Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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우리 AQUAGAMETE FA 1205 비용 작업을 감사합니다. 이 작품 AGL201568330-c 2-1-R 프로젝트 (MINECO/페더)에 의해 재정적으로 지원 되었다. 데이비드 G. 발 카 르 세 드 의회에 의해 투자 되었다 카스 티 야와 레온 (EDU1084/2012)와 Fondo 사회 Europeo. 저자는 박사 아나 Riaza 및 Stolt 바다 농장 소화기, 닥터 폴 리 드 파스, 박사가 그 나 시오 마르티네스 몬테로 호세 라몬 Guiérrez 인정합니다. 우리 또한 videography 폴라 페르난데스 Colado 감사.

참고: 형광 색소 외피와 confocal 분석 컨트롤 및 치료 샘플에 대 한 2-3 h 이상 소요 됩니다. 데이터 처리는이 시간 계산에 포함 되지 않습니다. 필요한 재료는 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 또는 cryopreserved 정 충에 적용할 수 있습니다. Solea senegalensis 냉 수, 차가운 조건 (4-7 ° C)에서 항상 작업에서에서 생성 하는 어 종입니다. 프로토콜의 일반적인 보기에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
1. 실험 하기 전에 준비 작업
<ol><li>1mm 미토 콘 드리 아 얼룩 분석 학년 DMSO 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>4 ' 1 μ g/mL, 이온된 수에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>200 mOsm/kg 벨 솔루션 (116 m m NaCl, 2.9 m m KCl, 1.8 m m CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7) 준비</li>
	<li>4 m m 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다) 재고 솔루션 분석 학년 메탄올에서 준비 합니다. 참고:-20 ° C까지 필요에서 aliquots에 재고 솔루션을 유지.</li>
	<li>4-7 ° c.에 있는 microcentrifuge를 설정</li>
</ol>2. 형광 색소 부 화 하기 전에 샘플 준비
참고: 정 충의 부드러운 처리 때 바람직한 pipetting 및 resuspending.
<ol><li>Cryopreserved 셀 작동, Solea senegalensis 정 충1040 ° C에 녹고 물 목욕 준비. 7 물 목욕에 짚 샘플을 담가 s.</li>
	<li>잘라가 위를 사용 하 여, 샘플 microfuge 관으로 빈 하 고 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에서 원심.</li>
	<li>정액 플라스마 또는 cryoprotectants와 정액 플라스마 cryopreserved 샘플에서 pipetting 얼룩 프로토콜을 방해할 수 있는 모든 구성 요소를 삭제 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>4 ° C 200 mOsm/kg 벨 솔루션의 50-100 μ 셀 resuspend</li>
	<li>Neubauer 또는 입체 현미경 비슷한 세 챔버 정자 농도 결정 합니다.</li>
	<li>1-4 ° C 벨 솔루션에에서 0.5 mL의 최종 볼륨에서 106 셀/mL x 2를 세포 현 탁 액을 희석.</li>
</ol>3. 형광 색소 인큐베이션
참고: 형광 특히 솔루션에서에서 낮은 조명 조건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>DCFH-다 재고 솔루션의 3.125 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 25 μ M) 작업 샘플 희석을. 어둠10에서 40 분 4-7 ° C에서 품 어.</li>
	<li>30 분 후 DAPI 재고 솔루션의 0.5 μ 추가 (샘플에서 최종 농도: 2 μ M) 및 재고 솔루션 얼룩은 미토 콘 드리 아의 0.5 μ (샘플에서 최종 농도: 100 nM) 샘플을. 어둠 속에서 10 분 동안 두 형광을 품 어.</li>
</ol>4. 샘플 준비 Confocal 현미경 검사 법에 대 한
<ol><li>보육 시간 후 1000 x g, 1 분에 4-7 ° C에 세포 현 탁 액을 원심.</li>
