Name: high-throughput screening of carbohydrate-degrading enzymes using novel insoluble chromogenic substrate assay kits
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
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우리는 우수한 기술 지원을 촬영에 대한 자신의 실험실에 대한 액세스를 제공하는 교수 J. 폴 녹스 (리즈 대학, 영국), 수잔 E. 마커스에게 감사의 말씀을 전합니다. JS는 WallTraC 프로젝트 (유럽위원회 (European Commission) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (보조금 계약에는 인정하지 :. 263916)와 21 세기를위한 프로젝트 바이오 매스 (혁신 재단 덴마크, 사건 번호 : 103408)를 SKK가 SET4Future 프로젝트 (덴마크어 전략 연구위원회)를 감사하고, 전략 연구, 기술 및 혁신 (그랜트 케이스 번호 : 0603-00522B)에 대한 덴마크위원회에 대한 덴마크 의회에 의해 설립 된 바이오 값 전략 및 복합 다당류 시스템 (그랜트 케이스의 효소 분해를 이해하는 생물학 중심의 접근 없음 . :. 자금 107279)는이 논문은 저자의 의견을 정확하게 반영 유럽 연합 (EU)은 여기에 포함 된 정보로 제조 될 수있는 사용에 대한 책임을지지 않습니다..

96 웰 플레이트 형식의 CPH 기판 1. 원체 분석 <ol><li> 상기 분석 키트 판의 활성화 <ol><li> 교반없이 실온에서 10 분간 배양 한 다음, 각 웰에 (키트로 얻음) 200 ㎕를 활성화 용액을 첨가하여 분석 키트 플레이트 (자재 목록) (블루 CPH-자일란 함유)을 96 - 웰 필터 활성화. </li><li> 현존 활성 용액을 제거 (내부 스페이서 블록 표준, 포집 판 투명한 96 웰 플레이트)을 진공 매니 폴드를 사용하여 진공을 적용한다. 대신 진공 다기관이 단계에서 10 분 동안 2700 × g으로 원심 분리에 사용하는 것도 가능하다. </li><li> 100 ㎕의 멸균 수를 추가하여 CPH 기판을 세척하고 안정을 제거하기 위해 진공 (또는 원심력)을 적용한다. 이 단계를 두 번 더 반복 판은 이제 사용할 준비가 된 것입니다. </li></ol></li><li> 효소 반응 참고 : 항상 버퍼 포함혼자 음성 대조군과 같은 긍정적 인 컨트롤 가능한 이전에 특징 효소 경우. 복제의 통계적 해당 번호를 사용합니다. CPH 기판은 10.0의 pH 3.0, 180 μL를 초과하지 않아야 각 웰 퍼 단부 효소 용액 전량 사이에 안정하다. 식물 추출물 또는 배양액 대신 정제 된 효소 용액을 사용할 수있다. <ol><li> 150 ㎕의 100 mM 아세트산 나트륨 완충제, pH가 4.5 분석 키트 플레이트의 각 웰 (1 U / ㎖의 최종 농도) 5 μL 엔도 -cellulase 용액을 첨가. </li><li> 동안 진탕 반응 판의 잠재적 누출을 수집 분석 키트 플레이트 아래의 제품 판 (미세 적정 플레이트 판독기와 호환 분명 웰 플레이트)을 넣어. </li><li> 150 rpm에서 수평 진탕 기에서 30 분 동안 25 ° C에서 분석 키트 플레이트를 인큐베이션. 참고 : 배양하는 동안 분석 키트 판의 반응을 혼합 일관성과 생식을 달성하기위한 중요하다ducible 결과. CPH 기판을 90 ℃로까지 안정하다. CPH 기판과 알 효소 농도를 함유하는 배양 브로스를 테스트 할 때 배양 시간은 24 시간까지 증가한다. 적합한 배양 시간은 효소 (들)의 활성에 의존 유의하지만, 24 시간 내에 탐지 활동이 없으면 일반적으로는, 효소는 테스트 기판을 저하하지 않을 가능성이있다. 