Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. 펠리클과 바이오 필름 콜로니 형성에 작은 분자 억제제의 효과 평가 <ol><li> 칼슘 염화 철 (III) 클로라이드 수화물없이 정의 생물막 유도 MSgg 매체 (25)의 2 배 솔루션을 준비합니다. 여과 멸균 한 후, 염화칼슘을 추가한다. 매체는 직접적으로 사용할 준비가되거나 어둠 속에서 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 실험의 날에 1 배 MSgg 희석을 준비합니다. <ol><li> (멸균 증류수 (펠리클) 또는 멸균 3 %의 고온 (80 ℃) 한천 (생물막)와 1 배 50 μM (펠리클) 또는 250 μM의 최종 농도로 철 (III) 클로라이드 수화물을 추가 배 MSgg 매체 희석 바이오 필름). 원하는 농도로 항생제 또는 작은 분자 억제제를 넣고 잘 섞는다. 예를 들어, 펠리클 또는 생물막을 확립 76.3 밀리미터 (10 ㎎ / ㎖) D 류신 원액 196.6 μL를 추가 30 ㎖ 0.5mm의 D 류신의 최종 농도를 얻었다. 아니TE는 :. 최종 1X MSgg 조성물은 표 1에 설명되어있는 원래의 레시피 (25)에 비해, 배지를 50㎍ / 트레오닌 mL 및 고체 MSgg 매체에 생물막 콜로니를 성장 철 농도가 주름 콜로니 형태를 최적화하기 위해 2.5 배 증가 하였다 포함 . </li></ol></li><li> 한천의 고화 후, 접종 전에 30-45 분간 생물학적 후드 고체 MSgg 판을 건조. </li><li> 박막 형성 (그림 1)의 메커니즘을 방해 특정 억제제를 선택하려면, 사용 농도는 플랑크톤 및 정적 성장에 영향을 미치는 것을 배제. <ol><li> 고정 성장 단계까지 600 nm에서 매 시간마다 광학 밀도를 측정하여 단순 성장 곡선에서 플랑크톤 성장 (액체 배양 시간에 따른 광학 밀도의 증가)를 결정합니다. </li><li> (CFU)를 측정 배양 탁도 생균 수를 나타내는 것을 확인 집락 형성 단위의 수를 결정하기 위해여러 시점 이후 진탕 배양에서 플랑크톤 성장 단계에서 세포. </li><li> 또한, 동일한 조건에서 접종 섹션 1.7-1.9에서 설명한 바와 같이 24 웰 세포 배양 물에서 23 ℃에서 3 일간 배양 한 끝에 고정 펠리클 성장 수확 세포 소분자 억제제의 효과를 평가 그리고 CFU를 결정한다. 이 컨트롤의 경우, 세포 외 기질 구성 요소에 대한 코딩하는 오페론이 부족 펠리클 결핍 균주를 사용하여 (즉, B. 서브 틸리 Δ epsH, Δ TASA). 주 :이 균주는 정적 조건에서 성장시킬 수 있지만 펠리클 형성 야생형 달리 그 성장이 증가 된 산소 농도 26 호의 액체 - 공기 계면에 부유 할 수있는 능력의 부족이다. 따라서,이 세포 외 매트릭스 - 및 펠리클 결핍 균주는 정적 조건에서 성장을 평가하는 추천 기준 균주이다. 주 : 특정 예를 들어비표준 D-D 아미노산 류신이 충분한 펠리클 형성 12,17 배제 된 간섭 농도 아래 플랑크톤 정적 성장에 영향을 설명했다. 플랑크톤 및 정적 성장을 결정하는 방법을 상세하게도 17에서 설명된다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> 그림 1. 강력한 실험 장치의 식별을위한 개념적 개요 biofilm 형성의 구체적인 억제를 평가하기 위해. 플랑크톤 성장에 뚜렷한 효과없이 생물막 형성 특정 간섭을 나타내는 작은 분자 억제제에 대한 선택 기준을. