Name: an approach to enhance alignment and myelination of dorsal root ganglion neurons
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
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저자는 PDMS 기판의 제조에 그의 도움을 에릭 바스 감사드립니다, 유용한 제안 및 DRG 분리의 훈련을위한 미시간 대학에서 박사 마리나 마타의 실험실에서 박사 Shiyong 왕, 박사 마크 Tuszynski 박사 . UC 샌디에고 W. 마리 캄파는 SC 격리를위한 유용한 제안 및 프로토콜. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET 0,941,055 및 CBET 1,510,895), 국립 보건 연구소 (R21CA176854, R01GM089866 및 R01EB014986)에 의해 부분적으로 지원되었다.

세포의 분리에 관한 모든 절차는 미시간 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 사전 뻗어 이방성 표면의 1. 준비 <ol><li> 베이스와 경화제의 1 용액과 조직 배양 접시 (12cm 직경)로 혼합물을 부어 : 10을 섞는다. 4,900 mg의베이스와 총 가교 혼합물에 대한 경화제 490 mg을 사용합니다. </li><li> 기포를 제거하기 위해 20 분 동안 진공 하에서 겔 혼합물을 유지한다. </li><li> 60 ° C에서 밤새 경화 오븐에서 혼합 겔을 놓습니다. </li><li> PDMS의 막을 경화 한 후, 165 mTorr의 3 분의 2와 O 65 sccm의 흐름을위한 플라즈마 클리닝 / 에칭 시스템을 사용하여 산소 플라즈마로 표면을 처리한다. </li><li> 인식되는 것은 어느 쪽하는 산소 처리하는 동안, 접시에서 직사각형 막 (5 × 3.5 cm)의 조각을 잘라 확인 산소 처리 된면이 직면을하고 스트레칭 프레임에 고정합니다. A의 프레임을 배치<html> 무대를 스트레칭과 균등하게 10 % 신장에 도달 할 때까지 무대에 노브를 돌려 스트레칭 (또는 다른 미리 정해진 스트레칭, 신장 직접 연신 단계에서 읽을 수 있습니다) 긴 축 9. 프레임의 나사를 조여 스트레칭을 수정합니다. </li><li> 무대에서 프레임을 제거합니다. 막 표면이 건조하고 먼지가 무료입니다 확인 후 막에 단단히 부착 챔버의 접착면을 허용하는 막에 실리콘 실을 배치합니다. 주 : 실리콘 챔버는 PDMS 막에 셀 매체를 유지하기위한 우물을 제공한다. 장치 설계는도 1에 도시되어있다. </li><li> 10 분 동안 UV와 표면을 소독. </li><li> 추가 1 ml의 폴리 -L- 라이신 플라즈마 처리 6 시간 내에 상기 챔버 내부의 PDMS 표면 (PLL) (인산염 완충 염수 중 0.01 %), 37 ℃에서 2 시간 동안 부화 DRG 신경 세포를 파종 전에. 이 세포 부착을 향상시킵니다. </li></ol>DRG의 제작 &quot;&gt; 2. 격리 <ol><li> DRG 뉴런 표준 성장 매체를 준비합니다. </li><li> 단리하기 전에, 분리 장치 및 필터 시약 압력솥. 6 잘 플레이트 잘 하나에 분리 버퍼의 5 ML을 추가하고, 얼음에 플레이트를 놓습니다. 9 ml의 0.05 %의 트립신 - EDTA (1 ㎎ / ㎖)에 콜라게나 A (500 U / ㎖) 1 ㎖를 추가하여 해리 배지 10 ㎖를 준비 얼음에 0.22 μm의 필터와 장소 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 절연 7 일 &#39;된 흰쥐 - 열 다섯 열둘을 사용합니다. 75 % 이소프로판올 새끼 스프레이 및 잘린 희생. </li><li> 뒤쪽에서 척수를 덮는 피부를 절개하고 척추 주위에 초과 조직을 제거합니다. 에 수술 스폿 조명 수술 돋보기에서 한 컷 가위로 양쪽에서 척추를 따라 다음 목에서 첫 번째 절개를합니다. 새끼의 몸에서 척추를 분리하고 과도한 근육을 제거합니다. 그런 다음, 경도 따라 절단 가위를 사용척추와 사용 핀셋의 g 축이 완전히 척추를 열고 멸균 15 ML 튜브로 절연 버퍼와 DRGs를 전송하는 큰 구멍을 만드십시오 피펫에서 척추 cord.Remove에게 팁을 추출합니다. </li><li> 핀셋의 벌금 쌍을 사용하여 뼈 주머니에서 신경절을 제거하고 약 10 수집 - 양쪽에서 16 DRG를. 신경 뿌리를 손질하고 얼음처럼 차가운 분리 버퍼에 신경을 전송합니다. </li><li> 멸균 15 ML 튜브로 절연 버퍼와 DRGs를 전송하는 큰 구멍을 만드십시오 피펫에서 팁을 제거합니다. 