활성 효소는 색깔 뜨는로 볼 수 있습니다 수용성 발색 올리고당,로 CPH 기판의 불용성 발색 다당류를 분해한다. </li><li> 내부 스페이서 블록 진공 매니 폴드 내부의 청소 제품 판을 놓습니다. </li><li> 상단의 분석 키트 판을 놓고 진공 (-60 kPa의 최대 음압)을 적용합니다. 또한 10 분 동안 2700 × g으로 원심 분리에 사용하는 것도 가능하다. 참고 : 반응 생성물과 색 올리고당을 함유 한 여과 액은 추가 분석 (8)의 제품 판에 지금 </s&gt;입니다. </li></ol></li><li> 탐지 및 정량화 <ol><li> 제품 판의 각각의 웰 내의 액체의 체적은 약 육안으로 동일 함을 확인한다. </li><li> 플레이트 판독기를 사용하여 블루 CPH-크 실란에 대한 595 nm에서 수집 판의 흡광도를 참조하십시오. </li><li> 데이터 분석을 수행하는 경우, 효소를 첨가 한 웰의 값으로부터 상기 버퍼 전용 대조군 값을 뺀다. 복제 웰 (8)로부터의 평균값과 (SEM) 수단의 표준 오차를 계산한다. </li></ol></li></ol> 96 웰 형식의 ICB 기판 2. 원체 분석 <ol><li> 효소 반응 <ol><li> 150 ㎕의 100 mM 아세트산 나트륨 완충제, pH가 4.5 및 5를 첨가 μL 31 U / ㎖의 엔도 -xylanase (웰에서 최종 효소 농도 1 U / ㎖) 레드 ICB-밀짚을 포함하는 분석 키트 플레이트의 각 웰에 용액 . 참고 : 분석 키트 판 (96 웰 필터 (PL)문헌에 기술 된 바와 같이 ICB 기판을 포함 ATES)는 (재료의 목록 참조)에서 제조 한 것입니다. ICB 기판은 pH가 3.0 내지 10.0의 pH 범위를 갖는 완충제에서 안정하다. 항상, 음성 대조군으로 단독 버퍼 양성 대조군으로 상업 효소와 복제본의 통계적으로 적절한 번호를 사용할 수 있습니다. <ol><li> CPH 기판 플레이트와 같은 ICB 기판을 활성화하지만, 진공 여과 또는 원심 분리 한 다음 100 ㎕를 물로 3 회 세척하여 고정 장치를 제거하지 마십시오. </li></ol></li><li> 진탕 도중 기판 플레이트에서 잠재적 누출을 수집하기 위해 기판 ​​플레이트 아래에 제품 판을 넣는다. </li><li> 2 시간 동안 150 rpm으로 흔들면서 25 ℃에서 반응물을 인큐베이션. 참고 : 활성 효소는 색깔 뜨는로 볼 수 있습니다 수용성 올리고 사카 라이드,로 ICB 기판에 불용성 발색 다당류를 분해한다. ICB 기판은 90 ° C까지 안정하다. 배양 t이러한 배양 브로스 비 정제 된 효소를 사용하는 경우, IME는 24 시간까지 증가한다. </li><li> 내부 스페이서 블록 진공 매니 폴드 내부의 제품 판을 놓습니다. </li><li> 상단의 분석 키트 판을 놓고 진공 (-60 kPa의 최대 음압)을 적용하거나 제품 판의 우물에 분석 키트 판에서 제품을 여액에 원심 분리기를 사용합니다. 참고 : 반응 생성물과 색 올리고당을 함유 한 여과 액은 추가 분석 8 수집 판에 지금있다. </li></ol></li><li> 탐지 및 정량화 <ol><li> 수집 플레이트의 각 웰 내의 액체의 체적은 약 육안으로 동일 함을 확인한다. </li><li> 플레이트 판독기를 사용하여 붉은 ICB-밀 짚에 대한 517 nm에서 수집 판의 흡광도를 참조하십시오. </li><li> 데이터 분석을 수행 할 때 - 버퍼를 빼기 - 부정적인 제어 값을 우물의 값 어디에서 효소첨가 하였다. 복제 웰 (8)로부터의 평균값과 (SEM) 수단의 표준 오차를 계산한다. 주 : 알 효소 스크리닝의 경우에, 우리는 효소의 활성의 동적 범위에 대한 상세한 데이터를 획득하기 위해 일련의 희석을 제안한다. </li></ol></li></ol>

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96 웰 플레이트 CPH 기판 분석과 96 웰 ICB 기판 분석 (WO2015036000, 덴마크 PA 2015 70311)를 포함하는 출원이 특허 출원이 있습니다.