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.</a> <ol start="5"><li> B. 밖으로 행진 -80 ° C 형 재고 서브 틸리 스 (LB의 cultu20 % 글리세롤에 얼의 재 109 세포 / ㎖)을 멸균 팁 또는 스틱 어플리케이터와 LB-1.5 % 한천 플레이트 상에 단일 콜로니를 분리한다. </li><li> 30 ℃에서 하룻밤 성장. </li><li> CRITICAL STEP : 예 D 류신과 같은 비표준 D - 아미노산에 의해 견고 펠리클 저해 단일 콜로니는 4 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ LB 배지에서 LB-1.5 % 한천 플레이트에서 고른 성장 인큐베이터를 흔들어 (속도 200 rpm으로 진탕). 조심스럽게 상층 액을 제거하고 1.5 ml의 MSgg 매체에 펠렛을 다시 중단, 6,000 XG에서 4 분 동안 1.5 ml의 스타터 문화를 원심 분리하여 접종 이전에 생물막 유도 MSgg 매체와 LB 배지를 교체합니다. 문화의 나머지는 폐기 될 수있다. 중요 : 시스템의 안정성을 보장하기 위해, 세척 스타터 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도가 0.6과 1 사이 여야합니다. </li><li> 스타터 문화의 성장하는 동안, 12 웰 세포 배양 multidish 판 containin을 준비이없는 또는 작은 분자 억제제 (예, 0.3, 0.5, 1 mM의 D 류신 17)의 농도 범위 MSgg 배지 3 ㎖ g. 가장자리 효과를 배제하기 위해, multidish 접시에 걸쳐 서로 다른 농도의 위치를 ​​배포 할 수 있습니다. 또한, MSgg 매체의 1.5 ml에 포함 된 24 웰 세포 배양 multidish 플레이트를 사용합니다. </li><li> (1,000 희석 1) 세척 스타터 문화의 3 μL와 12 웰 세포 배양 multidish 판의 우물을 접종한다. 주 : 낮은 희석 비율, 즉, 1 : 500이 사용될 수있다. 이 펠리클의 개발 시간을 감소시킨다. </li><li> 사흘 동안 정적 상태에서 23 ° C에서 펠리클 성장. 이 펠리클의 최종 표면 형상에 영향을 미칠 수 있기 때문에,이 시간 동안 펠리클을 움직이지 않는다. </li><li> 번개의 양안 및 균일 한 노출 사진을 획득. 대안 적으로, 고해상도 카메라와 펠리클의 사진을 촬영. inconsis에 의한 유물을 방지하려면텐트 빛의 각도와 그림자, 삼각대에 고정 된 카메라로 위에서 아래로 사진을 찍고 양쪽에서 45 °에서 부드럽고 큰 광원을 사용합니다. 참고 : B를 공부하는 다른 방법 서브 틸리 다세포 고체, 바이오 필름 유도 MSgg 매체에 생물막 식민지 분석이다. 펠리클과 마찬가지로,이 분석은 시공간 과정의 연구를 할 수 있습니다. 소분자 저해제의 유효 범위가 결정되면, 생물막 콜로니 형성에 미치는 영향을 연구 할 수있다. </li><li> 8.5 cm 직경의 페트리 접시 당 4 방울 - 생물막 식민지를 성장, 대칭 씻지 사전 문화의 1.5 μL 템플릿의 도움으로 건조 MSgg 1.5 % 한천 플레이트에 (단계 1.7) 자리. 방울 그들을 이동하기 전에 판에 흡착 할 수 있습니다. 참고 : 템플릿은 세포가 재배되는 지역 내 바이오 필름 식민지의 동일한 분포를 얻을 수 있습니다. 템플릿을 준비하려면, 원래 규모에서 성장의 전체 면적을 그릴 동일한 종파로 분할ORS과 중앙을 표시합니다. 