fertilization or for cryopreservation, making unnecessary the usage of different types of solutions and dilutions. Furthermore, the use of methanol as a cryoprotectant makes this protocol easy to use as methanol has low toxicity and does not activate the sperm. The sperm does not need to be cryopreserved immediately after the addition of the cryoprotectant, and it can be used long after being thawed. Moreover, sperm motility is still high after thawing although it is lower than that of fresh sperm. The aim of this work is to show the best available protocol for European eel handling, maturation, and sperm cryopreservation.

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocols for European eel maturation and sperm cryopreservation have been improved over the last years. This article describes the best protocol available using human chorionic gonadotropin (hCG) for inducing maturation and methanol as cryoprotectant.

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

생물학

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

아스티야낙스 멕시코의 게임테 컬렉션 및 체외 수정

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Recording Electrical Currents across the Plasma Membrane of Mammalian Sperm Cells

Recording of the electrical activity from one of the smallest cells of a mammalian organism- a sperm cell- has been a challenging task for electrophysiologists for many decades. The method known as "spermatozoan patch clamp" was introduced in 2006. It has enabled the direct recording of ion channel activity in whole-cell and cell-attached configurations and has been instrumental in describing sperm cell physiology and the molecular identity of various calcium, potassium, sodium, chloride, and proton ion channels. However, recording from single spermatozoa requires advanced skills and training in electrophysiology. This detailed protocol summarizes the step-by-step procedure and highlights several 'tricks-of-the-trade' in order to make it available to anyone who wishes to explore the fascinating physiology of the sperm cell. Specifically, the protocol describes recording from human and murine sperm cells but can be adapted to essentially any mammalian sperm cell of any species. The protocol covers important details of the application of this technique, such as isolation of sperm cells, selection of reagents and equipment, immobilization of the highly motile cells, formation of the tight (Gigaohm) seal between a recording electrode and the plasma membrane of the sperm cells, transition into the whole-spermatozoan mode (also known as break-in), and exemplary recordings of the sperm cell calcium ion channel, CatSper, from six mammalian species. The advantages and limitations of the sperm patch clamp method, as well as the most critical steps, are discussed.

<meta charset="utf8"></head><body>포유류 정자 세포의 원형질막을 가로지르는 전기 전류 기록

This protocol describes how to perform electrical recordings from mammalian sperm cells in a whole-cell configuration, with the goal of directly recording ion channel activity. The method has been instrumental in describing the electrophysiological profiles of several sperm ion channels and helped to reveal their molecular identity and regulation.

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