우리는 클로로 트리 아진 염료를 기반으로 멀티 CPH과 ICB 기판의 새로운 세대 (표 1의 기판의 전체 목록)을 사용하여 사용자 정의 설계 상업 분석 키트에 배치. 기질의 효소 소화 분석 용액 중의 검출하고 플레이트 리더 (9)를 사용하여 정량화 될 수있는 작은 가용성 염색 제품을 산출한다. 이 분석은 엔도 -acting 효소의 평가 및 분석의 감도 설계하는 다른 방법은 효소 엑소 -acting 11,12 가능한 반면 azurine 가교 (AZCL)를 사용 하나, 기판들 (10)과 유사하다. CPH뿐만 아니라 ICB 기판은 엑소 가장 가능성 -enzymes 의해 분해되지만큼 상기 분석 키트의 한계 때문에 염료 및 가교제 분자 (8)에서 발생하는 입체 장해에 엔도 -enzyme 활성의 검출에있다. 상기 분석은 96 아 행한다리터 형식과 개별 반응은 우물에서 이루어집니다. 반응물을 재현 데이터를 수신하도록 상기 플레이트에 혼합되어야한다. 얻어진 상층 액을 각 웰의 흡광도를 흡광 분석법을 이용하여 정량화 될 수있는 제품 판으로 필터링된다. 기본 원리 및 분석의 레이아웃이 분석은 기판을 갖는 분석 플레이트 (96 웰 필터 플레이트)로 구성된다.도 1에 도시되고, 효소와 인큐베이션 한 후, 상등액을 명확 웰 플레이트에 통해 여과되고 와 흡광도는 효소의 특이성 및 활동의 반 정량적 측정을 제공 읽습니다. CPH 기판을 사용하여이 스크리닝 분석법은 또한 수용성 반응 생성물 밤새 배양 후에 착색 할로 생성 한천 플레이트 형식으로 사용될 수 있음을 또한 도시하고있다. (8) 에서 입증 된 바와 같이 분석 키트는 정제 된 효소와 그들의 잠재력 측면 활동을 선별하는 데 사용할 수 있습니다도 2. 사이드 활동 번의 효소 및 무차별 특이성에서뿐만 아니라 분석 된 샘플은 상이한 효소 혼합물 및 시너지 효과를 연구 할 필요가 있다는 사실로부터 발생할 수있다. 이 이전의 연구에 도시 된 바와 같이 또한, 곰팡이 8뿐만 아니라 내인성 식물 효소 및 박테리아 (미발표)으로부터 효소 칵테일 장내 미생물 (13) 및 배양 브로스를 효소 원으로서 사용할 수있다. ICB 기판은 종종 미생물 붕괴 산업 공정에서 발생 세포벽 성분의 복합 혼합물을 다룬다. 이 기판은 다당류의 유용성을 평가하고 효과적으로보다 효율적으로 분해 출력 저하 칵테일을 최적화하는 방법에 대한 정보를 제공하도록 설계되었습니다. 그림에 나타낸 바와 같이 3 CPH 및 ICB 기판 측에 의해 효소 심사 측에서 사용할 수 있습니다 - 효소 특이성에 대한 풍부한 정보를 공개바람직한 기판 (CPH)보다 가깝게 자연 (ICB)에서 발견되는 거대 분자 어셈블리를 모방 바람직한 기판 이외에 다른 성분을 포함하는 자연적인 복잡한 컨텍스트 모두 D 작업. 여러 색상의 사용은 분석의 높은 처리량을 증가 multiplexity 여러 가지 기질에 대한 효소 활성을 동시에 검출 가능하다. 다른 염료의 스펙트럼은 단순 회귀 분석에 의해 기판 ​​및 다중 활동 형 육안으로 관찰 할 수있는 대부분의 경우에 해결 될 수있다. 이러한 실험 및 그 결과의 시뮬레이션 예는도 4에 도시되어있다. 이 분석 도구 및 응용 프로그램의 다양성을 잘 알 수없는 활동 효소와 문화 국물의 첫 번째 수준의 검사에 적합하다. 이 분석에서 가장 중요한 특징은 높은 처리량 사이트, 맞춤화, 사용의 간편성과 유연성이다. 그 마음에, w로전자 도구의이 소설 세트가 크게 개선하고 산업의 효소 심사 과정뿐만 아니라 학문적 응용 프로그램을 빠르게 것이라고 믿는다.