8.5 cm 직경의 원형 페트리 접시의 경우,이 14 cm 2 일 생물막 식민지를 지정합니다. </li><li> 사흘 동안 30 ° C에서 접시를 품어. 이 시간 동안, 생물막 콜로니 개발 입체 주름 구조를 형성한다. </li><li> 단계 1.11에서와 같이 사진을 촬영합니다. </li></ol> 2. 에탄올 저항 분석 <ol><li> 단계 1.1-1.7 및 1.12-1.14의 설명에 따라 생물막 성장. </li><li> 30 ° C에서 성장의 68 시간 후, 면도날과 템플릿의 도움으로 동일한 두 부분으로 생물막 식민지를 잘라. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> 도 2 실시 예 살균제에 생물막 콜로니 셀의 저항을 평가하기위한 실험 설계. 페트리 접시에 걸쳐 생물막 콜로니 동일한 분배 절단에 사용되는 (A) 템플릿. (B)처리되지 않은 야생형 생물막의 하향식 이미지는 30 ℃에서 고체, 정의 생물막 유도 MSgg 매체에 68 시간 동안 성장. 확대는 생물막 식민지 두 개의 동일한 절반으로 절단하는 방법을 보여줍니다. (C)은 두 개의 동일한 생물막 절반은 동일하게 (제어, PBS)을 치료 또는 PBS 또는 살균제 중 하나와 설명에 따라 처리됩니다. 스케일 바 :. 1cm <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 조심스럽게 작은 주걱 한천 플레이트에서 콜로니 생물막의 각각의 절반을 올려 인산 완충 용액 (PBS) 500 ㎕를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 이동합니다. 필요하다면, 플레이트에 남아있는 세포를 긁어 아니라 마이크로 원심 튜브로 옮긴다. 주 : 생물막 콜로니 후반전, 차분 처리는 제어 여부에 따라 또는 steri에 대한 내성을 테스트하는 것이다LIZING 에이전트. </li><li> 제어의 경우, 단계 2.3에서와 같이 500 ㎕의 PBS에서 생물막 식민지의 두 번째 절반을 품어. , 멸균 제에 대한 내성을 평가하는 500 ㎕의 50 % (v / v)의 에탄올 생물막 콜로니의 후반을 전송한다. 참고 : 예컨대 차아 염소산 나트륨 등의 대안의 살균제를 사용할 수있다. 사용 된 모든 살균 에이전트의 경우, 예비 실험의 활성 농도 및 배양 시간을 결정합니다. </li><li> 실온에서 벤치 탑에서 10 분 동안 생물막 콜로니 부화. </li><li> 18,000 XG에서 5 분 동안 생물막 식민지를 원심 분리기 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거합니다. PBS 300 μl를 추가합니다. </li><li> 소니 케이의 마이크로 팁과 세포 온화 (진폭 10 %, 펄스 5 초) sonicate하세요. 주 : 초음파 에너지가 별도의 생물막 집계에 충분해야한다. 그러나, 지나치게 강한 초음파가 세포 용균있다. 광학 현미경 초음파 에너지에 의해 사전에 확인세포를 용균하지 않습니다 사용하고 모든 집계 용해됩니다. </li><li> 1 ML의 최종 볼륨 PBS 700 μl를 추가합니다. PBS (10 -7) 일련의 희석을 수행하고 멸균 유리 비드를 사용하여 LB-1.5 % 한천 플레이트 상에 3 희석액 100 ㎕를 확산. 주 :이 살균제에 응답 관심 및 세포 생존율의 생물막 콜로니 세포의 양에 따라, 상기 최적의 희석은 도금 될는 예비 실험에서 결정되어야한다. </li><li> 하룻밤 30 ° C에서 접시를 품어 CFU를 계산하고 CFU에게 / ㎖를 결정한다. 