이 연구는 카자흐 연방 대학교의 경쟁력있는 성장을위한 러시아 정부의 프로그램과 러시아 연구 기초 연구 (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983)에서 수행되었습니다. 원고 초안 초안에 도움이되는 의견을 제공 한 4 명의 익명 심사 위원에게 감사드립니다. 음성 녹음을 위해 Yuliya Aratskaya에게 감사의 말을 전합니다. 빅토르 일린 (Victor Ilyin) 박사에게 많은 도움이되는 의견과 필사본 편집에 대한 도움을 주신 데 대해 감사드립니다.

실험은 Rana ridibunda 개구리의 근육 피부 피질 의 고립 된 신경 근육 조제에 수행되었다. 두 성별 동물의 크기는 약 5-9 cm이었다. 실험 절차는 카자흐 연방 대학교 (Kazan Federal University) 및 카잔 의대 (Kazan Medical University) 실험실 동물의 사용 및 관리에 관한 NIH 지침에 따라 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 유럽 공동체위원회 지침 86 / 609 / EEC의 요구 사항을 충족했으며 카잔 의과 대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 링거 용액 준비. <ol><li> 링거 용액을 준비하십시오 : 113.0 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 3.0 MM NaHCO 3 및 1.8 MM CaCl 2 . pH를 7.2-7.4로 조정하십시오. </li><li> 낮은 Ca 2+를 가지고 링거 용액을 준비한다. </높은 Mg2 + 함량 : 113.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 3.0 mM NaHCO3, 6.0 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2. pH를 7.2-7.4로 조정하십시오. </li></ol></li><li> 염료 - 로딩 용액의 제조. <ol><li> HEPES-Na가 함유 된 수성 용액을 10 mM (pH 7.2-7.4)로 준비한다. </li><li> 염료 30 와 유리 병에 HEPES 솔루션 14 μL를 추가합니다. 참고 : Ca 2+ 지시약 염료는 분말 500 μg이 들어있는 500 μL 바이알에 들어 있습니다. </li><li> 소용돌이 치고 완전히 스핀 다운 믹스. </li><li> 용액을 희석하여 Ca 2 + 지시약의 최종 농도를 30 mM로 낮추십시오. 빛에 노출시키지 않고 -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 염색 로딩 절차 <ol><li> pectoralis proprius 신경 조각으로 피부 pectoris 근육을 해부. 참고 : 해부 절차를 사용할 수 있습니다.Blioch 등 이 무료로 다운로드 할 수 있습니다. , 1968 31 . <ol><li> 해부 절차 들어, 두 개의 미세한 집게와 각막 가위를 사용합니다 ( 재료 표 참조). 해산 된 조직을 실리콘 엘라스토머로 코팅 된 페트리 접시에 옮기고 링거 용액으로 채우고 미세한 스테인레스 스틸 핀으로 티슈를 고쳐서 접시에 약간 펴십시오. </li><li> 페트리 접시를 링거 용액의 신선한 분액으로 다시 채우십시오. 결합 조직을 제거하십시오. 신경을 손상시키지 마십시오. </li></ol></li><li> 충전 용 피펫을 준비하십시오 : 면도날을 사용하여 표준 플라스틱 10 μL 피펫 팁의 원뿔 부분의 ~ 2 mm 길이 조각을 잘라냅니다. </li><li> 페트리 접시에 채우는 피펫을 마운트하는 모델링 점토의 조각을 준비합니다. </li><li> 피펫 팁으로 만든 실리콘 튜빙과 플라스틱 연결 어댑터를 통해 플라스틱 주사기에 채우기 피펫의 뒷면을 연결하십시오. </li><li> 전에너희 절차를로드, 플라스틱 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 링거의 솔루션을 제거합니다. 미세 주사기를 사용하여 근육 - 신경 준비를 건조; 이것은 채우는 피펫의 후속 적재시 Ca 2+ 염료의 희석을 방지합니다. </li><li> 냉동실에서 Ca 2+ 지시약 병을 꺼내 어두운 곳에서 실온에서 해동 시키십시오. </li><li> 저배율 (10 배)의 입체 현미경 제어하에 근육과 신경 사이의 교차점을 감지합니다. 미세 핀셋과 가위로 근육 표면 가까이에 가슴 지느러미 신경을 자릅니다 (2.1 단계 참조). 약 2mm 길이의 신경 그루터기를 남겨주세요. </li><li> 모델링 점토를 사용하여 페트리 접시에 튜빙과 주사기에 첨부 된 채우는 피펫을 수정. </li><li> 피펫의 끝을 신경 그루터기 가까이에 놓습니다. </li><li> 그것을 꼬집지 않고 부드럽게 피펫의 끝 부분에 신경 그루터기를 대기음. </li><li> 블런 (blun)에서 흡입 튜빙을 제거하십시오.필링 피펫의 끝. </li><li> 긴 바늘이있는 주사기를 사용하여 주입 피펫에서 과잉 용액을 조심스럽게 제거하십시오 ( 재료 표 참조). 