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8. 
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

<table><tbody><tr><td>assay kit plates</td><td>Glycospot</td><td></td><td>customized assay kit plates</td></tr><tr><td>activation solution</td><td>Glycospot</td><td></td><td>for activating CPH substrates</td></tr><tr><td>350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>5015</td><td>spacer block</td></tr><tr><td>96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 &amp;micro;m, clear, non-sterile</td><td>Millipore</td><td>MSHVN4510</td><td>assay plate</td></tr><tr><td>96-Well Microplates, Polypropylene</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>collection plate after washing the substrates</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>product plate</td></tr><tr><td>Diaphragm pump MZ 2 NT</td><td>Vacuubrand</td><td>732000</td><td>vacuum pump used with the vacuum manifold</td></tr><tr><td>Infors HT Ecotron</td><td>Infors HT</td><td>4950132 (Buch &amp;amp; Holm)</td><td>horizontal shaker</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>10067-750 (VWR)</td><td>96-well plate absorbance reader</td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>5017</td><td>vacuum manifold</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-cellulase (EGII) (&lt;em&gt;Trichoderma longibrachiatum&lt;/em&gt;)</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td>cellulase [&lt;em&gt;cel&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,4-mannanase (&lt;em&gt;Cellvibrio japonicus&lt;/em&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BMACJ</td><td>mannanase [&lt;em&gt;man&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,3-glucanase (&lt;em&gt;Trichoderma spp.&lt;/em&gt;)</td><td>Megazyme</td><td>E-LAMSE</td><td>&amp;beta;-glucanase [&lt;em&gt;glu&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,4-D-galactanase (&lt;em&gt;Aspergillus niger&lt;/em&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-EGALN</td><td>galactanase [&lt;em&gt;gal&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-&amp;beta;-1,4-xylanase M4 (&lt;em&gt;Aspergillus niger&lt;/em&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-XYAN4</td><td>xylanase [&lt;em&gt;xyl&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;endo&lt;/em&gt;-xyloglucanase (GH5) (&lt;em&gt;Paenibacillus sp.&lt;/em&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-XEGP</td><td>xyloglucanase [&lt;em&gt;xg&lt;/em&gt;]</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amylase (&lt;em&gt;Bacillus licheniformis&lt;/em&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BLAAM</td><td>amylase [&lt;em&gt;amy&lt;/em&gt;]</td></tr></tbody></table>

high-throughput screening of carbohydrate-degrading enzymes using novel insoluble chromogenic substrate assay kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