각 반 생물막 식민지의 최종 CFU / ㎖에서 생존자의 비율을 계산합니다. 주 : 실시 분석 한 바와 같이 대칭 또는 콜로니의 저항 값을 확인하는 제어 생물막 콜로니의 반쪽과 생존 세포 수의 10 % 이하의 차이를 산출한다 미처리 생물막 콜로니 에탄올 처리 절반 대 비 처리 , respectively. 대안 적으로, 결과는 전체 CFU로 표현 될 수있다. 제어 및 미처리 생물막 집락의 세포 수는 동일한 정도의 크기로 유지한다. 반대로, 작은 분자 처리 생물막 콜로니의 에탄올 처리 절반의 세포 수는 살균제로 증가 된 감도 항에 2 차의 크기를 최소로 감소 할 것으로 예상된다. </li></ol> 주사 전자 현미경 3. 바이오 필름 식민지 샘플 준비 <ol><li> 단계 1.1-1.7 및 1.12-1.14의 설명에 따라 생물막 식민지를 성장. </li><li> 2 % (v / v)의 글루 타르 알데히드, 100mM의 3 % 나트륨 cacodylate의 (v / v)의 파라 포름 알데히드 용액을, 5 mM의 염화 칼슘 완충액, pH가 7.3의 신선한 배치를 준비한다. 8.5 cm 직경의 모든 페트리 접시에 대한 정착액 5 ㎖를 준비합니다. 주의 : 글루 타르 알데히드 및 ​​파라 포름 알데히드는 유해하다. 화학 후드 내부에 안전 장비로 처리합니다. HAZ의 솔루션과 오염 물질을 폐기농사 폐기물. </li><li> 조심스럽게 바이오 필름 위에 직접 분배하지 않고, 생물막 식민지에 정착을 추가합니다. 참고 : 생물막 식민지의 소수성 특성으로 인해, 식민지 천천히 한천에서 분리하고 떠 시작합니다. </li><li> 조심스럽게 파라 필름의 스트립 판을 밀봉. 실온에서 2 시간 동안 회전 진탕 기에서 인큐베이션하고이어서 밤새 39 ° C로 플레이트를 옮긴다. </li><li> 다음 날, 조심스럽게 진공 펌프에 연결 파스퇴르 유리 피펫으로 액체를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 바이오 필름을 씻고 5 분 동안 배양 10 ml의 100 mM의 나트륨 cacodylate, 5 mM의 염화칼슘 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 바이오 필름의 손상을 방지하고 부드러운 피펫으로 신선한 세척 솔루션을 추가 할 판의 모서리에서 파스퇴르 유리 피펫으로 액체를 제거합니다. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 생물막 콜로니 탈수 다음 단계로 진행 DDH 2 O 2 배에 5 분; 3 배 20 분0 % 에탄올; 배 20 분 50 %의 에탄올; 배 20 분 70 %의 에탄올; 배 20 분 96 %의 에탄올; 2 × 100 % 에탄올에서 30 분. <ol><li> 각 단계에서 8.5 cm 직경의 모든 페트리 접시에 대한 액체의 15 ML을 추가하고주의 깊게 각 배양 후 액체를 제거합니다. </li></ol></li><li> 에탄올에서 샘플을 건조하기위한 두 가지 방법 중 하나를 사용합니다. <ol><li> 에탄올 항공 건조의 경우 : <ol><li> 분기 셀룰로오스 여과지 (직경 9cm의)을 잘랐다. 간단히 100 % 에탄올에 1/4 잠수함, 다음 조심스럽게에 하나의 부동 생물막 식민지를 전송합니다. 여과지 줄 지어 페트리 접시에 젖은 필터 용지를 넣습니다. 