신경 그루터기를 끼지 마십시오. </li><li> 수직으로 팁에 흡인 된 신경 그루터기를 유지하면서 약간 채우는 피펫의 팁을 올리십시오. </li><li> 석유 젤리를 사용하여 채우기 피펫 팁의 외부에서 신경 그 루터 기의 흡입 부분을 보온하십시오. </li><li> 필요하면 필링 피펫에서 단열 된 신경 그루터기를 말라. 긴 바늘이있는 주사기를 사용하여 필링 피펫에서 과량의 용액을 부드럽게 뽑아냅니다. </li><li> 긴 피펫 팁이있는 피펫을 사용하여 염료 로딩 용액 (0.5 단계)을 그립니다 (1 단계 참조). </li><li> 부드럽게 충전 피펫으로 로딩 솔루션과 피펫 팁을 삽입합니다. 혼합물을 신경 그루터기로 직접 꺼내십시오. </li><li> 석유 젤리로 채우는 피펫의 열린 끝 부분을 봉인하십시오. </li><li> 링거 스의 작은 분량을 더한다.준비가 젖은 유지 페트리 접시에 olution. </li><li> 어두운 온도와 습도 조건에서 실온에서 5 시간 동안 준비물을 품는다. </li><li> 로딩 용액으로 채우는 피펫을 제거하고, 링거 용액으로 조제 물을 헹구고 8 ° C에서 밤새 냉장고에 보관하십시오. </li></ol> 3. 현미경 검사를위한 조직 준비 <ol><li> 준비를 실리콘 엘라스토머로 코팅 된 챔버에 넣고 스틸 마이크로 바늘로 고정시켜 약간 늘어지게합니다. </li><li> 신선한 링거 용액의 분액과 함께 조직을 씻어. </li><li> 흡입 전극을 사용하여 신경을 자극하십시오. 전극의 구조는 Kazakov 등 이 논문을 무료로 다운로드하면 얻을 수 있다. , 2015 32 . 전극 팁을 신경의 절단 끝과 가깝게 위치시키고 전극 구멍으로 신경 그루터기를 대기음하십시오. </li><li> 현미경 스테이지에 준비 챔버를 장착하십시오. Place 온도 프로브 및 챔버의 입구 및 출구 발화. </li><li> Peltier 요소에 전원 코드를 연결하십시오. </li><li> 준비를 씻어 내려면 간단한 중력 중심 시스템을 사용하십시오. 초과 용액을 제거하려면 관류 흡입 펌프를 켜십시오. </li><li> 온도 컨트롤러 유닛을 켭니다. </li><li> 온도 조절기를 20 ° C로 설정하십시오. </li><li> 자외선 차단 장치를 설치하십시오. </li><li> 전기 자극기에 자극 와이어 전극을 연결하고 4X 객관적인 렌즈와 현미경으로 근육 수축을 관찰. </li><li> 낮은 Ca 2+ 및 높은 Mg 2+ 함량의 링거 용액으로 관류 시스템을 채우십시오. 참고 :이 솔루션은 근육 수축을 방지하는 데 사용됩니다. 외부 칼슘 농도의 감소와 외부 마그네슘의 상승은 칼슘 이온 과도 변화의 진폭 감소를 초래한다. 그러나, 이전의 경험에 기초하여 0.9 mM CaCl <sub&gt; 2 및 6 mM MgCl 2 는 여전히 Ca 2+ 과도 현상의 진폭을 안정적으로 해결하기에 충분합니다. 예를 들어 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 특정 차단제 인 d-tubocurarine 또는 alpha-bungarotoxin을 사용하면 근육의 경련을 완전히 또는 부분적으로 차단할 수 있습니다 그러나, 이러한 독소의 첨가는 또한 시냅스 전의 칼슘 섭취에 영향을 줄 수 있습니다 33 . 이를 피하기 위해 μ-conotoxin GIIIA를 사용할 수 있습니다 27 . </li><li> 펌프를 켜고 저 Ca 2+ 및 고 Mg 2+ 가 포함 된 Ringer 용액으로 조제약의과 주입을 시작하십시오. </li><li> 현미경으로 40x 대물 렌즈로 전환하십시오. </li><li> 스위치 켜기<html> 그는 단색화 자입니다 ( 재료 표 참조). </li><li> 모노 크로 메터 제어 소프트웨어에서 방출 파장 488 nm와 연속 조명 모드를 선택하십시오. </li><li> 형광 모드에서 높은 배율에서, 신경 터미널은 염료와 함께로드되었는지 확인하십시오. </li></ol><img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig1.jpg" /> 그림 1 :로드 된 칼슘 2 + 표시기가있는 신경과 말단. ( A )로드 절차 후 Ca 2+ 지시약으로 채워진 신경. 스케일 바 = 200 μm. ( B ) 칼 2 + 표시기로 가득한 신경 엔딩. 스케일 바 = 20 μm. ( C ) Ca 2+ - 지시자 형광은 신경 종결에서 분명하게 보인다. 스케일 바 = 20 μm._blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol start="17"><li> Ca 2+ 및 Mg 2+ 가 낮은 용액에서 30 분 이상 평형을 유지하도록한다. </li></ol> 4. 디지털 CCD 카메라로 영상 캡쳐 참고 : 형광 신호 캡처에 대한 자세한 내용은 각 현미경 및 카메라 유형에 따라 다르지만 핵심 고려 사항은 이미지 캡처 속도입니다. <ol><li> NMJ에서 단일 칼슘 2+ 과도 전류의 기록을위한 최소 포착 주파수로 1 kHz를 사용하십시오. 참고 : 빠른 디지털 CCD 카메라는 형광 이미징에 필요합니다 ( 재료 표 참조). 데이터 수집 시스템과 소프트웨어 ( Table of Materials 참조)는 카메라, 모노 크로 미터 및 자극 장치의 동기화에 사용되었습니다. 