높은 처리량이 분석의 다중 용량은 96- 웰 필터 플레이트를 배치 발색 불용성 중합체 (또는 단백질) 겔 (CPH) 기판들에 기초한다. 효소뿐만 아니라 음성 대조군은 분석 키트 플레이트 (도 1a)에 첨가하고, 효소는 착색 된 상등액 (도 1b)를 제조 해당 기판을 저하. 반응이 종료 된 후, 상청액을 투명한 제품 웰 플레이트로 이송하고, 흡광도를 96 웰 플레이트 (도 1C)에 적합한 분광 광도계를 사용하여 직접적으로 측정 될 수있다. 효소의 상이한 농도에서 자일라나에 CPH-아라비 복용량 응답의 예 (0.00-0.75 U / ml)을 감소 효소 농도를 시각적으로 관찰 할 수있는 위치도 1d에 도시되어있다. 보다 상세한 분광 정량적형 치수 효소 농도 (도 1E) 대 흡광도을 플롯 할 수있다. 신호 강도는 효소 활성에 대응한다. 분석의 재현성 오차 막대으로 나타낸다 (평균의 표준 오차, SEM 세 복제본). 이 분석의 재현성에 대한 자세한 실험은 다른 곳에서 8 게시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig1.jpg" /> CPH-아라비. A)를 CPH 기판 (로 분석 키트 판하는 방식의도 1 크 실라 아제 처리 예 CPH-아라비 단지 효소 1 및 2 버퍼를 첨가하기 전에 96- 웰 필터 플레이트의 웰에로드) - 단지 제어 (효소 1 엔도 -xylanase 활동을했다); C) 진공 보조 filtrat시, 효소 1로 CPH-아라비의 B) 저하는 색깔의 상층 액을 생산제품 판에서의 상등액의 이온은 흡광도를 분광 광도계로 측정하고, D) 제품 판을 100 밀리미터의 엔도 -β-1,4- 크 실라 아제의 상이한 농도의 4 가지 색상 CPH-아라비 치료 후 반응 생성물을 포함 아세트산 나트륨 완충액, pH가 4.5을 실온에서 60 분간;. E) 측정법을 사용하는 D로부터의 반응 생성물의 정량 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54286/54286fig1large.jpg" target="_blank">이 도면의 확대를 보려면 여기를 클릭하세요.</a> 효소 검사에서이 분석을 사용하기위한 다른 옵션이 있습니다. 하나의 옵션은 예를 스크리닝하는 다른 다당류, 알 활성 (정제) 엔도 -enzymes 소수를 포함하는 96 웰 플레이트를 사용하는 것이다. 이 경우 결과 degrad있는 다당류 보여줄 것이다대상 효소에 의해 수 있습니다. 이 원리를 표시하기 위해, 엔도 -cellulase는 25 ° C에서 다른 CPH 기판에 대해 시험 하였다. (1.0 U / ㎖, 5 U / ㎖ 0.5 U / ㎖) 세 가지 효소 농도를 30 분 동안 배양 하였다. 그 결과, 제품 판 (도 2A)에서 명확하게 볼 수있다. 공급 업체에서 제공 -cellulase이 엔도의 제품 시트는 크 실로 글루칸 (타마 린드)에 대한 측면 활동, 보리 β 글루칸, 글루코만난, 버치 우드 자일란과 갈 락토 만난 낮은 쪽 활동을 지정합니다. 이과 일치, 셀룰라아제에 추가 활동이 CPH-β 글루칸 (보리)에 발견 된, CPH-크 실로 글루칸 (타마 린드) CPH-갈 락토 만난 (그림 2B)에 대한, CPH-크 실란 (비치 우드)과 낮은 활동. 글루코만난은 테스트되지 않았습니다. 이전보다 동일한 조건에서 양성 대조군으로 사용했을 때와 동일한 CPH 기판 상용 가능한 효소 (0.5 U / ㎖ 1.0 U / ㎖ 0.1 U / ㎖, 세 가지 효소의 농도)로 소화했다실험. 모든 기판은 양성 대조군의 효소에 의해 분해하고, 신호 강도가 높은 효소 농도 (도 2c)에 대응하여 증가 하였다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig2.jpg" /> 도 2 8 개의 CPH 기판은 상이한 농도에서 30 분. A) 엔도 -cellulase로 분해 다른 CPH 기판 제품 판에 대해 25 ℃에서 교반하면서 배양 하였다. B) 활성 및 다양한 측면 활성의 정량 엔도 -cellulase. . E-LAMSE과 CPH-pachyman, CPH-카드 란, CPH-, 에러 바는 세 개의 복제본 C) 해당 CPH 기판 (엔도 셀룰라아제 및 2-HE-셀룰로오스에 다른 상업 효소의 ​​활동의 평균의 표준 오차를 나타냅니다 β 글루칸 (보리), E-XYAN4과 CPH-크 실란, E-XEGP 및 CPH-크 실로 글루칸, E-BLAAM과 CPH-아밀로스, E-BMACJ과 CPH-갈 락토 만난; Megazyme 모든 효소). 오류 막대는 두 개의 복제본의 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54286/54286fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그들은 부분적으로 바이오 매스의 주성분이다 식물 세포벽 다당류의 자연적인 정렬을 유지하기 때문에 불용성 발색 매스 (ICB) 기질 발색 기질 레퍼토리 유용한 부가된다. CPH 및 ICB 기판은 액체 배지에서 배양 할 때 Phanerochaete의 chrysosporium의 분비 효소를 분석하는 예제에 사용됩니다. 상기 분석 키트 판의 판 셋업 19 CPH 기판 5 ICB 기판 (각 기판도 3b 4 웰)와 함께,도 3a에 도시되어있다. P. chrysosporium는 cultivat했다사흘 에드 후 배양 상등액을 분석 하였다. 따라서, 125 ㎕의 200 mM의 버퍼를 각 웰에 25 ㎕의 배양 상청액에 첨가 옮겼다. 