화학 분리 한 후, 원심 분리기 900 XG에 5 분 동안 4 ℃에서 신경절. </li><li> 조직이 튜브 바닥에 침전 부드럽게 상부에 분리 완충액을 제거하고 분리 관에 배지 10 ㎖를 추가하자. </li><li> 10 분 - 튜브 매 5 진탕하면서 1 시간 동안 37 ° C의 물을 용기에 해리 배지에서 해부 조직을 인큐베이션. </li><li> 후화학 물질 분해, 원심 분리기 900 XG에 신경 및 5 분 동안 4 ° C. </li><li> 상층 액을 제거하고 10 ml의 표준 성장 미디어와 소용돌이의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 다시 섹션 2.9에서 나타낸 바와 같이, 해리 된 세포를 원심 분리기. </li><li> , 상층 액을 제거 표준 성장 미디어와 소용돌이의 12 ml의의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li></ol> 사전 뻗어 표면에 DRG 3. 문화 <ol><li> 세포를 시딩 챔버에서 PLL 용액을 제거하고 멸균 공기 건조하여 PDMS 표면을 린스하기 전에. </li><li> 2 분 파편이 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 - 세포를 다시 일시 중단 후 1 서스펜션 설정을 할 수 있습니다. 각 스트레칭 챔버에 세포 현탁액의 1.5 ML을 추가하고 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 10 μL (15 μL) 플루오로 -2- 데 옥시 우리 딘 및 우리 딘 (FDU-U) 주식의 soluti의 혼합물을 추가, 체외에서 일일 (DIV)에서, 아교 세포를 제거하려면(재료의 표 참조) 물론 각에. 7 시간 후, 신선한 표준 성장 매체와이 매체를 교체하고 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 사전 뻗어 문화 장치를 배치합니다. </li><li> 세포 배양 기간 동안 (2 - 3 주), 신선한 배지로 절반을 보냈다 매체를 대체하여 매 2 일 매체를 변경합니다. 참고 : 2 주 동안 뻗어 미연 신 표면에 배양 한 후, 정제 SCS는 챔버에 추가되고 다른 주 (단계 4.7) 배양. </li></ol> 사전 뻗어 표면에 DRG 신경 세포와 슈반 세포 (희주)의 4. 공동 문화 <ol><li> 박사 캄파의 그룹 이전에 (15)에 의해 설명 된 바와 같이 희주를 분리합니다. <ol><li> 요약하면, 1 일 이전 강아지에서 희주을 격리 할 것. 수집하고 기계적으로 좌골 신경 화학적 (트립신 - EDTA와 콜라게나 A) 모두와 (18 게이지 바늘 / 10 ML의 주사기) 15 해리. </li><li> 폴리 D 라이신 (PDL) 공동으로 해리 세포를 시드5 % CO 2에서 37 ° C에서 ated T25 플라스크 문화. 5 일째에, 안티 네 1.1 항체 및 토끼 보체를 사용하여 항체의 선택을 통해 세포를 정제 및 통로 (2) 정제 된 세포를 계대 배양 - 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 10 % 소 태아 혈청을 함유 4. 배양 배지 (FBS) 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄상 구균), 21 μg의 / ㎖ 소 뇌하수체는 (BPE)를 추출, 4 μM 포스 콜린. </li></ol></li><li> SCS에에서 배지를 제거하고 플라스크에 5 ml의 0.05 % 트립신 - EDTA를 추가합니다. 3 분 - 2 5 % CO 2에서 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 들이 플라스크에서 올려이라면 참조 배지 5 ㎖를 추가하고, 플라스크 내의 세포와 혼합하여 10 배 대물 렌즈를 사용하여 광학 현미경으로 세포를 확인한다. </li><li> 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 추가하고 5 분 동안 20 ° C. </li><li> 상층 액을 제거하고 7 ㎖의 표준 DRG 성장 의대에 펠렛을 재현 탁아이오와. </li><li> , 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 현탁액 10 μL을 트리 판 블루 10 μL와 혼합 한 다음, 10 배 대물 렌즈를 사용하여 광학 현미경 하에서 혈구를 이용하여 세포 수를 카운트. DRG 성장 배지를 첨가하여 5,000 ml의 세포의 세포 현탁액을 희석. </li><li> 연신 실에서 DRG 문화에서 매체의 0.5 ml의를 제거하고 DRG 문화에 SC 현탁액 0.5ml를 추가합니다. </li><li> 문화 37 ° C, 5 % CO 2. 변경에 일주에 대한 세포 미디어 DRG에 대한 새로운 표준 성장 매체와 반 동안 매체를 대체하여 이틀. 일주 공동 배양 한 후, 프로세스 면역 조직 화학 (10)에 의해 세포. </li></ol>