요컨대,이 프로토콜은 데이터의 디지털 출력에 동기화 펄스를 생성 할 수있게합니다획득 시스템을 사용하여 셔터를 열고, 비디오 신호를 캡처하고, 자극을 시작합니다. 모든 시간 파라미터는 프로토콜 및 / 또는 장치에서 설정 될 수있다. 일반적인 프로토콜은 1 kHz (80 x 80 픽셀)에서 수집 된 일련의 500 프레임입니다. 여기 광으로 조명하면 Ca 2+ 지시약이 표백되고 세포 조직이 광 손상 될 수 있습니다. 따라서, 여기 광에 장시간 노출되는 것을 피하십시오. 이 프로토콜에서 셔터는 비디오 캡처에 필요한 시간 동안 만 열립니다. 특정 신경 말단 당 20 개의 시리즈를 획득하십시오. 여기에서 목표는 대조군과 약물 전달 후 동일한 부위를 모니터링하는 것입니다. </li><li> 현미경의 4X 대물 렌즈 아래에서 밝은 영역 정권을 사용하여 근육과 신경 가지를 시각화합니다. </li><li> 40X 객관적인 렌즈로 전환하고, epifluorescence 정권과 488 nm의 여기 파장을 사용하여, 염료로드 신경 끝을 검색합니다. 관심의 신경 끝 부분을 확인하십시오. </li><li> 삼안경에현미경, 빛 경로 교환 레벨을 선택하십시오 : 카메라에 100 % 빛. </li><li> CCD 카메라의 수집 소프트웨어를 시작하십시오. </li><li> &quot;라이브&quot;모드에서 ROI를 찾고 초점을 조정하십시오. </li><li> &quot;변경&quot;메뉴를 선택하십시오. </li><li> &quot;기본 구성&quot;은 초당 1,000 프레임 (fps), 해상도는 80 x 80입니다. </li><li> 입력 프레임 수를 500으로 설정하십시오. </li><li> 실험의 이름을 입력하십시오. </li><li> &quot;외부 트리거&quot;를 선택하십시오. </li><li> 사전 트리거 시간을 10ms로 설정하십시오. </li><li> 반복 횟수를 20으로 설정하십시오. </li><li> 모노 크로 메타 컨트롤 소프트웨어에서 488 nm의 방출 파장과 &quot;외부 트리거 조명&quot;모드를 선택하십시오. </li><li> 데이터 수집 소프트웨어를 실행하십시오. </li><li> 자극 프로토콜을로드하십시오. </li><li> 비디오를 레코딩하기 전에 비디오 수집 소프트웨어를 사용하여 어두운 프레임을 캡처하십시오. </li><li> 자극 프로토콜을 실행합니다. </li><li> ROI 및 chec 선택k 녹음 된 신호. </li></ol> 5. 데이터 분석 참고 : 데이터 분석을 위해 CCD 카메라 소프트웨어와 ImageJ를 사용하십시오. 데이터는 스프레드 시트 프로그램에서 곡선으로 표시됩니다. CCD 카메라 소프트웨어에서 평균 20 회 반복하여 결과를 ImageJ 지원 파일로 내 보냅니다. ImageJ에서 ROI와 배경을 선택하십시오. ROI에서 배경을 뺍니다. 비율 (ΔF / F 0 -1) x 100 %로 데이터를 표시하십시오. 여기서 ΔF는 자극 중 형광 강도이고 F 0 는 휴지시 형광 강도입니다. <ol><li> CCD 카메라 수집 소프트웨어에서 파일&gt; 평균 파일을 클릭하십시오. 파일을 선택하고 평균을냅니다. </li><li> &quot;평균으로 저장&quot;을 클릭하여 평균 파일을 .fit 파일로 저장하십시오. </li><li> ImageJ 소프트웨어를 실행하십시오. 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> 이미지&gt; 조정&gt; 밝기 / 대비를 클릭하십시오. </li><li> 이미지&gt; 스택&gt; 도구&gt;; 스택 분류기. </li><li> 분석&gt; 도구&gt; ROI 관리자를 클릭하십시오. </li><li> 평균화 된 .fit 파일을 ImageJ 창으로 끌어 놓습니다. </li><li> 더 나은보기를 위해 창을 확대하십시오. </li><li> 커서를 움직여 마지막 프레임을 선택하고 삭제합니다 (이것은 어두운 프레임 임). </li><li> 배경으로 여겨지는 영역의 직사각형 ROI를 선택하십시오. ROI 관리자에 추가하십시오. </li><li> 추가&gt; 다중 측정을 클릭하여 배경을 측정하십시오. 평균에 유의하십시오. 데이터를 복사하여 스프레드 시트 프로그램으로 내 보낸 다음 비율에 대한 임계 값의 평균값을 계산합니다. </li><li> Process&gt; Main&gt; Subtract를 클릭하여 스택에서 임계 값을 뺍니다. 임계 값의 평균값을 입력하십시오. </li><li> 신경 터미널 주변의 직사각형 ROI를 선택하십시오. ROI 관리자에 추가하십시오. </li><li> More&gt; Multi Measure를 클릭하여 측정하십시오. 평균에 유의하십시오. 스프레드 시트 프로그램으로 복사하여 내 보냅니다. </li><li> 신호의 평균 오프셋. 참고 :자극없이 기본 염료 형광을 시연하는 처음 수십 포인트; 이것은 휴식 상태의 형광입니다. </li><li> 신호를 나머지 형광으로 나눕니다. </li><li> &quot;1&quot;을 빼고 100 %를 곱하십시오. </li><li> 신호를 플롯하고 Ca 2+ 과도 현상의 진폭을 계산하십시오. </li></ol>