세 가지 다른 pH 조건 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.0 인산 나트륨 완충액 pH 6.0의 pH 8.0 (도 3C)를 이용하여 테스트되었다. 플레이트를 2 시간 동안 25 ℃ (150 RPM)를 진탕 배양 하였다. 반응 생성물은 제품 판 (도 3D)로 전송하고 분석 하였다. P. chrysosporium 다양한 글루칸, 전분 및 크 실란 (그림 3E)의 분해 효소를 생산했다. 낮은 신호는 헤미셀룰로오스의 아라 (사탕무)와 펙트 갈 락탄뿐만 아니라 RGI (대두) 검출 될 수있다. 생성 된 효소는 중성 또는 약간 기본 조건 (PH 8.0)보다 산성 조건 (pH를 4.0)에보다 적극적이었다. ICB 기판으로 낮은 활동 (그림 3 층)다당류는 자연스러운 상황에있는 경우,이 효소의 효율 순수한 다당류와 같이 동일하지 않은 것을 증명하고는 원료 또는 예비인가 된 경우 ICB 기질이 효소의 효율보다 현실적인 관점을 설명하는 이유는 처리 된 식물 재료. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig3.jpg" /> 19 CPH 5 ICB 기판. A) 각각의 기판 (4) 웰과 플레이트 설치하는 방식을 포함하는 다중 기판 플레이트를 사용 Phanerochaete의 chrysosporium의 3 일된 배양액에서 배양 상등액도 3 상영 (회색 배경 = CPH 기판 오렌지 배경 = ICB 기판). B) 기판. C를 함유하는 분석 플레이트의 그림) 방식 (즉, 실험에 사용되는 버퍼 상태를 도시200 mM의 아세트산 나트륨의 pH 4.0 인산 나트륨의 pH 6.0 인산 나트륨 pH를 8.0). D) 25 ° C. E) 흡광도에서 2 시간 후에 제품 판의 사진은 517 nm에서 검출 된 각 개별 CPH 기판 및 F에 대한 작도 각각의 효소) ICB 기판 결과. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54286/54286fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 발색 기질은 하나의 효소를 사용하거나 효소 칵테일 한 웰에 다른 컬러 CPH 기판의 혼합물을 사용하여 처리 한 후, 반응 상층 액을 분석함으로써 시너지 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 도 4에 도시 된 다음의 예에서, 적색 CPH 셀룰로오스 노란색 CPH-자일란 기질은 대략 EQU 함께 혼합 하였다96 웰 필터 판 웰의 알 비.도 4a없이 효소 (대조군), 셀룰로오스 CEL (2 U / ㎖), 크 실라 아제의 xyl (1 U / ㎖)와 실온에서 1 시간 처리 한 후, 착색 반응 생성물을 나타낸다 두 효소의 혼합물을 100 mM 아세트산 나트륨 완충제의 pH를 4.5 (3 각 접근 복제). 분석을 위해, 반응 생성물을 700 nm의 (도 4B)으로 350 nm 내지 흡광도 스펙트럼을 스캐닝하여 분광 광도계로 정량 하였다. 종종 단독 육안 다른 염료에 따른 흡수 스펙트럼은 각각의 열화의 정도를보다 정확하게 표시 수득 단순 회귀 분석 (8)을 사용하여 해결 될 수 있지만 기록 효소가 하나 또는 여러 개의 기판에 작용되는지 여부의 표시를 제공 할 수 있습니다 혼합물로부터 기판. 실질적 혼합물로서 CPH 기판을 사용하여 SCR있게 분석의 처리량에 추가하나의 실험 (잘 하나)에서 최대 4 개의 기판에 대해 eening. 도시 된 예에서 사용되는 네 가지 기질은 다음과 같습니다 푸른 CPH-β 글루칸 (보리), 노란색 CPH-크 실란 (비치 우드), 녹색 CPH-아밀로오스와 붉은 CPH-펙트 갈 락탄 (루팡). 기판 플레이트의 구성은도 4c 및도 4d의 분석 플레이트의 사진에 나타낸다. 반응물을 25 ℃에서 150 rpm으로 30 분 동안 100 mM의 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.5에서 수행 하였다. 제품 판에서 예상대로 증가 효소 농도 최초의 단일 효소가 해당 CPH 기판 (그림 4E)와 색깔의 상층 액을 시험했다가 수신 (그림 4 층, 행 1A - 12D). 행 E가 포함 된 CPH-크 실란과 파란색 CPH-β 글루칸, 엔도 -xylanase와 엔도 글루 카나 아제 해당 효소의 서로 다른 비율로 저하 된 두 개의 서로 다른 CPH 기판 노란색. 반응 종료 후, 결과는 visib제작 제품 판에 : 반응 생성물의 색이 짙은 녹색, 청색,보다 엔도 글루 카나 아제가 존재할 때 (도 4F, 4E-6E)이었다 (엔도 -xylanase 농도가 증가하면 밝은 연두색으로 바뀌 그림 4 층, 10-12E). 동일한 두 개의 기판 빨간 CPH-펙트 갈 락탄과 노란색 CPH-크 실란은 엔도 -galactanase와 엔도 -xylanase으로 저하 된 행 F에서 볼 수있다. 네 개의 다른 컬러 CPH 기판 본 (도 4F는 1G-12F) 및 단일 효소 적절한 CPH 기판을 분해 및 추가 첨가하여, 착색 반응 생성물의 조합을 수신 한 효소였다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig4.jpg" /> 도 4 가지 효소로 처리 한 두 개의 다른 CPH 기판의 조합, 적색 CPH 셀룰로오스 노란색 CPH-자일란. 에이)이 엔도 -cellulase (CEL와 기판) 또는 엔도 -xylanase (xyl) 또는 둘 모두 효소. B) 반응 상등액의 흡광도 스펙트럼의 치료 후 반응 상층 액. 