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The authors do not have any conflict of interest to disclose.

사전 뻗어 표면에 축삭 배향을 유도하기 위해 두 가지 중요한 단계가 있습니다 : 1) PDMS 막을와 균일 한 두께의 평면이어야합니다 2) 신경 교세포가 DRG로부터 제거되어야한다. PDMS의 가교제와 혼합하고 오븐에서 경화 후, PDMS 가교 겔 평평한 작업대 위에 보관 및 틸팅을 피하기 위해주의 깊게 취급되어야한다. 플라즈마 처리 후 (세포 부착을 위해 요구되는) 표면의 친수성이 시간에 감쇠 이후 PDMS 막?...

신경 손상에서, 근위 및 원위 신경 그루터기는 종종 인해 병변 사이트에 1-2로 신경 다발의 직접 재배치 방지 할 수있다. 일반적으로, 축삭 책자는 연결의 복잡한 네트워크를 형성 축삭의 높은 순서 정렬 번들로 구성된다. 그러나, 신경 재생이 제대로 구성 축삭 정렬 3-4으로 인해 혼란스러운 과정이다. 따라서, 병변 부위를 해소 축삭 재생의 충분한 수를 생성하는 것이 아니라 축삭 조직 배향을 유도 할 필요가있다. 또한, 탈수 초화는 부상 사이트에서 myelinating 세포의 죽음으로 인한 신경 손상을 수반. 탈수 초화가 강하게 축삭 생존의 도전 능력을 손상 때문에, 탈수 초화를 대상으로 또는 재유 수화를 촉진 치료는 신경 손상 (5) 후 기능 회복을 위해 중요하다. 따라서이 프로토콜의 목적은 두 가지 문제를 해결하는 설계 방법을 예시하는 것이다신경 재생의. 재료의 물리적, 기계적 성질, 상이한 축을 따라 측정 할 때의 차이로 정의되는 표면 이방성은 셀의 배향의 성장 및 이동 6-7 영향을인가하고있다. 지형뿐만 아니라, 이방성을 유도하는 다른 방법이있다. 이전에, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 멤브레인의 기계적 정적 사전 스트레치에 의해 유도 된 표면 이방성을 조사 하였다. &quot;큰 부과 작은 변형 SUPER&quot;이론은 세포가 연신 방향 감지 유효 강성은 수직 방향과 다른 것을 예측하고 효과적인 강성 차이는 이방성 8면에 기인한다. 미리 연신 PDMS 막에서 배양 된 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)을 적극적 표면 당겨 그 결과 이방성을 감지 전 연신 방향 (9)으로 정렬 할 수있다. 마찬가지로, 이방성 표면 AR기계 사전 뻗어면에서 유망한 것은 후근 신경절의 정렬뿐만 아니라 성장과 수초 (DRG) 10 축삭에 영향을 미칩니다. 여기에서 우리는 축삭 재생 (10)을 향상시키기 위해 정적 사전 뻗어 PDMS 기판에 표면 이방성을 유도하기위한 프로토콜을 제공합니다. 축삭 정렬, 원하는 패턴 위상 기능을 유도하기 위해 정렬 섬유 및 채널 6,11-12를 통해 연락처 지침을 제공하는 것으로보고, 축삭 정렬 11,13을 용이하게 입증되었다. 그러나, 섬유, 채널 및 패턴 등의 위상 기능을 통해 축삭 정렬을 유도하는 기술을보고, 길게과 축삭의 두께를 증가 할 수 없습니다. 반면에, 기계는 점진적 스트레치 (14)의 크기를 증가 길고 두꺼운 축색과 스트레칭 방향으로 정렬 축삭 연신되었다. 그러나, 생체 내에서 모터 구동 장치를 포함하는 것은 아니다실행할 수 있는. 반대로, 정적 프리 연신 유도 이방성은 덜 복잡하고보다 용이하게 생체 내 응용 프로그램의 장래 지지체 디자인에 혼입 될 수있다. 이 프로토콜에서, 고정 전 신장 세포 배양 시스템은 위상 기능이없는 표면 이방성을 유도하기 위해 사용된다. 막 프레임 상에 고정되고 소정의 스트레칭 정도는 연신 단계에 적용 그러자 예비 연신 배양 시스템하는 PDMS 막, 신축성 프레임 및 연신 단계로 구성된다. 최대 21 일간 전 배양 연신 표면에 갓 절연 DRG 신경 세포 축삭 정렬 및 두께에 대해 모니터링된다. 그 후, 슈반 세포 (희주) 수초에 대한 모니터링 정렬 된 축삭와 공동 배양. 사전 스트레칭에 의한 표면 이방성을 통합함으로써 우리는 중간 엽 줄기 세포 및 DRG 뉴런 각각 9 ~ 10의 세포 정렬 분화 및 축삭 정렬 성장을 향상 할 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Medium 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Trevigen</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/&quot;&gt;3438-100-01&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-2 deoxy-uridine</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Isolation Buffer</td></tr><tr><td>Type I Collagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Clonetics</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Silicone chamber</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM ConA</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaning/etching system</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Thy 1.1 antibody</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Complement</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>Standard growth medium</td><td></td><td></td><td>For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 &amp;mu;l of NGF-- 7S (50 &amp;mu;g/ml).</td></tr><tr><td>FDU Uridine stock solution</td><td></td><td></td><td>FDU 100 mg in 10 ml of ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 &amp;mu;l aliquots and store at -20 &amp;ordm;C. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 &amp;mu;l aliquots and store at -20 &amp;ordm;C.
Take 61.5 &amp;mu;l of FDU (10 mg/ml) and 20.5 &amp;mu;l of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 &amp;mu;l of ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 &amp;ordm;C.</td></tr></tbody></table>