	<li>Pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 삭제 합니다.</li>
	<li>200 mOsm/kg 벨 솔루션의 10-20 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>집중된 세포 현 탁 액의 장소 5 μ 슬라이드에 드롭.</li>
	<li>신중 하 게, 준비에 커버 슬라이드를 넣어 그것을 봉인 폴란드어와. 폴란드는 건조, 일단 준비는 confocal 현미경 검사 법에 대 한 준비.</li>
</ol>5. 실험 전에 confocal 설치
참고: 현미경, 따라 DCFH 다 수 수 "점화". 먼저 비-귀중 한 샘플을 최상의 조건을 설정 합니다.
<ol><li>현미경, 레이저, 카메라와 현미경을 실행 하는 컴퓨터를 켭니다.</li>
	<li>설정된 여기 레이저 각 형광 색소의 여기 및 방출 최대값을 고려:<ol>
<li>DAPI, 358의 여기 최대 사용 nm와 465의 방출 최대 nm.</li>
		<li>미토 콘 드 리아 얼룩 사용 644의 여기 최대 nm와 662의 방출 최대 nm.</li>
		<li>DCFH-다, 504의 여기 최대 사용 및 525의 방출 최대 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>25 X 목표는 정 충에 초점 작업을 시작 합니다. 이 형광 색소는 높은 강도 보고 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 셀의 초점을 맞추고 사용 하 여 63 X 또는 100 X 목표 철저 한 평가 위해 Solea senegalensis 정 충 크기 때문에 약 2 μ m.</li>
	<li>각 채널에 대 한 최적화 pinhole, 이득 및 전압. 같은 방식으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 모든 매개 변수는 사용 하는 형광 색소에 대 한 최적화 설정을 저장. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정자 세포 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 1, 750 V의 이득 전압의 작은 구멍.</li>
</ol>6입니다. 이미지 수집
<ol><li>이미지 수집에 대 한 원하는 품질 조건을 선택 합니다. 비트 깊이, 이미지 포맷, 빛 시트 두께, 수집 설정을 정의 하 고 단일 양면된 조명 선택 합니다. 단일에 대 한 일상적인 실험 Solea senegalensis 정 충 (이 매개 변수는 각 실험에서 변경 될 수 있습니다) 다음 사용: 프레임 크기 1024 픽셀; 16;의 픽셀 당 비트 스캔의 속도 2-4)입니다.</li>
	<li>열고 시작 하는 필드의 이미지 스캔 영역을 가운데로.</li>
	<li>자르기 도구를 사용 하 여 관심 영역을 선택 하 고 라이브를 누릅니다.</li>
	<li>범위 표시기 도구의 도움으로 배경을 줄이기 위해 디지털 오프셋을 조정 합니다. 각 채널에 대 한이 작업을 수행 하 고 이미지를가지고.</li>
	<li>각 형광 색소와 그들의 조합에 대 한 개별 채널의 품질을 확인 합니다.</li>
</ol>7. 3D 이미지 비디오를 만들기
<ol><li>Z-스택 수집 설정입니다.<ol>
<li>소프트웨어에서 Z-스택 옵션을 선택 합니다.</li>
		<li>단일 셀을 셀의 그룹 또는 관심 영역을 선택 하 고 그것을 집중.</li>
		<li>Z-스택 ' 첫 번째 조각 '과 ' 마지막 조각 ' 옵션으로 구분 하 고 정밀한 초점의 도움으로 0.2 µ m 간격 z 단계를 설정. 이 형광 색소는 높은 강도 보고할 수 있습니다 쉽게 전체 정 충 머리를 선택할 수 있기 때문에 초점 DAPI 채널을 선택 합니다. 각 채널에 대 한 최적의 인수 매개 변수를 선택 하 고 실험을 실행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z-스택 실험을 실행 합니다. 채널을 분할 하 고 각 신호는 세포 내에서 지역화 합니다.</li>
	<li>Z-스택 프로세스입니다.<ol>
<li>볼륨 렌더링: 실험 완료 되 면 Z 스택 처리 소프트웨어의 옵션을 선택 하 고 볼륨 렌더링 옵션을 선택 하십시오. 단계와 회전도 (360 °)의 수를 선택 합니다. 비디오 확장명으로 파일을 저장 합니다.</li>
		<li>스테레오 입체 사진: 옵션에서 스테레오 글리프를 선택 프로세스 창. 이 도구는 분할 채널 비디오 3D 이미지를 만들 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

