Name: hplc-based assay to monitor extracellular nucleotide/nucleoside metabolism in human chronic lymphocytic leukemia cells
Uploaded: 2016-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells at JoVE.com

이 작품은 Associazione Italiana의 Ricerca Cancro (IG # 12754)에 의해 지원됩니다.

CLL 혈액 샘플은 기관 지침 및 헬싱키 선언에 따라 얻을 수있다. CLL 환자의 혈액 샘플에서 백혈병 림프구 1. 분리 <ol><li> 나트륨 헤파린 (녹색 위) 튜브 (17)의 혈액 샘플을 수집합니다. </li><li> RT 1X 인산 완충 식염수 (PBS)으로 전체 혈액의 3 희석 : 1을 확인합니다. </li><li> 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 정제 하였다. <ol><li> 신중 언더 5 15 mL의 원심 분리 튜브의 밀도 원심 분리 매체 (예를 들면, 피콜) ml의 희석 혈액 10 ㎖를 옮긴다. 즉시 실온에서 20 분 동안 1,500 XG에 원심 분리기. </li></ol></li><li> 진공 펌프에 연결된 유리 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 흡인 부와 5 ml의 피펫 밀도 원심 매체 희석 플라즈마 사이의 계면에서 PBMC 링을 모은다. (50m를 50 ml의 원심 분리 관에 전송하고 PBS로 세척리터 최종 부피). 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 대기음 유리 파스퇴르 피펫으로 상층 액은 PBS 50 ㎖에 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 세포를 사용하여 계산. </li><li> 얼룩 방지 CD19와 PBMC를 및 흐름에 대한 -CD5 항체는 세포 계측법 면역 염색을위한 표준 프로토콜을 다음과 PBMC의 모집단 구성 (18)를 확인합니다. 참고 : CLL 림프구는 CD19 + / CD5 +입니다. </li><li> 18 사이토 흐름을 사용하여 CD19 + / CD5 + 세포의 %를 확인합니다. CD19 + / CD5 + B 세포 (19)의 음의 분리를위한 2 단계에 설명 된 지침에 따라 백혈병 세포의 ≥95 % 환자에서 B 림프구를 정화. </li></ol> 음의 분리에 의한 백혈병 B 세포의 2. 정제 <ol><li> PBS, 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 2 mM의 EDTA, pH 7.4의 (차단 완충액)에서 재현 탁 PBMC를 107 / ㎖. </li><li> 10 추가1, 마우스 단일 클론 항 CD3, -CD14 10 7 세포에 대한 -CD16 차 항체의 g, 4 ℃에서 30 분 동안 품어. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에서 분리 버퍼와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. </li><li> PBMC를 107 / ㎖로 분리 완충액에 세포를 재현 탁. </li><li> 세포와 함께 배양하기 전에, 양 항 - 마우스 IgG를 바이알에 자성 비드를 재현 탁. 튜브 10 (7) 셀 당 구슬의 100 μl를 전송합니다. </li><li> 절연 버퍼 1 mL를 넣고 1 분간 자석 홀더에 튜브를 배치합니다. 5 ml를 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 자석에서 튜브를 제거하고 분리 버퍼 100 ㎕의 세척 비드를 재현 탁. </li><li> 완만 한 경사와 회전 4 ° C에서 30 분 동안 자기 구슬 100 ㎕ 10 7 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 자석 홀더에 튜브를 놓고 CD19 + / CD5 + 언 바운드 세포 상층 액을 전송5 ml를 피펫와 신선한 튜브. </li><li> 분리 프로토콜의 마지막에, 세포 계측법 항 CD19과 세포 100 ㎕와 흐름 -CD5 항체 염색, 4 ° C에서 30 분 동안 배양한다. , PBS 1 % BSA의 3 ㎖로 세포를 씻으 뜨는의 과잉을 취소하고 19 유동 세포 계측법에 의해 다시 B 세포의 순도를 확인합니다. 