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dependence+of+damage+to+mouse+motor+nerve+terminals+following+oxygen/glucose+deprivation.">Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation.</a> Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).</li><li>Peng, Y. Y., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+LHRH+is+linearly+related+to+the+time+integral+of+presynaptic+Ca2++elevation+above+a+threshold+level+in+bullfrog+sympathetic+ganglia.">Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia.</a> Neuron. 10, 465-473 (1993).</li><li>Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Latrotoxin+releases+calcium+in+frog+motor+nerve+terminals.">alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).</li><li>Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+muscarine-induced+synaptic+depression+at+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction.</a> Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).</li><li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction.">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li><li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+activity+but+not+intracellular+calcium+determines+the+time+course+of+endocytosis+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li><li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse.">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li><li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+suction+electrode+for+electrical+stimulation+of+biological+objects.">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), 13-16 (2015).</li><li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction.">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li><li>B&#233;lair, E. L., Vall&#233;e, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs.">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li><li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes.">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li><li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraterminal+Ca2++and+spontaneous+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li><li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++from+one+or+two+channels+controls+fusion+of+a+single+vesicle+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li><li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom.">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li><li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transient+registration+in+response+to+single+stimulation+and+during+train+of+pulses+in+mouse+neuromuscular+junction.">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li></ol>