그것은 잘 알려진 미토 콘 드리 아는 정자의 운동 성 및 기능에 대 한 주요 세포입니다. 이러한 세포는 동시에 직접 선생님 생산에 참여 했다. 흥미롭게도, 선생님의 제어 수준은 적절 한 정자 기능1필요 합니다. 다 산과 산화 스트레스 사이의 긍정적인 관계 포유류11 에 표시 되었습니다 하지만 과도 한 수준에 영향을 미칠 정자 품질12. 긍정적 ?...

정자 품질 반응성 산소 종 생산 연결 되었습니다 최근1. 미토 콘 드리 아에서 선생님 생산 정상적인 생리 적인 과정 이라고 여겨질 수 있다, 비록 선생님 생산의 과잉에 의해 산화 스트레스 서로 다른 수준에서 정 충에 손상의 명확한 원인입니다. 인간에서는, 산화 스트레스는 남성 불 임, 운동 성 및 capacitation2;을 능력 변경 관련 포유류에서 냉동된 정자 샘플에서 DNA 무결성의 변화는 H2O23의 합성에도 관련 되어있다.
Cryopreservation은 유전자 은행 양식 업에 대 한 일반적인 기법입니다. 이 기술은 Solea senegalensis같은 생식 문제 종에서 특히 중요 하다. 시장에서이 귀중 한 종 구 혼의 부족으로 인해 포로에서 태어난 개인 생식 기능 장애를 보여줍니다. 이 사실은 정자 cryopreservation 인공 수정 위한 정자 가용성 필요 합니다. 그러나, cryopreservation 연구 항 산화 보충의 유익한 효과 보고 있다 정 충4 해로운 수 있는 산화 스트레스의 원천이 될 수 있습니다. 선생님 억제 대상으로 미토 콘 드 리아 산화를 통해 소문에 하면 정자 cryopreservation 노란색 메기5에 대 한 유익한 했다.
따라서, 정자 샘플에서 선생님의 수준을 알고, 특히 cryopreservation6,7 후 있기 때문에 이러한 분자 정자 생존 및 다 산8에 대 한 단점으로 인정을 받고 있다 중요 하다. 또한, 셀 내에 선생님의 배급을 공부 하 고 손상의 정도 추정 하는 것 중요 한 수 있습니다. 예를 들어, 정상 및 정자 기능, 호환 되는 미토 콘 드리 아에서 선생님의 낮은 수준의 추측 될 수 있지만 핵 내 선생님의 높은 수준의 정 충 DNA 손상의 지표 수 있습니다. H2O2 는 미토 콘 드리 아에서 나올 수 있는 작고 충전 없는 분자9이기 때문에 핵을 관통 하는 가장 관련성이 높은 선생님 중 하나입니다. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-다) 특히 녹색 형광을 방출 하는 세포내 과산화물을 밝힐 수 있다. 이 문서에서는, Solea senegalensis 정자 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 H2O2 세포내 지역화를 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜 제공 됩니다.

<table><tbody><tr><td>2&amp;prime;,7&amp;prime;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscopy</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Analytical Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, Analytical Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerDeep Red&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge (refrigerated)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

산화 스트레스는 감소 하는 정자의 품질에 중요 한 요소 중 하나입니다. 어떤 종에서 높은 중요성의 이다 정 충에 반응성 산소 종 (선생님)을 탐지 하기 위한 효율적인 프로토콜을 개발 하지만 이러한 메서드는 거의 사용 하 고 덜 teleost에. Cryopreservation은 유전자 은행을 포함 하 여 다른 목적에 대 한 양식 업에 유용한 기술 이며 연중 정자 가용성을 보장 합니다. 냉동/해 동 절차 선생님 생산을 일으킬 수 있고, 정자 세포 손상. 고려는 예비 손상 선생님 생산의 과잉 발생할 수 그들의 지역화, 여기에 따라 정 충에 H2O2 를 감지 하 고 그것의 세포내 지역화 confocal 현미경 검사 법에 의해 평가 하는 상세한 방법론 제공 됩니다. 이 위해 3 형광 (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-다), 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 및 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI))의 조합2 H2O의 공동 지역화를 평가 하 되 정 충 핵 이나 미토 콘 드리 아 Solea senegalesis 정자 샘플에.