주 : B 세포의 순도는 95 %보다 낮 으면 추가적인 제외 분리 공정을 수행한다. </li></ol> 표준 및 억제제 주식 솔루션 (3) 준비 <ol><li> AMP를 제조 AMP의 0.00345 g을 달아 및 AMP의 2mm의 표준액을 가지고 무 혈청 배지 5 ㎖에 용해. </li><li> ADO를 준비하려면 ADO 중 0.00265 g의 무게와 ADO의 2 mM의 표준 용액을 가지고 무 혈청 배지 5 ㎖에 용해. </li><li> INO를 준비하려면, INO 중 0.00268 g의 무게 및 INO의 2 mM의 표준 용액을 가지고 무 혈청 배지 5 ㎖에 용해. </li><li> AMP, ADO의 400 μm의 솔루션을 준비하고INO 혈청 배지 (5 ㎖의 최종 부피) 4 ㎖에 2 mM의 스톡 용액 1ml를 혼합함으로써. <ol><li> 각 400 μM 표준 용액의 4 희석 무 혈청 배지 (2 ㎖의 최종 부피)의 1,500 μL에 400 μM 용액 500 μl를 피펫 팅하여 100 μM 농도를 얻기 위해 : 1합니다. </li><li> 다음 농도를 얻기 위해, 무 혈청 배지에서 각 화합물의 희석액을 제조 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 250 μM - 1 μM - 0.5 μM - 0.25 μM. 참고 : 예를 들어, 무 혈청 배지 1 ㎖에서 100 μM 용액을 피펫 1 ㎖ (1 : 2 희석) 50 μM의 농도를 수득하고, 나머지 희석 진행. </li></ol></li><li> PBS에 용해 APCP의 10 mM 스톡 용액을 준비한다; 30 ° C -에서 나누어지는 및 주식. </li><li> 디메틸 설폭 시드에 용해 EHNA 염산염, DCF 및 디피 리다 몰의 10 mM의 스톡 솔루션 (DMSO)를 준비; 나누어지는과 주식에서 -30기음. </li></ol> 4.를 프로그램 HPLC 방법 <ol><li> 이중 탈 이온수 2 L (완충액 A)에 아세트산 암모늄 0.770 g을 용해시켜 7 mM의 아세트산 암모늄 완충액을 준비한다. 염산으로 pH 3.0으로 조정합니다. </li><li> HPLC (완충액 B) 용 초순수 아세토 니트릴 중 적어도 2 L를 함유하는 유리 병을 준비하고 보호 컬럼 및 HPLC 컬럼에 연결한다. 참고 : 사용하는 동안 열 및 버퍼는 RT에 있습니다. </li><li> HPLC를 소프트웨어에 로그인하고 &quot;찾아보기 프로젝트&quot;버튼을 선택합니다. &quot;파일&quot;메뉴로 이동하여 &quot;새로운 방법&quot;및 &quot;악기 방법&quot;을 선택합니다. </li><li> 프로그램 표 1에 따라, 평형 열 방법. 1.00 ㎖ / 분의 유량을 설정하고 260 nm에서 읽어 UV 검출기를 프로그램. 악기 방법을 저장 한 다음 &quot;방법 설정&quot;을 &quot;파일&quot;메뉴에서 다시 &quot;새로운 방법&quot;을 선택합니다. 이전에 저장 한 악기 방법을 선택동일한 이름으로 설정된 현재의 방법을 저장합니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시각 </td><td> 유속 (㎖ / 분) </td><td> %에이 </td><td> %비 </td></tr><tr><td></td><td> 1.00 </td><td> (100) </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 1.24 </td><td> 1.00 </td><td> (100) </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 6.22 </td><td> 1.00 </td><td> 이 </td><td> 98 </td></tr><tr><td> 18.65 </td><td> 1.00 </td><td> 이 </td><td> 98 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 평형 열 방식의 열 평형에 대한 용매 변화의 도식 표현.. 완충액 A : 7mm의 암모늄 아세테이트, pH가 3.0. 버퍼 B : 아세토 니트릴. <ol start="5"><li> 1.00 m의 설정 유량을 표 2에 나타낸 시료 실행 방법을 프로그래밍하는 단계를 반복 4.3L / 분, 프로그램 UV 검출기는 260 nm에서 읽을 수 있습니다. 기기 저장 방법 및 상기 방법들을 저장하는 단계 4.4에 기재된 것과 동일한 절차를 반복 .. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시각 </td><td> 유속 (㎖ / 분) </td><td> %에이 </td><td> %비 </td></tr><tr><td></td><td> 1.00 </td><td> 0 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 3.74 </td><td> 1.00 </td><td> 0 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 13.71 </td><td> 1.00 </td><td> (15) </td><td> (85) </td></tr><tr><td> 17.00 </td><td> 1.00 </td><td> (100) </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 20.00 </td><td> 1.00 </td><td> (100) </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 샘플 실행 방법. 