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이 논문에서 우리는 신경 단단을 통해 개구리 신경 종말에 칼슘 2 + 감응 염료 로딩을 수행하는 방법을 제시했다. 적재 절차가 끝날 때까지 신경 근위 부분의 모든 말단에는 상당한 형광 수준이 있습니다. 프로브의 내부 - 말단 농도는 40 ~ 150 μM 사이 인 것으로 추측됩니다. 배양 과정은 두 단계로 진행됩니다 : 실온에서, 그리고 냉장고에서 더 낮은 온도에서. 상온에서 염료로 조직 배양 시간을 조절하는 것이 중요합니다. 신경 그루터기의 실제 길이, 특정 염료 및 온도에 따라 잠복기 시간이 다를 수 있습니다. 과다 노출되면, 신경 그루터기에 가까운 근위부의 터미널에 과부하가 걸릴 수 있습니다. 그러나 신경의 중간 부분에서, 만족스럽게로드 된 터미널을 찾을 수 있습니다. 동안냉장고에 장기간 배양하면 염료가 신경 종말에 고르게 분포합니다. 우리 자신의 관찰 33 , 35 및 다른 연구자 30 의 데이터는 postsynaptic response의 진폭이나 소형 end-plate 전위의 빈도에 대한 적재 절차의 감지 할 수없는 영향력이 없음을 증명합니다. 좋은 장수는 적재 된 준비에 문서화되었습니다. 우리가 주목하고 싶은 몇 가지 중요한 점이 있습니다. 염료가 절단 된 신경의 축삭으로 들어갈 수 있도록 절개 한 후 몇 분 안에 염료 로딩 용액에 신경 그루터기를 놓는 것이 매우 중요합니다. 지연은 아마도 신경 axons의 resealing로 인해, 효과가로드를 일으킬 수 있습니다 27 , 36 . 일부 연구자들은 100 mM EDTA (Ca 2+ - 및 Mg 2+ - 쉐이핑 제)에 신경 그루터기를 담그고) 절단 axons가 resealing에서 방지하기 위해 신경 excision 직후. 완충제는 1-2 분 후에 제거되고 염료 로딩 용액으로 교체된다. 적재 절차를 위해 플라스틱 튜빙 대신에 석유 젤리를 사용하면 더 짧은 신경 덩어리를 사용할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하는 동안, 그것은 염료와 HEPES 솔루션에 잠겨있는 후 절단하고 axons은 염료 솔루션 27,28 에서 2가 이온의 부족 때문에 reseal하지 않습니다. 우리 연구에서 우리는 덱스 트란 대신 Ca 2+ 지시약의 수용성 소금 형태를 사용했다. 덱스 트란 접합체는 염 형태보다 축삭에서 더 천천히 퍼진다. 그러나, 덱스 트란 접합체의 사용은 신경 및 NMJ에 의한 염료 구획화 및 취급을 감소시킨다. 칼슘 녹색 1-3,000 MW 덱스 트란 접합체는 우수한 확산 속도를 가지며 감소 된 구획화를 보여줍니다 <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 38. 장기간의 형광등 조명을 피하는 것은 건강과 생존에 영향을주기 때문에 매우 중요합니다. 우리는 신경 터미널을 검색하기 위해 가시 광선 채널에서 노말 스키 광학을 사용합니다. 녹음하는 동안 우리는 조리개를 사용하여 조명 된 필드를 제한합니다. 이 로딩 방법은 오랫동안 잠복기를 견딜 수있는 준비에만 적합하다는 것이 주목됩니다. 연구가 더 연약한 조직 ( 예 : 온혈 동물의 시냅스)에서 수행 될 때 염료 로딩 시간을 줄이려면 신경 그루터기 길이를 줄이고 적재를 위해 마이크로 피펫을 사용해야합니다. 이 로딩 기술은 단일 신경 자극 및 리듬 시냅스 활동 모두에서 형광 표시기가있는 세포질 Ca 2+의 변화를 영상화하는 데 적합합니다ef &quot;&gt; 17 , 27 , 35. Ca 2+ 과도 현상 진폭 분석은 신경 전달 물질 방출에 관여하는 칼슘 유입에 대한 다양한 물질의 영향을 연구하는데 사용될 수있다.