Confocal 현미경 검사 법 teleost 정자에서 세포내 선생님 평가 위한 이상적인 방법입니다. 이 연구는 (그림 1)에 3 개의 형광 (DAPI 미토 콘 드리 아 얼룩, DCFH-다)의 조합 기초 연구에 적용 될 수 있으며 응용 프로그램에 사용 되는 절차를 개선 할 수 있는 많은 유용한 정보를 제공 합니다. 산업 양식 식물, cryopreservation 프로토콜 등입니다. 다른 유형의 분석 ?...

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Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

이 프로토콜 H2O2 지역화 Solea senegalensis 정 충을 사용 하 여 민감한 형광 색소 DCFH 다 선생님, 미토 콘 드리 아에 대 한 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 DAPI 핵에 대 한 내 검색에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 시각화, 각각. 프로토콜은 신선한 또는 해 동 정 충으로 2 시간 내에서 수행 하도록 설계 되었습니다.

Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

6.2K 조회수.  University of León. 이 프로토콜 H2O2 지역화 Solea senegalensis 정 충을 사용 하 여 민감한 형광 색소 DCFH 다 선생님, 미토 콘 드리 아에 대 한 라이브 미토 콘 드리 아 얼룩 DAPI 핵에 대 한 내 검색에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 시각화, 각각. 프로토콜은 신선한 또는 해 동 정 충으로 2 시간 내에서 수행 하도록 설계 되었습니다.

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Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

연구

생화학

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes require energy. There remains an ongoing debate about the sources generating the ATP which fuels sperm progressive motility, capacitation, hyperactivation, and acrosome reaction. Here, we describe the application of an extracellular flux analyzer as a tool to analyze changes in energy metabolism during mouse sperm capacitation. Using H+- and O2- sensitive fluorophores, this method allows monitoring glycolysis and oxidative phosphorylation in real-time in non-capacitated versus capacitating sperm. Using this assay in the presence of different energy substrates and/or pharmacological activators and/or inhibitors can provide important insights into the contribution of different metabolic pathways and the intersection between signaling cascades and metabolism during sperm capacitation.

We describe the application of an extracellular flux analyzer to monitor real-time changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation.

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. Thiols are especially important for illuminating the redox status of cells via their reduced dithiol and oxidized disulfide ratios. Engineered cysteine-containing fluorescent proteins open a new era for redox-sensitive biosensors. One of them, redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP), can easily be introduced into cells with adenoviral transduction, allowing the redox status of subcellular compartments to be evaluated without disrupting cellular processes. Reduced cysteines and oxidized cystines of roGFP have excitation maxima at 488 nm and 405 nm, respectively, with emission at 525 nm. Assessing the ratios of these reduced and oxidized forms allows the convenient calculation of redox balance within the cell. In this method article, immortalized human triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231) were used to assess redox status within the living cell. The protocol steps include MDA-MB-231 cell line transduction with adenovirus to express cytosolic roGFP, treatment with H2O2, and assessment of cysteine and cystine ratio with both flow cytometry and fluorescence microscopy.

This protocol describes the assessment of subcellular compartment-specific redox status within the cell. A redox-sensitive fluorescent probe allows convenient ratiometric analysis in intact cells.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