퓨린 화합물의 HPLC 측​​정을위한 용매 변화의 도식 표현. 버프ER A : 7mm의 암모늄 아세테이트, pH가 3.0. 버퍼 B : 아세토 니트릴. <ol start="6"><li> &quot;파일&quot;메뉴에서 &quot;새로운 샘플 세트 방법을&quot;선택 &quot;을 실행 샘플&quot;버튼을 선택합니다. </li><li> 은 &quot;빈&quot;옵션을 선택합니다 (자동 시료 주입기에) 유리 병의 수, 샘플 이름, 주입량 (50 μL)를 입력합니다. &quot;방법 세트&quot;컬럼에 대해 이전에 저장 한 방법 세트를 선택하고 전체 실행 시간 (분)을 입력합니다. 참고 : 각 샘플 실행하기 전에 &quot;방법 설정 &#39;항목에서 평형 열 방법 (표 1)를 입력하고 전체 실행 시간 (분)을 입력합니다. </li></ol> 각 화합물에 대한 표준 검량선 5 세대 <ol><li> 빈 (아데노신 데 아미나 제를 포함하지 않는 특정 혈청 배지)의 표 1 및 표 2에 기재된 방법에 따라 각 표준 시료 50 ㎕를 주입한다. <ol><li> 평형 열을 사용하여방법 (표 1) 이전에 각각의 샘플 실행하고 적절한 피크 간격을 얻기 위해, 표 2에 기재된 구배 조건을 설정한다. 이러한 HPLC 조건에서 AMP, ADO 및 INO의보고 체류 시간은 표 3을 참조하십시오. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 유지 시간 </td><td> λ 최대 </td></tr><tr><td> AMP </td><td> 8.00 분 </td><td> (260) </td></tr><tr><td> INO </td><td> 11.00 분 </td><td> (260) </td></tr><tr><td> 야단법석 </td><td> 11.90 분 </td><td> (260) </td></tr></tbody></table> 표 3 : 퓨린 화합물의 체류 시간 AMP, ADO 및 INO 관찰 일반적인 유지 시간.. 자외선 검출기는 260 nm에서 판독하도록 프로그램된다. <ol start="2"><li&gt;는 HPLC 소프트웨어에서하고 &quot;통합&quot;옵션 옆에있는 &quot;프로세스&quot;버튼을 선택하면 다른 농도에서 AMP, ADO 및 INO의 피크 면적을 결정합니다. 또는 수동으로 각 피크의 시작과 끝 지점을 선택합니다. </li><li> 아홉 점 보정 곡선을 얻기 위해 각 표준의 공칭 농도에 대해 피크 면적 플롯 (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 μM). </li><li> AMP, 및 ADO INO에 대한 직선의 식을 계산한다 : Y = MX + B, x는 μM 농도 Y이고 피크 면적에 대응한다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54124/54124fig2.jpg" /> 내부 표준 곡선의 그림 2 세대. 대표 교정 표준 ADO에 대한 곡선 얻어진 상대 식. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54124/54124fig2large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하세요</a>전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. 기판과 억제제와 배양 6. 전처리 (AMP) <ol><li> CD73, ADA의 억제 및 뉴 클레오 시드 수송, 재현 탁하지 않고 AMP 소비, ADO 및 INO 생성을 테스트하는 2 × 10 6 CD19 + / CD5 + CLL 세포 (분리하고 1 단계에서 정제, 2) 무 혈청 배지 250 μL와 48 웰 플레이트에 플레이트 세포 (또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서). </li><li> CD73의 효소 활성을 차단하기 위해, 희석 한 1,000 APCP (10 mM)을의 원액을 배양 배지에 10 μM의 최종 농도를 얻었다. APCP을 함유하는 배지 250 ㎕를 2 × 106 CLL 세포를 재현 탁하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 60 분간 전처리. </li><li> INO에 ADO의 전환을 차단하려면 희석 1 : 1,000 혈청 배지에서 EHNA 염산염 및 / 또는 DCF의 스톡 용액 (10 mM의 양)이 10 μM의 최종 농도가.EHNA 및 / 또는 DCF를 함유하는 배지 250 ㎕를 2 × 106 CLL 세포를 재현 탁. 