칼슘 이온 (Ca 2+ )은 중개자 방출 1 , 2 , 3 , 4 , 5 의 개시, 유지 및 가소성을 포함하여 많은 연결 신호 과정에 참여합니다. 활동 전위가 도달하면, 세포 외 칼슘 2+ 는 신경 말단에 들어가고 신경 전달 물질 방출을 시작합니다. 일부 시냅스에서 칼슘 전류는 전기 생리 학적 방법으로 직접 측정 할 수 있습니다 6 , 7 , 8 . 신경근 접합부 (NMJ)의 경우 신경 말단의 미세한 크기 때문에 직접 패치 클램프와 2 전극 전압 클램프 기술을 사용할 수 없습니다. NMJ의 신경 말단에서 내부 칼슘 2+ 전류의 기록은 간접 전기iological 방법 9 , 10 . 그러나, 이러한 방법은 나트륨 및 칼륨 이온 채널 차단제에 의한 시냅스의 전처리가 필요합니다. 광학적 방법은 신경 말단의 이온 전류를 약리학 적으로 분리 할 필요가 없으며, 활동 전위에 의해 유발 된 칼슘 이온 + 유입의 기록을 허용하고, 칼슘 이온 (axoplasm) 11 , 12 , 13 , 14 의 칼슘 이온의 상승을 허용한다. 이 방법은 자유 Ca 2+ 이온 15 , 16 , 17 , 18 , 19 의 결합시 특정 Ca 2+ 감응 염료의 형광 변화를 기록한 것입니다. 칼슘 2 + 지시약을 C에 넣을 수 있습니다.실험의 목적에 따라 다양한 방법으로 나타납니다. 연구원은 멤브레인 투과성 염료 형태 20 , 21 , 패치 피펫 22 또는 마이크로 인젝션 23 , 24 , 25 를 통해로드하는 욕조 응용을 사용합니다. 그러나 이러한 모든 방법들은 시냅스 건축가의 특이성 때문에 NMJ의 경우 약간의 제한이있다. NMJ의 경우, 가장 편리하고 성공적인 방법은 염색제를 신경 그루터기에 넣는 것, 전방 채움 방법 26 , 27 , 28 , 29 입니다. 이 기술은 말초 신경 종말에 다양한 형광 염료를로드하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 Drosophila 신경 말단 28 , 도마뱀 운동 신경28 ) 및 개구리 모터 신경 터미널 ( 17 , 26 , 27 , 30)을 포함한다 . 연구 대상에 따라 체계적인 세부 사항이 다를 수 있습니다. 유리 마이크로 피펫은 애벌레 28의 작은 신경에 사용할 수 있습니다. 몇몇 연구자들은 근육을 신경 주입하는 신경 끝이 염료로 미리 채워진 우물에 잠겨있는 방법 27 , 28 을 기술했다. 염료를 담그기 위해 몇 시간 동안 방치한다. 염료는 축색 돌기에 흡수되어 신경 말단으로 옮겨집니다. 이 논문에서는 개구리 모터 신경 말단에 형광 표시기를 삽입하는 방법을 설명한다. 우리의 프로토콜은 염료와 조직의 부화를 위해 플라스틱 피펫 팁을 사용합니다. 우리는 또한 칼슘 2 + 형광 트랩을 수집하고 분석하는 방법을 설명합니다nsients.