발생학

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

생물학

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the modification of proteins, lipids, and DNA, which finally may lead to alteration in cellular function and cell death. Therefore, it is beneficial for cells to increase their antioxidant defense in response to detrimental insults, either by activating an antioxidant pathway like Keap1/Nrf2 or by improving redox scavengers (vitamins A, C, and E, &#946;-carotene, and polyphenols, among others). Inflammation and oxidative stress are involved in the pathogenesis and progression of retinopathies, such as diabetic retinopathy (DR) and retinopathy of prematurity (ROP). Since M&#252;ller glial cells (MGCs) play a key role in the homeostasis of neural retinal tissue, they are considered an ideal model to study these cellular protective mechanisms. In this sense, quantifying ROS levels with a reproducible and simple method is essential to assess the contribution of pathways or molecules that participate in the antioxidant cell defense mechanism. In this article, we provide a complete description of the procedures required for the measurement of ROS with DCFH-DA probe and flow cytometry in MGCs. Key steps for flow cytometry data processing with the software are provided here, so the readers will be able to measure ROS levels (geometric means of FITC) and analyze fluorescence histograms. These tools are highly helpful to evaluate not only the increase in ROS after a cellular insult but also to study the antioxidant effect of certain molecules that can provide a protective effect on the cells.

Here, we propose a systematized, accessible, and reproducible protocol to detect cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in M&#252;ller glial cells (MGCs). This method quantifies total cellular ROS levels with a flow cytometer. This protocol is very easy to use, suitable, and reproducible.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

신경과학

Flow Cytometric Analysis of Biomarkers for Detecting Human Sperm Functional Defects

The conventional semen parameter analysis is widely used to assess male fertility. However, studies have found that ~15% of infertile patients show no abnormalities in conventional semen parameters. Additional technologies are needed to explain the idiopathic infertility and detect subtle sperm defects. Currently, biomarkers of sperm function, including sperm apoptosis, mitochondrial membrane potential (MMP), and DNA damage, reveal sperm physiology at the molecular level and are capable of predicting male fertility.
With flow cytometry (FCM) techniques, each of these markers can be rapidly, accurately, and precisely measured in human semen samples, but time costs substantially increase and results could be obstructed if all the biomarkers need to be tested with a single cytometer. In this protocol, after collection and immediate incubation at 37 &#176;C for liquefication, semen samples were further analyzed for sperm apoptosis using Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) staining. The MMP was labeled with 5,5&#8242;,6,6&#8242;-tetrachloro-1,1&#8242;,3,3&#8242;-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) probe, and DNA damage was assessed using the sperm chromatin structure assay (SCSA) with acridine orange (AO) staining. Thus, flow cytometric analysis of sperm function markers can be a practical and reliable toolkit for the diagnosis of infertility and evaluation of sperm function at both bench and bed.

The present protocol provides a practical solution that allows for the measurement of apoptosis, mitochondrial membrane potential, and DNA damage in human sperm with a single cytometer.

인간 정자의 기능적 결함을 검출하기 위한 바이오마커의 유세포 분석

The conventional semen parameter analysis is widely used to assess male fertility. However, studies have found that ~15% of infertile patients show no ...

의학

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 정자 세포의 호흡 측정

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm mitochondrial activity, so the measurement of sperm mitochondrial function is an indicator of sperm quality. High-resolution respirometry is a method of measuring the oxygen consumption of cells or tissues in a closed-chamber system. This technique can be implemented to measure respiration in human sperm and provides information about the quality and integrity of the sperm mitochondria. High-resolution respirometry allows the cells to move freely, which is an a priori advantage in the case of sperm. This technique can be applied with intact or permeabilized spermatozoa and allows for the study of intact sperm mitochondrial function and the activity of individual respiratory chain complexes. The high-resolution oxygraph instrument uses sensors to measure the oxygen concentration coupled with sensitive software to calculate the oxygen consumption. The data are used to calculate respiratory indices based on the oxygen consumption ratios. Consequently, the indices are the proportions of two oxygen consumption rates and are internally normalized to the cell number or protein mass. The respiratory indices are an indicator of sperm mitochondrial function and dysfunction.

저자 스포트라이트: 정자 대사와 미토콘드리아 기능을 밝히는 남성 불임 연구 발전 

The analysis of sperm mitochondrial function by high-resolution respirometry permits the measurement of the oxygen consumption of freely moving spermatozoa in a closed-chamber system. The technique can be applied to measure respiration in human spermatozoa, which provides information on sperm mitochondrial characteristics and integrity.

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

Solea Senegalensis 정 충에 반응성 산소 종의 세포내 위치 평가

요약

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2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

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