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 10 μM의 최종 농도를 갖는 무 혈청 배지에서 1,000 디피 리다 몰의 원액 (10 mM)을 다음 클레오 수송차를 통해 ADO의 흡수를 차단하는 1 희석. 배양 배지를 함유하는 250 ㎕의 디피 리다 몰에서 2 × 106 CLL 세포를 재현 탁하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> APCP, EHNA, DCF의 단일 솔루션을 준비하고 디피 리다 몰은 1 희석 : 천 400 μM의 AMP. </li><li> 200 μM AMP의 최종 농도를 얻기 위해 400 μM AMP 또는 AMP 플러스 억제제 250 μL를 추가한다. 기판의 부재 상태가 빈 샘플로서 사용 포함한다. </li><li> 30에서 37 ° C에서 60 분에 품어. 주 : AMP 및 배양 시간의 최적 농도는 실험적으로 결정 하였다. </li><li> t에서그는, 배양 시간의 끝 (얼음) 추위의 microcentrifuge 튜브의 상층 액 500 μl를 수집하고 즉시 5 분 동안 4 ° C에서 17,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브의 상층 액을 전송하고 즉시 -80 ° C에서 보관 또는 HPLC 실행을위한 준비를 샘플로 진행합니다. </li></ol> 7. 샘플 HPLC 준비 <ol><li> 0.2 μm의 주사기 필터를 새 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브의 상층 액을 필터링합니다. 필터링에 1 ml의 주사기를 사용합니다. </li><li> HPLC 시스템 오토 샘플러로 제공되면, HPLC 용 유리 바이알을 제조하고 작은 샘플 볼륨에 0.1 ml의 마이크로 인서트를 사용한다. </li><li> 전송 마이크로 피펫 또는 유리 파스퇴르 피펫으로 유리 바이알 샘플의 적어도 100 μL. 거품없이 전송하고 나사 마개로 병을 닫습니다주의하십시오. </li><li> 샘플은 현재 RP-HPLC로 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 8. HPLC Measu퓨린의 rements <ol><li> &quot;실행 샘플&quot;버튼을 선택합니다; &quot;파일&quot;메뉴에서 &quot;새로운 샘플 세트 방법&quot;을 선택합니다. </li><li> 은 &quot;빈&quot;옵션을 선택하고 나타냅니다합니다 (자동 시료 주입기에) 유리 병의 수, 샘플 이름, 주입량 (50 μl를). </li><li> 평형 열 방법 및 표 1 및 표 2에 기재된 실행 샘플 방법을 선택, 각각에 따라 모든 공백 및 예제 실행합니다. 참고 : 각 샘플 실행하기 전에 평형 열 방법 (표 1)를 설정합니다. </li><li> 블랭크 (무 혈청 배지)의 각 시료 50 ㎕를 주입한다. </li><li> 각 샘플 퓨린의 농도를 결정하기 표 3에 기술 된 체류 시간에서의 피크 면적을 구하여 AMP, 및 ADO INO 정량화. <ol><li> &quot;프로세스&quot;버튼과 &quot;통합&quot;옵션 옆에있는을 선택합니다. ㄱ 시작 또는 수동으로 선택각 단일 피크 ND 종단점 지역 측정치를 얻었다. 이것은 피크의 시작점과 끝점 사이에 선을 추적함으로써 수행된다. </li><li> 표준 곡선에서 얻은 식인가 μM 농도를 측정 : Y = X는 μM 농도를 나타내고, Y는 미지의 시료에서 측정 된 피크의 면적 인 MX + B. 참고 : ADO 교정 표준 곡선의 예는 그림 2에보고됩니다 : X = (Y 지역 - 981.02) / 40,026을 </li></ol></li><li> AMP의 μmoles 계산 2 × 106 세포 배지 0.500 ㎖에 재현 탁 점을 감안하면, ADO 및 INO 소비 및 / 또는 다음의 비율로 도포 106 CLL 세포에 의해 생성 : μmoles : 1,000 ㎖ = X의 μmoles : 0.250 ml의 참고 : 1,000 ml의의 μmoles (수는 1 L에 μmoles)이 μM 농도에 해당하고, x는 뉴의 μmoles이다의cleotide 또는 뉴 클레오 시드 10 6 세포에 의해 생성. <ol><li> 마지막으로, 106 CLL 세포에 의해 소비 및 / 또는 생성 된 나노 몰에 μmoles 변환 : 나노 몰 = μmoles X 1000 </li></ol></li></ol>