각기 다른 효소로 처리 네 가지 CPH 기판 조합 CPH 기판을 포함하는 기판 플레이트의 C) 방식 :. 블루 CPH-β 글루칸 (보리), 옐로우 CPH-자일란 (비치 우드), 녹 CPH-아밀로스 및 빨강 CPH- 펙트 갈 락탄 (피나) 다른 CPH 기판을 함유하는 분석 플레이트의 D) 사진 추가 효소의 비를 나타내는 제품 판의 E) 방식 (공칭 농도 (NC).. GLU = 1 U / ㎖의 엔도 글루 카나 아제, = 1 U / ㎖의 엔도 -xylanase, 에이미 = 5 U / ㎖의 엔도 아밀라제와 여자 = 0.5 U / ㎖의 엔도 -galactanase)을 xyl. 제품 판의 F) 사진을 30 분 배양 한 후 25 ° C에서. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54286/54286fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 기판 </td><td> 출처 </td></tr><tr><td> CPH -2- 히드 록시 에틸 </td><td rowspan="2"> N / A </td></tr><tr><td> (CPH-2-HE-셀룰로오스) </td></tr><tr><td> CPH-아밀로펙틴 </td><td> 감자 </td></tr><tr><td> CPH-아밀로스 </td><td> 감자 </td></tr><tr><td> CPH-아라 </td><td> 사탕무 </td></tr><tr><td> CPH-아라비 </td><td> 밀 </td></tr><tr><td> CPH-카제인 </td><td> 소 우유 </td></tr><tr><td> CPH-키토산 </td><td> 동물 기원 </td></tr><tr><td> CPH-카드 란 </td><td> 알칼리 게 네스 패 칼리스 </td></tr><tr><td> CPH-덱스 트란 </td><td> 로이코 노 스톡 종. </em&gt; </td></tr><tr><td> CPH-갈 락토 만난 </td><td> 콩과 세라토 니아 속의 나무 </td></tr><tr><td> CPH-라미 나린 </td><td> 다시마의 digitata </td></tr><tr><td> CPH-lichenan </td><td> 아이슬란드어 이끼 </td></tr><tr><td> CPH-메틸 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> CPH-pachyman </td><td> 복령 </td></tr><tr><td> CPH-펙트 갈 락탄 </td><td> 감자 </td></tr><tr><td> CPH-풀루 란 </td><td> 오레오 바시 듐 풀루 란스 </td></tr><tr><td> CPH-rhamnogalacturonan I (RG I) </td><td> 감자 </td></tr><tr><td> CPH-rhamnogalacturonan I (-Gal) * </td><td> 감자 </td></tr><tr><td> CPH-rhamnogalacturonan </td><td> 대두 </td></tr><tr><td> CPH-크 실란 </td><td> 비치 우드 </td></tr><tr><td> CPH-크 실로 글루칸 </td><td> 타마 린드 </td></tr><tr><td> 보리에서 CPH-β 글루칸 </td><td> 보리 </td></tr><tr><td> 귀리에서 CPH-β 글루칸 </td><td> 귀리 </td&gt; </tr><tr><td> 효모에서 CPH-β 글루칸 </td><td> 누룩 </td></tr><tr><td> ICB-애기 </td><td> 장미는 애기 장대에서 출발 장대 골-0 (성인 공장) </td></tr><tr><td> ICB-애기 씨 </td><td> 애기 장대 </td></tr><tr><td> ICB-사탕 수수 </td><td> Saccharum의 officinarum (건조 성인 식물, 줄기와 잎) </td></tr><tr><td> ICB 결정질 셀룰로오스 (여과지) </td><td> 상업 와트 3MM 대하 크로마토 그래피 용지 </td></tr><tr><td> ICB-호로 파 씨앗 </td><td> Trigonella 종. 씨앗 </td></tr><tr><td> ICB-마 </td><td> 대마초 종. (건조 성인 식물, 줄기와 잎) </td></tr><tr><td> ICB - 루피 너스 씨앗 </td><td> 불 씨앗을 angustifolius </td></tr><tr><td> ICB 꽃가루 P. 토끼풀 </td><td> Phleum 토끼풀 꽃가루 </td></tr><tr><td> ICB-가문비 나무 </td><td> Picea 종. (마일채워 나무 줄기) </td></tr><tr><td> ICB 담배 </td><td> 담배 속에서 benthamiana에서 출발 (젊은 공장) </td></tr><tr><td> ICB-밀짚 </td><td> 밀 및 종. (건조 성인 식물, 줄기와 잎) </td></tr><tr><td> ICB - 버드 나무 </td><td> Salix 종. (건조 성인 공장, 가공 된 나무 줄기) </td></tr><tr><td> ICB-사탕 수수 </td><td> 사탕 수수 종입니다. (성인 식물 잎) </td></tr><tr><td colspan="2"> * (제거 β-D-1,4- 갈 락탄 측쇄 엔도 -β-1,4-D-galactanase) </td></tr></tbody></table> 표 1. 사용할 수 원체 고분자 하이드로 겔 (CPH)와 불용성 원체 바이오 매스 (ICB) 기판의 목록입니다.