페트리 접시를 덮고 생물막 식민지에게 화학 후드에서 건조 하룻밤을 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 전이 유체로서 이산화탄소 (CO 2)를 사용 -drying 임계점 (CP)의 경우 : <ol><li> 100 % 에탄올 임계점 건조기 챔버의 75 %를 채운다. 자신의 C에, 홀더에 각각의 샘플을 샘플로 이동hamber. 필요한 경우, 작은 조각으로 가위로 바이오 필름을 잘라. 모든 취급시 에탄올에 빠져들 샘플을 남겨주세요. 그 후, 챔버로 홀더를 전송하고 단단히 챔버를 닫습니다. </li><li> 7 ° C까지 챔버를 냉각 교반 시작합니다. 액체 CO 2와 완전히 챔버를 입력합니다. 7 분 인큐베이션 시간 동안 CO 2와 에탄올 혼합하자. 이어서, 용액을 25 % 방출. 주 : 샘플의 수준 아래의 실을 버리지 말 것. </li><li> 단계를 반복 3.8.2.2 네 번. </li><li> 단계를 반복 3.8.2.2 5 분의 배양 시간에 다섯 번. 마지막으로 에탄올을 완전히 CO 2로 대체한다. </li><li> 챔버의 마지막 라운드, 빈 5 % 중. 교반 및 냉각을 끕니다. 42 ° C에 실을 가열 시작합니다. 31.1 ° C의 온도 및 73.9 bar의 압력에서, 액체 CO 2 임계점의 상태에 도달 여기서 기체 산도ASE는 용매 (27)의 액상과 동일한 밀도를 갖는다. 온도가 42 ° C에 도달하면, 10 분 동안 배양한다. 42 ° C에서, 챔버 내의 이산화탄소는 초 임계 기체로서 존재한다. 주 : 끊임없이 챔버의 압력을 확인합니다. 압력은 42 ° C에서 120 줄을 초과하지 않아야합니다. </li><li> 천천히 연속 난방 가스를 방출하기 시작합니다. 이것은 CO 2 - 가스 단계에서 샘플을 유지하고, 액체의 표면 장력을 통해 시료의 형태의 변형을 방지한다. 미세 조정하여 유량계를 제어하는 ​​계량 밸브를 5 리터 / h에 유량계를 설정합니다. 챔버 내의 모든 압력이 해제 될 때까지 기다립니다. 이제 챔버를 열고 홀더에서 조심스럽게 샘플을 제거합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 코트 카본 테이프 전자 현미경 토막. 핀셋의 도움으로 조심스럽게 그루터기에 바이오 필름의 식민지를 전송합니다. 차에서 얇은 다리를 추가하여 스텁 각 식민지 연결전자 빔에서 충전 제거를위한 중요 봉 테이프. 그들은 매우 깨지기 쉬운만큼이 단계에서주의하여 생물막 식민지를 처리합니다. 최소 24 시간 동안 또는 시험 때까지 데시 케이 터에서 샘플을 저장합니다. </li><li> 주사 전자 현미경 검사의 날은, 금, 팔라듐 스퍼터 코터에서 60 °의 각도에서 2 분간 생물막 콜로니 - 스퍼터 코팅. 두 번이 단계를 반복 사이에 120 °로 샘플을 돌립니다. 마지막에, 스퍼터 코팅 샘플을 일단 위로부터 3 분. 금 - 팔라듐 20 nm의 얇은 층은 도전성을 향상시키고 SEM의 영상에 대한 샘플의 콘트라스트를 향상시킨다. </li><li> 주 사형 전자 현미경 (29, 30)로 촬상 할 때까지 샘플 (28)의 재수 않도록 데시 케이 터에서 샘플을 저장한다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 형태 강력하고 고도로 구조화 된 생물막 모두 액체 (펠리클)와 고체 배지에 (식민지). 따라서, 특정 바이오 필름 저해제의 작용 모드를 특성화하는 이상적인 모델 생물로서 기능한다. 고체 배지에서 세포 가장자리에 중심에서 방사 주름 등 펠리클에서 알 수없는 고유 한 특징을 가진 다세포 구조를 형성한다. 따라서, 펠리클과 식민지 B.을 연구 ?...