an approach to enhance alignment and myelination of dorsal root ganglion neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

사전 신장 세포 배양 시스템 DRG 축삭 배향 (10)을 추진. DRG 뉴런 12 일 동안 사전 뻗어 미연 신 표면에 배양 하였다. 축삭은 정렬을 입증하는 β-III-tubulin에 대한 염색 하였다. (2) 문화의 12 일 후 사전 뻗어 미연 신 PDMS 기판에 축삭 방향을 비교 한 그림. 그들은 임의의 배향을 보여 미연 신 PDMS 기판상의 상호 연결된 네트워크를 형성하는 반면, ...

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An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K 조회수.  Michigan State University. This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

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Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

연구

생물학

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

신경과학

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

DRG 배양에서 신경 세포 과민증을 연구하기 위한 고급 체외 모델

Harvesting, Embedding, and Culturing Dorsal Root Ganglia in Multi-compartment Devices to Study Peripheral Neuronal Features

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia (DRG). One proposed cause of this hypersensitivity is associated with the interaction between immune cells in the peripheral tissue and neurons. In vitro models have provided foundational knowledge in understanding how these mechanisms result in nociceptor hypersensitivity. However, in vitro models face the challenge of translating efficacy to humans. To address this challenge, a physiologically and anatomically relevant in vitro model has been developed for the culture of intact dorsal root ganglia (DRGs) in three isolated compartments in a 48-well plate. Primary DRGs are harvested from adult Sprague Dawley rats after humane euthanasia. Excess nerve roots are trimmed, and the DRG is cut into appropriate sizes for culture. DRGs are then grown in natural hydrogels, enabling robust growth in all compartments. This multi-compartment system offers anatomically relevant isolation of the DRG cell bodies from neurites, physiologically relevant cell types, and mechanical properties to study the interactions between neural and immune cells. Thus, this culture platform provides a valuable tool for investigating treatment isolation strategies, ultimately leading to an improved screening approach for predicting pain.

저자 스포트라이트: 만성 통증 치료 효능을 향상시키기 위한 In vitro 및 In vivo 모델

This protocol provides a technique to harvest and culture explanted dorsal root ganglion (DRG) from adult Sprague Dawley rats in a multi-compartment (MC) device.

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia ...

생체공학

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

면역패닝에 의한 성체 마우스 배근 신경절 뉴런 배양의 농축

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

요약

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Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

면역패닝에 의한 성체 마우스 배근 신경절 뉴런 배양의 농축