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High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.9K 조회수.  University of Copenhagen. A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

환경과학

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

생물학

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

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Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

자동화 모​​듈 높은 처리량 엑소 폴리 사카 라이드 심사 플랫폼은 매우 민감한 탄수화물 지문 분석과 결합

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Chromogenic Polymer Hydrogel-Based Enzyme Screening Assay: A High Throughput Method to Screen the Carbohydrate-Active Enzymes Using Synthetic Substrates

Source: Sch&#252;ckel, J., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54286">High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits.</a> J. Vis. Exp. (2016).
In this video, we demonstrate a high throughput assay for carbohydrate-active enzyme screening using insoluble chromogenic polymer hydrogel substrates. The enzyme degrades these substrates into a soluble colored product that can be quantified by measuring the color intensity of the product.

발색 고분자 하이드로겔 기반 효소 스크리닝 분석: 합성 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소를 스크리닝하는 고처리량 방법

Source: Sch&#252;ckel, J., et al. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Biochemical assays

Insoluble Chromogenic Biomass-Based Enzyme Screening: An Assay to Evaluate the Degradation Activity of Plant Biomass-Degrading Enzymes

Source: Sch&#252;ckel, J., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54286">High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay to screen enzymes effective in degrading complex polysaccharides in plant biomass using insoluble chromogenic biomass or ICB. The enzymes hydrolyze ICB to release soluble dye-linked oligosaccharides, and the enzyme activity is assessed by colorimetric analysis of the reaction product.

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