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J., Gandhi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+methods+affect+cellular+protein+integrity:+implications+for+clinical+trial+biomarkers+and+ZAP-70+inn+CLL.">Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL.</a> Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).</li><li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols.">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li><li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD38+and+ZAP-70+are+functionally+linked+and+mark+CLL+cells+with+high+migratory+potential.">CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential.</a> Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).</li><li>Sachsenmeier, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+ectonucleotidase+assay+suitable+for+high-throughput+screening.">Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 프로토콜은 정제 된 인간의 백혈병 세포에서의 세포 배양 배지에서 CD39 / CD73 adenosinergic 기계의 활성을 평가할 수있게한다. 이 HPLC 방법을 통해 우리는 다음과 정량적으로 ADO (CD73-에 따라 다름) 및 INO에 그 이후의 저하 (CD26 / ADA에 따라 다름)의 효소 생성을 측정 할 수 있습니다. 효소 저해제를 사용하는 프로토콜을 제어하고 내부 제어를 할 수있다. 이 프로토콜의 장점과 참신 II)는 ?...

아데노신 (ADO)가 글리코 시드 결합을 통해 리보스 당 분자 잔기에 부착 된 아데닌 분자와 퓨린 뉴 클레오 사이드이다. 되면 세포 외 환경에 존재하는, 상기 면역계의 작용에 의해 과도한 손상으로부터 세포를 보호한다. 이 역할은 예 1 대장염, 당뇨병이 천식 3 패혈증 4, 허혈 5와 같은 다른 질병 모델을 사용하여 강조되어왔다. ADO 주요 기능 중 하나는 종양 면역 회피 6에 기여 종양 미세 환경의 면역 반응을 억제한다. 이러한 이유로, ADO 형성과 관련된 시그널링 메커니즘은 상당한 치료 학적 이익 (7)이다. 조직의 미세 ADO 수준은 정상적인 생리 조건 하에서 확실하게 면역 세포의 감도 임계 값보다 상대적으로 낮다. 그러나 동안 저산소증, 허혈, 염증, 감염, 대사스트레스와 종양의 변화는 빠르게 팔을 높일 수 있습니다. 분비하고 분비 방법으로 조직 손상을보고하고 세포 보호 일반적으로 볼 수있는 조직 반응을 생성하기 위해 : 조직 교란 신호에 응답하여 상승 된 세포 수준 ADO는 이중 기능을 갖는다. 세포 외 ADO 때문에 아데노신 데 아미나가 운영하는 장애인 저하의 뉴 클레오 시드 수송 9 축적에 의해 매개 세포 내 구획에서 방출을 포함 메커니즘의 다양한 통해 형성 될 수있다. 증가 된 세포 외 ADO 수준에 이르는 주요 경로는 죽었거나 죽어가는 세포에서 방출 뉴클레오티드의 phosphohydrolysis으로 ADO를 생성하는 막 관련 ectoenzymes 있습니다 ectonucleotidases의 캐스케이드의 활동을 포함한다. 이 경로는 CD39의 순차적 작용을 통해 진행한다 (ectonucleoside 포스페이트 diphosphohydrolase-1)의 세포 외 아데노신 5&#39;- 삼인산 변환 (ATP) 또는 AMP 10 ADO로 변환 아데노신 5&#39;- 모노 포스페이트 (AMP) 및 CD73 (5&#39;- 뉴 클레오)의 아데노신 5&#39;- 인산 (ADP). 세포 외 ADO 네 횡단 ADO 수용체, 즉 A1, A2A, A2B 및 A3에 결합하여 생리적 반응을 이끌어. 각 수용체는 ADO 특정 조직 분포에 대해 서로 다른 친화력을 보유하고 있습니다. 모든 수용체는 일곱 경막 도메인을 가지며 G 단백질 세포 GTP 결합 단백질 (G 단백질)에 결합 된, 즉 유도 (G 단백질), 또는 후속 적으로, 세포의 cAMP의 생산을 억제 (GI 단백질) 아데 닐 레이트 시클 라제 활성과 수있다. 따라서, 생리적 반응 (11) 중 세포 내 단백질 키나제 활성에 세포질 캠프 수준에 미치는 영향의 변화. 생리 학적 조건에서 세포 외 ADO 무차별 A1, A2A 및 A3 수용체를 활성화 할 수 있습니다 1 μM, 이하이다. 그러나, A2B 서브 타입의 활성은 상당히 높은 필요이러한 병태 생리 학적 조건에서 생성되는 것과 같이 뉴 클레오 사이드의 농도. 또한, 세포 외 ADO는 아데노신 데 아미나 제 (ADA)와 CD26, 세포 표면에 ADA 현지화 ADA 착화 단백질에 의해 이노신 (INO)로 저하 될 수 있습니다. 또 다른 가능성은 ADO는 ADO 키나아제 단백질 (12, 13)에 의해 AMP에 equilibrative 뉴 클레오 시드 수송 (ENT) 및 인산화를 통해 세포에 의해 내면화된다는 것이다. 이 프로토콜의 목적은 인간 림프구에 의해 생성 된 바와 같이, 하나의 실행에서, 기판 AMP 및 제품 ADO 및 INO 정량을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)의 분석 방법을 설명한다. 우리의 경험은 초기 구조적 14,15 CD39를 발현하는 CD19 + / CD5 + B 림프구의 성숙 인구의 팽창에 의해 특징 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자로부터의 세포를 사용하여 수득 하였다. 우리는 30 % 정도 나타났다CLL의 환자들은 CD73의 ectoenzyme을 표현하고 있음이 표현형은 불량한 예후 (16)와 상관 관계. CD39 및 CD73 공동 발현 백혈병 세포의이 하위 집단은 적극적으로 ADP 및 / 또는 AMP에서 세포 외 ADO를 생성 할 수 있습니다. α와 CD73 + CLL 세포의 예비 배양은 β 메틸렌 ADP (APCP) CD73 효소 활성의 공지 된 억제제 완전히 차단 외 ADO 합성 CD73가 캐스케이드 (16)의 보틀 넥 효소를 나타내는 것을 확인. CLL 세포는 INO로 ADO의 변환에 대한 책임이 있습니다 ADA와 ADA 복합체 단백질 CD26를 표현한다. 예컨대 에리트로 -9- 특정 ADA 저해제를 사용하여 (2- 히드 록시 -3- 노닐)는 I wiadenine (EHNA) 염산염 deoxycoformycin (DCF)은 INO에 외 ADO 저하를 차단하는 것이 가능하다. 또한, 디피 리다 몰과 조합의 ADA 억제제와 전처리, 블록 뉴 클레오 시드 운송 것으로, 셀 ADO 축적을 강화상층 액. 우리는 그 다음 CD73에 의존 ADO 생산을 확인하는 T 림프구와 골수 세포를 포함한 다른 계통에서 파생 된 세포에이 프로토콜을 확장했다. 이러한 결과는 본 HPLC 프로토콜 매우 다재다능하고 (도 1) 상이한 세포 계통으로 상이한 배양 조건에 적용 할 수 있다는 것을 시사한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54124/54124fig1.jpg" /> 세포 외 ADO 생산을 담당하는 효소 기계 그림 1. 도식 표현. 아데노신 5&#39;- 삼인산 (ATP) 및 / 또는 아데노신 5&#39;- 인산 (ADP)은 아데노신 5&#39;- 모노 포스페이트 (AMP)에 CD39에 의해 분해 될 수있는 다시 뉴 클레오 시드 아데노신 (ADO)로 CD73에 의해 변환된다. ADO는 세포 외 공간에서 생산되면,이 뉴 클레오 컨베이어 (ENT)를 통해 셀을 다시 입력 할 수 있고, 이노신으로 변환 (INO) 또는P1 ADO 수용체의 서로 다른 유형의 결합. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54124/54124fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Human blood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Millipore</td><td></td><td>double deionised water</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-CD3, -CD14, -CD16</td><td>made in-house</td><td></td><td>mouse monoclonal</td></tr><tr><td>PE-labeled anti-CD19</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>120-014-229</td><td></td></tr><tr><td>FITC-labeled anti-CD5</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-574</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads sheep anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11031</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404-200TABS</td><td>tablets</td></tr><tr><td>bovine serum albumin (BSA)</td><td>ID bio</td><td>1000-70</td><td>standard grade</td></tr><tr><td>isolation buffer</td><td></td><td></td><td>PBS 0.1% BSA 2 mM EDTA, pH 7.4</td></tr><tr><td>AIM V serum free medium</td><td>GIBCO</td><td>12055-091</td><td>liquid (research grade)</td></tr><tr><td>adenosine 5&amp;rsquo;-diphosphate (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>adenosine 5&amp;rsquo;-monosphate (AMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>adenosine (ADO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>inosine (INO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;,&amp;beta;-methylene-ADP (APCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8386</td><td>CD73 inhibitor</td></tr><tr><td>EHNA hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E114</td><td>adenosine deaminase inhibitor</td></tr><tr><td>Deoxycoformycin (dCF)</td><td>Tocris</td><td>2033</td><td>adenosine deaminase inhibitor</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dipyridamole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9766</td><td>nucleoside transporter inhibitor</td></tr><tr><td>acetonitrile (CHROMASOLV Plus)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>HPLC-grade</td></tr><tr><td>ammonium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9688</td><td>7 mM, pH 3.0</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L</td><td>min. 37%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker cell counter</td><td>VWR</td><td>631-0920</td><td>hemocytometer</td></tr><tr><td>DynaMag-15 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12301D</td><td>Dynal magnetic bead separator</td></tr><tr><td>microcentrifuge safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>030-120-0086</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>PET centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430053/430304</td><td>15 &amp;ndash; 50 ml</td></tr><tr><td>Minisart RC4 syringe filters</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>17821</td><td>membrane 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>short thread vials</td><td>VWR</td><td>548-0029</td><td>1.5 ml/glass</td></tr><tr><td>micro-inserts</td><td>VWR</td><td>548-0006</td><td>0.1 ml/glass</td></tr><tr><td>screw caps</td><td>VWR</td><td>548-0085</td><td>9 mm/PP blue</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 Column</td><td>Waters</td><td>186001344</td><td>5 &amp;micro;m, 4.6 mm x 150 mm</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 Guard Column</td><td>Waters</td><td>186001323</td><td>5 &amp;micro;m, 4.6 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Waters Alliance 2965 Separations Module</td><td>Waters</td><td></td><td>HPLC separation module</td></tr><tr><td>Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector</td><td>Waters</td><td></td><td>UV detector</td></tr><tr><td>Waters Empower2 software</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hplc-based assay to monitor extracellular nucleotide/nucleoside metabolism in human chronic lymphocytic leukemia cells