<table><tbody><tr><td>Ca2+ indicator</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806</td><td>500 &amp;mu;g</td></tr><tr><td>Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning, USA</td><td>Sylgard 184 elastomer</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Biohit, Russia</td><td>720210</td><td>0.5-10&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Pipette tip</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>02-707-175</td><td>10&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Pipette tip</td><td>Biohit, Russia</td><td>781349</td><td>10&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine scince tools, Canada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Corneal Mini-Scissors</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>S-1111</td><td></td></tr><tr><td>Jeweler Forceps</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>F-9610</td><td></td></tr><tr><td>Jeweler Forceps</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>F-9611</td><td></td></tr><tr><td>Modelling clay</td><td>local producer</td><td></td><td>can be replaced by any local producer</td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>local producer</td><td></td><td>can be replaced by any local producer</td></tr><tr><td>Microspin FV 2400&amp;nbsp;</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Multi-spin MSC 3000</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Single-use hypodermic needles</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0.4&amp;times;40mm</td></tr><tr><td>Syrynge</td><td>local producer</td><td></td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Microscope, BX51</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Digitdata 1550</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>pClamp software, Version 10</td><td>protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with.&lt;br/&gt; RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td></tr><tr><td>Bath and bath temperature controler</td><td>Experimental Builder</td><td></td><td>can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Till Photonics, Germany</td><td>Polychrome V</td><td>no longer available, can be replaced by other&amp;nbsp;&amp;nbsp; sutable stable light source 488 nm</td></tr><tr><td>monochromator control software</td><td>Till Photonics, Germany</td><td>Polycon</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Redshirt imaging, USA</td><td>Neuro CCD SMQ</td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 Isolated Pulse Stimulator</td><td>A-M Systems, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition software for CCD camera</td><td>Redshirt imaging, USA</td><td>Turbo SM software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Spreadsheet program</td><td>Microsoft, USA</td><td>Microsoft Office Excel&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction

시냅스 전 신경 말단에서 시냅스 전 칼슘 농도를 측정하는 가장 실현 가능한 방법 중 하나는 광학 기록입니다. 이것은 세포 내 자유 칼슘 농도에 따라 방출 강도 또는 파장을 변화시키는 칼슘 - 민감성 형광 염료를 사용하는 것을 기본으로합니다. 칼슘 염료로 세포를 얼룩지게하는 데 사용되는 몇 가지 방법이 있습니다. 가장 일반적으로 마이크로 피펫을 통해 염료를 로딩하거나 염료의 아세 톡시 메틸 에스테르 형태로 사전 배양하는 과정이 일반적입니다. 그러나 이러한 방법은 발생하는 방법 론적 문제로 인해 신경근 접합부 (NMU)에 적용 할 수 없습니다. 이 기사에서는 칼로리 감수성 염료를 개구리 신경의 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 제시합니다. 신경 말단에 외부 칼슘이 들어가고 칼슘 염료에 결합하는 것이 밀리 초 단위로 발생하기 때문에 빠른 상호 작용 시스템을 사용하여 이러한 상호 작용을 기록 할 필요가 있습니다ns. 여기에서는 빠른 CCD 카메라로 칼슘 과도 현상을 기록하기위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

염료 로딩과 운동 신경 자극 후 형광 신호 (Ca 2+ 과도 현상)의 진폭이 신경 말단에서 감지 될 수 있습니다 ( 그림 2 참조). Ca 2+ 과도 현상의 매개 변수가 표 1 에 나와 있습니다. 정량적으로, 본 연구에서 측정 된 Ca 2+ 과도 현상의 매개 변수는 냉혈 동물의 시냅스에서 다른 과학자들이 얻은 데이터에 가깝다. Ca 2+ 과도 현상의 매개 변수는 Ca 2+ 와 염료의 결합 속도와 그 후의 해리에 달려있다. Ca 2+ 가 신경 종결에 들어가는 속도, 염료와의 상호 작용 및 세포질 내 확산은 모두 Ca 2+ 과도 현상의 상승 시간에 영향을 미친다. 형광 신호의 감쇠 시간은 염료의 친 화성,세포 내 완충액과의 Ca 2+ 상호 작용 및 이온 펌프에 의한 제거 35 . Ca 2+ 과도 현상의 진폭 분석은 신경 전달 물질 방출에 참여하는 칼슘 입구에 다양한 물질의 영향을 연구하는 데 사용될 수 있습니다 33 . <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" /> 그림 2 : 평균 Ca 2+ 과도는 개구리 NMJ에서 측정. 칼슘 2+ 과도 현상은 13 마리의 개구리 NMJ 신호의 평균을 기준으로 계산되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 피크ΔF / F (%) </td><td> 상승 시간 20 % -80 % (ms) </td><td> τ (ms) </td></tr><tr><td> 12.6 ± 1,1 (n = 13) </td><td> 4.6 ± 0.5 (n = 13) </td><td> 115.3 ± 8.3 (n = 13) </td></tr></tbody></table> 표 1 : Ca 2+ 과도 현상 의 평균 매개 변수 . 데이터는 평균 ± SE로 표시됩니다. n은 별개의 NMJ에서 측정 한 횟수입니다. 피크 ΔF / F는 ΔF ​​/ F의 평균 진폭입니다.

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Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다.

칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

loading-calcium-dye-into-frog-nerve-endings-through-nerve-stump

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K 조회수.  Russian Academy of Sciences.  여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다. 

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Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

연구

생물학

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

생화학

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

신경과학

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

발생학

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them water-soluble with the ability to reversibly enter and exit membrane lipid bilayers. These styryl dyes are relatively non-fluorescent in aqueous medium, but insertion into the outer leaflet of the plasma membrane causes a &#62;40X increase in fluorescence. In neuronal synapses, FM dyes are internalized during SV endocytosis, trafficked both within and between SV pools, and released with SV exocytosis, providing a powerful tool to visualize presynaptic stages of neurotransmission. A primary genetic model of glutamatergic synapse development and function is the Drosophila neuromuscular junction (NMJ), where FM dye imaging has been used extensively to quantify SV dynamics in a wide range of mutant conditions. The NMJ synaptic terminal is easily accessible, with a beautiful array of large synaptic boutons ideal for imaging applications. Here, we compare and contrast the three ways to stimulate the Drosophila NMJ to drive activity-dependent FM1-43 dye uptake/release: 1) bath application of high [K+] to depolarize neuromuscular tissues, 2) suction electrode motor nerve stimulation to depolarize the presynaptic nerve terminal, and 3) targeted transgenic expression of channelrhodopsin variants for light-stimulated, spatial control of depolarization. Each of these methods has benefits and disadvantages for the study of genetic mutation effects on the SV cycle at the Drosophila NMJ. We will discuss these advantages and disadvantages to assist the selection of the stimulation approach, together with the methodologies specific to each strategy. In addition to fluorescent imaging, FM dyes can be photoconverted to electron-dense signals visualized using transmission electron microscopy (TEM) to study SV cycle mechanisms at an ultrastructural level. We provide the comparisons of confocal and electron microscopy imaging from the different methods of Drosophila NMJ stimulation, to help guide the selection of future experimental paradigms.

Synaptic vesicle (SV) cycling is the core mechanism of intercellular communication at neuronal synapses. FM dye uptake and release are the primary means of quantitatively assaying SV endo- and exocytosis. Here, we compare all the stimulation methods to drive FM1-43 cycling at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) model synapse.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

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