다세포 세균 지역 사회는 자연 및 인위적 환경에서 중요한 역할을하고, 유익하거나 매우 유해 할 수 있습니다. 이러한 다세포 콜로니 개별 세포 자체 생산 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 매트릭스에 매립되는 것을 특징으로하는 바이오 필름으로서 알려져있다. 허가제 강하게들이 정착 표면에 세포를 접착. 그들은 기계적 및 화학적 힘에 대항하는 방패 역할 및 셀룰러 통신 1을 촉진, 인접 셀 사이에 긴밀한 연락을 만듭니다. 생물막은 세포가 고도로 규제 사용하십시오 차별화 된 커뮤니티로 볼 수있다, 종 2-5에서뿐만 아니라, 지역 사회 내에서 활동을 조정하는 프로세스를 조율. 생물막 상태로 성장 플랑크톤 자유 생활 모드 간의 전환은 종종 개발 프로세스와 관련된다. 좋은 예는 그람 양성 토양 박테리아 고초균 및 따라서 인 undomesticated 균주는 biofilm 형성을 유도하는 발달 단계를 연구하는 강력한 모델 생물 역할을한다. 이 박테리아에서, 운동성 세포는 전문적인 작업 4를 수행 눈에 띄는 다세포 구조로 자신을 구성 할 수 있습니다. 셀들의 하나의 그룹은 매트릭스 생산자 엑소 폴리 사카 라이드 6 분비 아밀로이드 단백질 TASA 7,8, 표면 소수성 단백질 BslA 9,10; 이는 모두는 EPS 11-13의 조립에 참여한다. 자연스럽고 인위적 틈새에 생물막의 풍부하고 일으킬 수있는 치명적인 손상 추정을 감안할 때, 그 형성을 방지하는 방법을 찾기 위해 가압 할 필요가있다. 소분자 억제제는 새로운 규제 경로, 효소 및 생물막 형성에 관여하는 구조 단백질의 발견에 도움이, 이에 다세포 커뮤니티 어셈블리의 복잡한 프로세스의 통찰을 촉진 할 수있다. B.으로 서브 틸리는 바이오 잘 연구 된 모델입니다성막 14,15, 다양한 생물막 억제제의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 연구는 작은 분자 억제제에 바이오 필름의 반응을 평가하기위한 중요한 4 개의 기본적인 방법을 다룹니다. 첫째,이 억제제는 생물막 특정 대상이 있는지 확인하기 위해, biofilm 형성에 미치는 영향에서 플랑크톤의 성장에 미치는 영향의 분리는 매우 중요하다. 대부분의 항균제는 플랑크톤 성장기에있는 세포를 표적으로하지만, 생물막 라이프를 대상 분자는 드물다. 플랑크톤의 성장에 영향을 미치지 않는 분자 독성이기 때문에 또한 이들은 항생제 내성 돌연변이 체 (16)를 선호 선택 압력을 감소시킬 수있다. 바이오 필름은 D 아미노산 또는 기타 특정 세포벽 간섭 분자로 처리하는 경우, 예를 들면, 그들은 어느 방해하거나 분해하지만, 이러한 억제제는 약간 플랑크톤 성장 12,17 영향을한다. 대조적으로, 많은 항생제 극적 리터와 플랑크톤 성장을 저해ittle 또는 biofilm 형성 (17)에 아무런 영향. 둘째, 작은 분자의 효과를 연구하는 일관되고 견고한 실험 프레임 워크를 확립하는 것이 중요하다. 우리는 소분자 억제제의 활성 농도 범위는 예비 배양 조건 이러한 소분자 저해제의 효과를 연구하기 위해 실험 구성에 민감한 것을 관찰 하였다. 특히이 B를 공부 각종 보고서, 부유 세균 바이오 필름 12,17-19 - 서브 틸리는 D-아미노산 펠리클의 형성을 억제하는 농도 범위의 변화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 여기에 제시된 결과는 다음과 같은 요소가 활성 농도 범위의 차이를 고려하는 것이 제안 : 예비 배양 조건 (후기 정지 20 성장기 대 로그 12,17) 예비 배양 조건에서 사용 된 배양 배지는 (풍부 정의 대 정의되지 않은 [루리아 국물, LB] [글루탐산 나트륨글리세롤, MSgg), 접종 비 접종 전의 상기 배지 특히 제거. 정적 펠리클의 성장 온도는 소분자 억제제 D 류신, 본 연구에 사용 된 대표 D 아미노산의 활성 영역에서 덜 중요한 역할을 나타내었다. 마지막으로, 한 번 생물막은 특정 바이오 필름 억제제, 강력하고 유익한 방법이 생물막 피트니스 이러한 억제제의 효과를 특성화하기 위해 필요로 처리됩니다. 생물막 콜로니 및 항균제 그들의 저항 내 단일 세포 (1) 효과 : 여기서, 독립적 소분자 억제제의 효과를 특징 화하는 두 가지 방법이 상세히 설명된다. 자유 살아있는 박테리아 21-23에 비해 생물막의 셀은 전형적으로 더 많은 항생제 내성한다. 이 현상은 인성이지만, 항생제 침투를 줄이기위한 EPS의 능력은 종종 매력 설명 24 여겨졌다 </suP&gt;. 이 방법은 항균성 물질에 노출 된 후 미리 설정된 생물막 세포의 생존율을 평가한다. (2) 작은 규모에 큰에서 생물막 식민지 아키텍처에 미치는 영향. 생물막 콜로니는 입체 구조와 EPS의 존재를 특징으로한다. 주사 전자 현미경을 이용하여, 세포 형태, 생물막 콜로니 구조 및 EPS의 구조 및 다량의 변화는 작은 크기 (μm의)에 큰 (mm)에서 가시화 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="897">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Luria Broth, Lennox</td>
			<td style="width:305px;">Difco</td>
			<td style="width:127px;">240230</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Merck, 203.30 g/mol&#160;</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride anhydrous</td>
			<td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td>
			<td>1311-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma, 197.91 g/mol</td>
			<td>31422-250G-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iron(III) chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 270.30 g/mo)</td>
			<td>F2877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zinc chloride anhydrous&#160;</td>
			<td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td>
			<td>424592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma, 337.27 g/mol</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tryptophan</td>
			<td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td>
			<td>BP395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma, 165.19 g/mol</td>
			<td>P5482-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Sigma, 119.12 g/mol</td>
			<td>T8625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol anhydrous</td>
			<td>Bio-Lab Itd</td>
			<td>712022300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamic acid monosodium salts hydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>G1626-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-leucine</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>855448-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol anhydrous</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">razor blade</td>
			<td>Eddison</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">circular cellulose filter papers</td>
			<td>Whatman, 90 mm</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutaraldehyde</td>
			<td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMS, 16% in water</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium cacodylate</td>
			<td>Merck, 214.05 g/mol&#160;</td>
			<td>8.2067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride 2-hydrate</td>
			<td>Merck, 147.02 g/mol&#160;</td>
			<td>1172113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stub-aluminium mount</td>
			<td>EMS, sloted head</td>
			<td>75230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">carbon adhesive tape</td>
			<td>EMS</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker 37&#176;C</td>
			<td>New Brunswick Scientific Innowa42</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:301px;">Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td>
			<td>Branson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 30 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 23 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter System, 500 ml, polystyrene</td>
			<td>Cornig Incorporated</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S150 Sputter Coater&#160;</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPD 030 Critical Point Dryer</td>
			<td>BAL-TEC</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Environmental Scanning Electron Microscope</td>
			<td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

펠리클 분석은 B의 높은 규제 및 동적 프로세스를 연구하는 하나의 방법이다 서브 틸리 다세포. 이 외에, 펠리클 분석 한 실험에서 단일 세포 배양 multidish 접시에 미리 시동 조건 또는 소분자 어느 농도의 범위를 테스트하는 데에 적합하다. 그러나, B. 서브 틸리 펠리클 형성은 예비 배양 조건에 민감하다 (예를 들어, 예비 - 배양의 성장 배지 및 성장 단계) 접종 비와 미리...

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.0K 조회수.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

마우스의 재발 포진 성 각막염 Stromal, 인간 HSK 유학을위한 모델

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

유학을위한 방법론

요약

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