이 방법은 민감하고 특이 신뢰성 및 재현성을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC) 분석을 개발하여 다양한 배양 조건 하에서 정제 만성 림프 구성 백혈병에 의해 생성 된 세포 외 퓨린 뉴클레오티드 및 뉴 클레오 시드 (CLL) 세포의 정량화 검증 설명 . 크로마토 그래피 아데노신 5&#39;- 모노 포스페이트의 분리 (AMP), 아데노신 (ADO) 이노신 (INO)의 극성 화합물의 보존에 사용되는 실리카 계, 역상 컬럼상에서 RT에서 수행된다. 방법 / 분 1.00 mL의 유속으로 7mm의 암모늄 아세테이트 및 아세토 니트릴로 구성된 이진 이동상을 포함한다. 용출액은 260 nm에서 설정된 광 다이오드 어레이 UV 검출기를 이용하여 모니터링된다. 표준 검량선 각 퓨린 화합물의 분석 정량 식을 계산하기 위해 생성된다. 시스템 제어, 데이터 획득 및 분석이 수행된다. 이 프로토콜을 적용, AMP, 및 ADO INO은 각각 7, 11, 11.9 분에서 용출하고, 각 샘플의 총 실행 시간은 20 분이다. 이 프로토콜은 매트릭스로서 배양 배지를 이용하여 세포 유형 및 세포주 (현탁액 및 부착 모두) 다른 적용될 수있다. 이점은 간단하고 빠른 샘플 준비 및 분석을 위해 상등액을 소량의 요구이다. 또한, 무 혈청 배지를 사용하는 아세토 니트릴과 단백질 침전 단계를 건너 허용하는 영향 퓨린 화합물의 최종 농도. 방법의 한계 중 하나는 각각의 단일 샘플을 실행하기 전에 실행 평형 열의 요건 이상 실험의 총 동작 시간을 결정하고 높은 처리량 스크리닝 응용을 방지한다.

대표 CLL 환자에서 갓 정제 된 PBMC에서 백혈병 세포의 비율 (%)을 평가하기 위해 세포는 안티 CD19 및 안티 CD5 항체로 표시되어 있습니다. 그림 3의 왼쪽 패널은 살아있는 세포에 선택적 게이트와 cytofluorimetric 도트 플롯을 나타냅니다. (3) 전 (중간 패널)는 CLL 환자에서 PBMC의 예를 보여줍니다과 후 (오른쪽 패널) B 세포 정화. <p class="jove_...

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HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

hplc-based-assay-to-monitor-extracellular-nucleotidenucleoside

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.0K 조회수.  University of Turin. The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

비디오: HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

연구

유전학

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in adults. Initially, AML is a disease of hematopoietic stem cells (HSC) characterized by arrest of differentiation, subsequent accumulation of leukemia blast cells, and reduced production of functional hematopoietic elements. Heterogeneity extends to the presence of leukemia stem cells (LSC), with this dynamic cell compartment evolving to overcome various selection pressures imposed upon during leukemia progression and treatment. To further define the LSC population, the addition of CD90 and CD45RA allows the discrimination of normal HSCs and multipotent progenitors within the CD34+CD38- cell compartment. Here, we outline a protocol to detect simultaneous expression of several putative LSC markers (CD34, CD38, CD45RA, CD90) on primary blast cells of human AML by multiparametric flow cytometry. Furthermore, we show how to quantify three progenitor populations and a putative LSC population with increasing degree of maturation. We confirmed the presence of these populations in corresponding patient-derived-xenografts. This method of detection and quantification of putative LSC may be used for clinical follow-up of chemotherapy response (i.e., minimal residual disease), as residual LSC may cause AML relapse.

We outline a protocol to detect simultaneous expression of leukemia stem cell markers on primary acute myeloid leukemia cells by flow cytometry. We show how to quantify three progenitor populations and a putative LSC population with increasing degree of maturation. We confirmed the presence of these populations in corresponding patient-derived-xenografts.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

암 연구학

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant cellular localization disrupting their mechanism of action. The survival of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, among other cancer cells, is assisted by the deregulation of nuclear to cytoplasmic shuttling, at least in part through deregulation of the transport receptor XPO1 and the constitutive activation of PI3K-mediated signaling pathways. It is essential to understand the role of individual proteins in the context of their intracellular location to gain a deeper understanding of the role of such proteins in the pathobiology of the disease. Furthermore, identifying processes that underlie cell stimulation and the mechanism of action of specific pharmacological inhibitors, in the context of subcellular protein trafficking, will provide a more comprehensive understanding of the mechanism of action. The protocol described here enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These fractions can be used to determine changes in protein trafficking between the nuclear and cytoplasmic fractions upon cell stimulation and drug treatment. The data can be quantified and presented in parallel with immunofluorescent images, thus providing robust and quantifiable data.

This protocol enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These samples are used to determine protein localization as well as changes in protein trafficking that take place between the nuclear and cytoplasmic compartments upon cell stimulation and drug treatment.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which are involved in many cell activities. Here, we describe a rapid and reliable method for the absolute qualification of nucleoside/nucleotide contents in plants. Briefly, 100 mg of homogenized plant material was extracted with 1 mL of extraction buffer (methanol, acetonitrile, and water at a ratio of 2:2:1). Later, the sample was concentrated five times in a freeze dryer and then injected into an HPLC-MS/MS. Nucleotides were separated on a porous graphitic carbon (PGC) column and nucleosides were separated on a C18 column. The mass transitions of each nucleoside and nucleotide were monitored by mass spectrometry. The contents of the nucleosides and nucleotides were quantified against their external standards (ESTDs). Using this method, therefore, researchers can easily quantify nucleosides/nucleotides in different plants.

A precise and reproducible method for in vivo nucleosides/nucleotides quantification in plants is described here. This method employs an HPLC-MS/MS.

HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

생화학

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

면역학 및 감염병학

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Bromodeoxyuridine Pulse Labelling Assay: A Technique to Measure Cell Proliferation

Source: Welschinger R. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/52840">Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video describes the stepwise pulse labeling assay of mammalian cells with bromodeoxyuridine (BrdU) for measuring cell proliferation. The BrdU uptake permits the temporal tracking of cells that were in the synthesis phase at a specific point in time, without requiring the cells to be synchronized.

Bromodeoxyuridine 펄스 라벨링 분석: 세포 증식을 측정하는 기법

Source: Welschinger R. et al. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (2015)
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Leukemia

In vitro techniques & assays

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

Source: Hlozkova K. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/58426">Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

Source: Hlozkova K. et al. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical ...