We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

참고 : 대학 라발의 동물 관리위원회에 의해 관리로 모든 실험 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다 문화원에 부합에서 기관 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 4 세 사이 21개월 APP-PS1 수컷 마우스를 사용 하였다. 음식과 물을 무료로 이용할와 25 °의 C -이 동물은 22에서 12 시간 명암주기에서 보관 하였다. 1. 메 톡시 - X04 솔루션 준비 <ol><li> 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 45 % 프로필렌 글리콜 및 45 % 인산 나트륨 완충 용액 (100 mM의 인산 완충액에서 0.9 % NaCl을 함유하는 용액에 메 톡시 X04 용해 톡시 - X04 (9)의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 , 산도 7.4). <ol><li> 마이크로 저울을 사용하여 메 톡시 X04 화합물 5 mg의 무게. 흄 후드에서 DMSO에 톡시 - X04 녹이고 투명한 녹색 용액이 얻어 질 때까지 교반한다. 이어서 프로필렌 글리콜 pH를 추가각 추가로 교반하면서 생리 식염수를 버퍼 osphate. </li><li> 회 전자의 O / N 4 ° C에서 솔루션을 저어. 황색 녹색 에멀젼을 얻습니다. 용액을 저하없이 두 달 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 메 톡시 - X04 솔루션 주입 <ol><li> 이전에 24 시간의 관류는 쥐의 무게와 27 ½ G 바늘을 이용하여 체중의 10 ㎎ / ㎏의 투여 량에서 각 마우스에게 메 톡시 X04의 복강 내 주사를 준다. </li></ol> 주입 된 쥐의 3 Transcardial 관류 <ol><li> 관류 하루전, 인산염 완충 식염수 (PBS), 3.5 %의 아크롤레인, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (13)의 적절한 양을 준비하고 4 ° CO / N에이를 저장한다. 참고 :이 솔루션은 관류 모두 면역 조직 화학 사전은-포함에 사용됩니다. 아크롤레인 작업 때 모두 부식성 및 독성이 같은 특수주의연구자 및 환경. 아크롤레인 플라스틱 부식성 때문에 또한 항상 아크롤레인 용액​​을 조제 적합한 유리를 사용한다. </li><li> 관류 날, 25 ㎛의 입자 보존 거친 여과지를 사용하여 PFA 및 아크롤레인 필터. </li><li> 재관류 동안 25 ㎖ / 분의 유속, PBS 15 ㎖, 아크롤레인 75 mL를 연속적으로 순환 마우스 PFA 150 ㎖을 제공하는 연동 펌프를 사용한다. 주의하십시오. PFA 아크롤레인의 유해 가스를 피하기 위해 흄 후드 안쪽 엄격 관류를 수행한다. <ol><li> 펌프를 설정 PBS 용액에 한쪽 끝을 삽입, PBS로 (약 15 ml의 유지) 튜브를 작성하고 다른 쪽 끝으로 25 G 날개 혈액 수집 바늘을 해결합니다. 항상, 튜브 어떤 갇힌 공기 방울이 없는지 확인합니다. </li><li> PBS로 채워진 튜브로 관류 펌프를 설정 한 후 아크롤레인 병에 직접 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li>복강 27 ½ G 바늘을 사용하여 주입 나트륨 펜 토바 비탈의 체중 량의 90 ㎎ / ㎏로 한 번에 하나의 마우스 aesthetize. 꼬리 / 발가락 핀치에 대한 응답을 평가합니다. 마우스는 혐오, 고통스러운 자극에 응답하지 않는 경우에만 진행합니다. </li><li> 작업 표면에 앞발과 hindpaws 테이핑으로 (위쪽면과 뒷면에 누워) 앙와위에서 마우스를 안전하고 조심스럽게 다른 장기에 손상을주지 않고 심장​​을 노출. 격막을 천공 한 후 신속하게 작동해야합니다. <ol><li> 흉곽에 꼬리를 시작 흉부 정중선을 따라 수술 용 가위로 피부를 통해 절개를 수행하고 쇄골에 주동이를 진행합니다. </li><li> 복부 흉곽의 기본을 따라 두 개의 추가 횡 절개를합니다. 조심스럽게 이동하고 전체 흉강을 노출해야하고, 피부의 두 날개를 핀. </li><li> 흉강을 노출 무딘 집게와 칼 모양의 과정을 잡고 날카로운 가위를 안정에스. 다이어프램과 흉곽을 통해 잘라 폐 천공되지 않도록주의하면서, 그리고 쇄골에 절개 주동이를 계속합니다. 격막을 천공 한 후 신속하게 작동해야합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 무딘 집게와 함께 심장 막 주머니를 찢어. , 무딘 집게로 꾸준한 마음을 잡고 우심방을 절감하고, PBS의 주입을 시작합니다. 즉시 좌심실로 혈액 수집 바늘을 삽입합니다. </li><li> 다음 (150 ml의에 해당) 6 분 동안 PFA로 전환 (75 ml의에 해당) 3 분 동안 아크롤레인 다음 PBS와 마우스를 (튜브)에 관류. 튜브에 들어 거품을 방지하기 위해 솔루션을 전환하기 전에 펌프 흐름을 일시 중지해야합니다. </li><li> 마우스를 목을 벨과 고정 뇌를 추출하고 4 ° C에서 적어도 2 시간 동안 4 % PFA를 포함하는 유리 병에 직접 배치합니다. <ol><li> 뇌를 추출하려면, 두개골을 노출 피부를 통해 절단 가위와 핀셋을 사용합니다. 조심스럽게 두개골 연산 휴식눈 사이에 엉, 그것의 작은 조각을 칩은 기본 뇌를 노출합니다. </li><li> 조심스럽게 vibratome 절편에 대한 진행하기 전에 추가로 2 시간 동안 4 % PFA로 노출 된 뇌 및 사후 수정을 제거합니다. </li></ol></li></ol> Vibratome를 사용하여 4. 뇌 단면 <ol><li> 냉장 PBS로 고정 된 뇌를 3 회 반복한다. 예리한 면도날을 사용하여 (이 영역은 조사가 아닌 경우) 후각 망울을 제거하고 (2)에 횡 뇌 컷 - 절차를 가속화하기 위해 동시에 절단 할 수 모두 거의 동일한 높이의 3 개. </li><li> 수직 트레이에 고정 된 표본 판에 뇌 조직의 조각을 접착제. 매끄러운 절단면이 시편 판에 단단히 스틱과 절편 과정에서 빠질되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 전체 뇌 표면이 완전히 침수 될 때까지 트레이에 충분한 PBS 솔루션을 추가합니다. 일을 유지하는 것이 중요합니다전자 뇌 조각과 다음 섹션은 완전히이 단계를 통해 PBS에 몰입. </li><li> 상기 vibratome에 트레이를 배치 0.5 mm / 초, 90 Hz의 주파수의 단면, 50 μm의 두께 부분을 수득하기 위해 50 μm의 공급 두께로 절편 속도를 조절한다. 그런 미세한 붓을 사용하여 동결 방지제 용액 (40 % PBS, 30 % 에틸렌 글리콜, 30 % 글리세롤)를 함유하는 20 mL 유리 바이알에 섹션을 옮긴다. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 튜브를 저장합니다. 다음 단계에 설명 된대로 또는 즉시 검사를 위해 PBS에 섹션을 유지합니다. </li></ol> 메 톡시-X04-스테인드 플라크의 존재에 대한 5 절 심사 <ol><li> 정위 마우스 뇌의 지원은 예를 들면 관심 영역을 포함하는 (14) 선택 뇌 부분, 본 실시 예에서 사용 된 해마 CA1 Atlas에서와. 충분히 동결 방지제 용액을 함유하는 24 웰 배양 플레이트 내의 웰에 각 부를 배치수 있도록하는 것은 마르지 섹션을 방지합니다. </li><li> , 섹션을 건조 다음 절차를 사용하지 않도록 연속적으로 각 섹션을 검사 : <ol><li> 일회용 피펫과 현미경 슬라이드에 PBS의 방울을 추가하고 방울 섹션을 배치합니다. </li><li> 메 톡시 X04 표지 Aβ 플라크를 포함하는 영역을 식별하기 위해 형광 현미경 섹션을 검사합니다. 주 : 메 톡시 X04 쉽게 형광 자외선 (UV) 필터 (여기 340-380 나노 미터)을 이용하여 가시화 될 수있다. </li></ol></li><li> 구조적 영역에 직접 플라크의 존재를 연관시키기 위해 각 이미지는 두 필드의 동일한 영역을 표시해야하기 때문에, 현미경 스테이지를 이동하지 않고 시야 관심 (ROI)의 영역의 이미지뿐만 아니라 형광 모드에서 캡처 조직 섹션. </li><li> 저장하고 동물의 수에 따라 촬영 한 이미지의 이름을 지정합니다. 또한 플레이트의 웰 번호와 사진의 분야 TA 기록시야. 예를 들어, 예 : 9978A1B; 동물 번호 : 9978; 그럼 번호 : A1; 이 필드 : 밝은. 이미징이 완료되면 다시 잘 지정에 섹션을 놓습니다. 참고 : 결국, 조사 각 섹션에 대해,이 사진은 밝은 분야에서 하나 UV 분야에서 서로를 얻을 수있다. </li><li> 웰의 수에 따라 이미지 J 동일한 ROI의 두 이미지 (시야에서 하나 UV 필드에서 다른)를 열고 MosaicJ 플러그인을 사용하여 상기 두 이미지의 에지를 정렬 및 정렬과 함께 이미지를 저장 그것을 온. </li><li> 특정 동물의 수에 따라 별도의 폴더에 사진을 저장합니다. 식별 조직 절편에서 플라크 지역화, 두 가지 필드 (밝고 UV)의 전체 부분의 전체 뷰를 가지고 이미지를 결합한다. </li><li> 스크리닝 처리 종료 후 면역 또는 추가 처리는 CA가 될 때까지 동결 방지제를 함유하는 24 웰 배양 플레이트에서 -20 ° C에서 조사 된 부분을 저장할아웃 rried. </li></ol> 6. IBA1에 대한 면역 염색을 중고-포함 참고 : RT에서 천천히 이동 로커에있는 플레이트에 배치하여 선택 자유롭게 부동 섹션에 IBA1에 대한 면역 염색을 수행합니다. <ol><li> 철저 약 1 ml의 PBS, 10 분 동안 지속되는 각각의 세척과 섹션 3 회 씻는다. </li><li> 10 분 동안 PBS 용액에 0.3 % 과산화수소 내인성 퍼 옥시다아제 담금질. 이 단계는 백그라운드 염색을 방지하기 위해 중요하다 비특이적 퍼 옥시 다제 활성을 방지한다. </li><li> 10 분 각각에 대해 PBS에 3 번 조직을 씻으십시오. </li><li> 30 분 동안 PBS 용액에 0.1 % 소듐 보로 하이드 라이드의 섹션을 인큐베이션. 이 단계는 정착 단계에서 남아있는 알데히드를 줄이는 것이 중요하며, 아크롤레인 조직 정착에 사용되는 경우 특히 중요하다. </li><li> 10 분마다 시간 동안 PBS 3 회에서 조직을 씻고 모든 거품을 제거해야합니다. </li><li> 1 시간 동안 절을 차단합니다.다른 항체는 서로 다른 차단 시간 및 솔루션을 필요로 할 수있다. (; pH 7.4의 TBS) IBA1를 들어, 10 % 소 태아 혈청, 3 % 소 혈청 알부민 및 0.01 % 트리톤 X-100의 50 mM 트리스 - 완충 식염수를 함유하는 블록킹 완충액 제조​​. 주 : 차단 단계는 상기 일차 항체의 비특이적 결합을 방지하기위한 것이다. 트리톤 X-100의 낮은 농도는 더 나은 염색 막 약간의 permeabilization을 허용하고, EM에서 조직의 대부분의 미세 기능을 보존 할 정도로 낮다. </li><li> 4 ° CO / N에서 : 조직에서 차단 버퍼를 제거하고 차 항체 용액에 부화 (차단 버퍼 [1000 1] 희석 토끼 항 IBA1). </li><li> 10 분 때마다 TBS에서 3 회 반복한다. </li><li> 90 분 동안 0.05 M TBS에서 : 이차 항체 (비오틴에 접합 된 염소 항 - 토끼) [200 일]을 품어. </li><li> 5 분마다 시간을 TBS에 5 회 반복한다. </li><li> TBS에 아비딘 - 비오틴 복합체 용액 (: [100 (1), 아비딘 비오틴 [100 (1)]) 부화1 시간 동안 솔루션입니다. </li><li> 5 분마다 시간을 TBS에 5 회 반복한다. </li><li> 0.05 %의 디아 미노 벤지딘 (DAB), 8 분 동안 TBS 0.015 % 과산화수소와 IBA1 염색을 보여준다. 주 : DAB 개발 타이밍 프로토콜 프로토콜에 따라 다를 수 있고 신속하게 광학 현미경 하에서 염색 된 부분을 검사하여 결정되어야한다. 참고 : IBA1를 들어, 하나는 (대표 예를 들어 그림 2 참조) 분명 20 배에 IBA1 묻은 미세 아교 세포의 세포 기관과 프로세스를 시각화 할 수 있어야한다. 이 알려진 발암 물질로, DAB를 사용하여주의하십시오. </li><li> 위에서 설명한대로 조심스럽게이 단계에서 섹션을 모니터링하여 이상 현상 마십시오. 5 분마다 시간 동안 냉장 PB 5 번 섹션을 세척하여 반응을 중지합니다. </li></ol> 전자 현미경 7. 처리 <ol><li> 유리 병에 PBS에 1 % 산화 오스뮴 솔루션을 준비합니다. 사 산화 오스뮴은 감광성이고; g을 커버알루미늄 호일 아가씨 유리 병은 빛의 솔루션을 보호 할 수 있습니다. 그것은 매우 위험한 화학 물질로 산화 오스뮴을 사용하여주의하십시오. 이것과 흄 후드 내에서 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> 섹션에서 PBS를 제거하고 평판 좋은 붓을 사용하여 확산. 마르지 섹션을 유지하기 위해 한 번에이 단계를 잘 하나를 수행합니다. 즉시 섹션에있는 주름을 영구적으로 될 것 같은, 산화 오스뮴을 추가 만 섹션을 깰 것이다 조직 포스트 오스뮴 고정을 평평하게하기 전에 부분을 평평하게해야합니다. </li><li> 겹치지 섹션을 방지하기 위해 전달 피펫 동시에 산화 오스뮴 한 방울을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 산화 오스뮴의 섹션을 담근다. 빛의 섹션을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 잘 커버. 참고 :이 단계는 섹션 내에서 지질를 해결합니다. 조직은 오스뮴 후 고정 후 매우 어두운 표시됩니다. </li><li> 섹션 오스뮴 테트에있는 동안xide은 20 g의 성분 A를 혼합하여 일회용 비이커에 플라스틱 수지를 제조 20 g 성분 B, 0.6 g 성분 C 0.4 g 성분 D. 상기 순서로 성분들을 함께 결합하고 또한 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 혼합 까지 균일 한 색이 얻어진다. </li><li> 알루미늄 무게 요리로 준비된 혼합물을 전송합니다. 그들은 탈수 한 후 그들은 조직 절편을 받게됩니다. </li><li> 35 %, 35 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 % 다음의 순서로 2 분 동안 에탄올 농도 증가의 섹션 탈수. </li><li> 2 분 때마다 3 회, 잔류 에탄올을 제거 프로필렌 옥사이드의 섹션을 빠져들게합니다. 20 ㎖ 유리 병에 24 웰 배양 판에서 탈수 섹션을 제거합니다. 항상 플라스틱을 용해로 프로필렌 옥사이드로 작업 할 때 유리 병을 사용하고 유해 한,주의를 유지한다. </li><li> 프로필렌 옥사이드 soluti에서 섹션을 전송하는 구부러진 유리 피펫 팁 또는 벌금 붓을 사용하여수지에과에하면 RT에 침투하기위한 O / N 두십시오. 프로필렌 옥사이드와 수지를 희석하지 않도록주의하십시오. </li><li> 폴리 클로로 트리 플루오로 에틸렌 (PCTFE) filmsheets의 수지 부분을 포함 : <ol><li> PCTFE의 filmsheets에 섹션을 삽입하기 전에 15 분 - 10 60 ° C 오븐 - 50로 표본을 포함하는 알루미늄 무게 요리를 놓습니다. </li><li> 섹션을 포함하는 경우, 하나의 알루미늄 한 번에 요리 무게와 함께 작동합니다. 미세 붓을 사용하여, 하나의 PCT​​FE 필름 시트 상 수지 박막 페인트. </li><li> PCTFE 필름 시트에 접시 무게 알루미늄에서 한 번에 조직의 한 부분으로 이동합니다. 그것을 방해하지 않도록주의, 조직 주위에서 초과 수지를 제거합니다. </li><li> PCTFE 필름 시트 접시 무게 하나에서 모든 섹션을 이동 한 후, 조직의 샌드위치를​​ 만드는 첫 번째 통해 두 번째 PCTFE 시트를 배치하고 2 시트 사이에 수지. </li></ol></li><li> (5)에서 3 일 동안 항온 수지를 중합5-60 °의 C. </li><li> 소재는 지금 초박막 절편과 미세 검사, 자주 EM 핵심 시설에 의해 수행되는 전문 기술에 대한 준비가되어 있습니다. 미세 저하없이 실온에서 안전하게 PCTFE 필름 시트 사이의 샘플을 저장합니다. 참고 초박 절편 및 전송 전자 현미경 검사를위한 후속 단계는 별도의 프로토콜 (13)에 설명되어있다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 EM과 고밀도 코어 Aβ 플라크를 대상에 대한 상호 접근 방법을 설명합니다. 생체 내 주입에 톡시 - X04은 예를 들어, 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare을 Aβ의 특정 지역 내 플라크와 관심의 층을 포함하는 뇌 부분을 신속하게 선택할 수 있습니다. 본 예에서, 메 톡시 X04 사전 심사는 소교 표현형은 고밀도 코어 Aβ 플라크의 존재 하에서 미세 수준에서 시냅스와 상호 작용하...

아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크 형성은 알츠하이머 병 (AD)의 주요 신경 병리학 적 특징이다. 그러나 증거가 증가 질병 진행 1,2-에서 면역계의 중요한 역할을 시사한다. 특히, 전임상 및 임상 시험의 새로운 데이터는 AD 병리에 대한 기본 드라이버와 기여 면역 기능 장애를 설립했다. 이러한 연구 결과를 통해, 중추 및 말초 면역 세포는 AD 3으로 유망한 치료 목표를 등장했습니다. 다음 프로토콜은 아밀로이드 베타 플라크 증착 및 AD에서 소교 표현형 변화 사이의 관계에 대한 새로운 통찰력을 생성하는 빛과 전자 현미경 (EM)을 결합한다. 이 프로토콜은 형광 염료 메 톡시 X04의 생체 내 주입에 사용 AD의 마우스 모델에서 Aβ 플라크의 표시를 할 수 있습니다. 메 톡시 X04 쉽게 뇌 실질을 입력 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 높은 β-와 주름진 시트를 결합 할 수있는 콩고 레드 유도체ffinity. 형광 염료이기 때문에, 두 개의 광자 현미경 4 Aβ 플라크 침착의 생체 내 검출을 위해 사용될 수있다. 일단 Aβ에 결합, 메 톡시 X04은 해리 또는 플라크에서 멀리 재배포, 그것은 시간이 지남에 따라 그 형광을 유지하지 않습니다. 일반적으로 뇌 역학 (5)의 비 침습성 영상화를 허용하는 주변으로 투여된다. 형광도 상관 사후는 Aβ 플라크 (6) 부근의 신경 세포의 죽음에 대한 조사를 포함하여, 분석을 허용 알데히드 고정 다음 남아있다. Aβ을 나타내는 7 (APP 유전자 Lys670Asn / Met671Leu에서 이중 돌연변이를 coexpressing, 인간의 프레 PS1-A264E 변형 APP-PS1)이 프로토콜은 APP SWE / PS1A 246E 마우스에서 뇌 섹션을 선택 메 톡시 X04의 특성을 활용 특정 관심 영역 (해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에 플라크) 소교 세포 기관 및 EM과 프로세스를 시각화)가 소교 마커 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 1 (IBA1에 대한 면역 염색을 임베딩 사전하기 전에. 생쥐는 transcardial 관류를 통해 24 시간 이전에 뇌 고정에 메 톡시 X04 솔루션의 복강 내 주사 주어집니다. 코로나 뇌 섹션은 vibratome를 사용하여 얻을 수있다. 해마 CA1을 포함하는 섹션은 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare에서 Aβ 플라크의 존재에 대한 형광 현미경으로 상영된다. IBA1 면역 염색, 산화 오스뮴 후 고정하고, 플라스틱 수지 매립는 선택된 뇌 구역에서 수행된다. 이 프로토콜의 끝에서, 섹션은 초박 절편 및 미세 시험에 대한 준비가 더 미세 저하없이 보관할 수 있습니다. 중요한 것은, 플라크는 여전히 본 프로토콜로 인스턴스 IBA1를 들어, 다른 항체와 면역 염색 후 형광등된다. 그들은 어두운 t이 될한 산화 오스뮴 후 고정 다음 그 주변 neuropil는 독립적으로 정확하게 몇 평방 밀리미터 일반적으로 아래의 관심 영역을 식별하는 데 도움이 메 톡시 X04 염색의 투과형 전자 현미경으로 검사한다. 이 상호 접근은 미세 수준에서 조사하는 뇌의 특정 부분을 식별 할 수있는 효율적인 방법을 제공한다. 단지 조직 절편의 작은 분획에 존재하는 약간의 Aβ 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 특히,이 시간 동안, 단순히 적절한 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 분획을 수득 몇몇 뇌 부분에 (예 IBA1 다른 세포 마커 및 이중 라벨링) Aβ에 대한 면역 염색을 사용하는 것이 비효율적 일 수있다. 메 톡시 X04 라이브 마우스 또한, 사출 희생 및 조직 처리 compromis을하지 않습니다하기 전에미세 구조 보존 전자. 이러한 고정 된 조직 섹션에 콩고 레드, Thioflavin S, Thioflavin T 또는 메 톡시 X04와 사후 염색 등의 다른 방법은 에탄올 염색 차별화, 삼투 스트레스의 원인과 미세 구조를 방해 8-11을 필요로한다. 콩고 레드는 알려진 발암 물질 (12)이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1006">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Methoxy-X04</td>
			<td style="width:197px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">10 mg substrate per tablet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W294004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrolein&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110221</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Granular</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-790-14F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peristaltic Pump with Tubing</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>cp.78023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Winged blood Collection Set Needles 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extrafine Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11152-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14004-16</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ surgical store</td>
			<td>5818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74515-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>14047235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome blades</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>71990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td>J.T.BAKER</td>
			<td>cat: 2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C001H24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti IBA1, Rabbit&#160;</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111066046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905-50TAB</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osmium tetroxide, 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44611</td>
			<td>Resin Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44612</td>
			<td>Hardener Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44613</td>
			<td>Plasticizer Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44614</td>
			<td>Accelerator Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>LesAlcoolsdeComerce</td>
			<td>151-01-15N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110205</td>
			<td>Caution: corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70048-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACLAR&#174;&#8211;Fluoropolymer Films</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven/Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

상세한 프로토콜은 이전에 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 섹션 아밀로이드 Aβ 플라크를 식별하기 위해 여기에서 제공되는 미리 매립 면역 및 조직 처리 (구체적으로는 이온화 된 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1), 미세 아교 세포에 의해 발현되는 칼슘 결합 단백질) 전자 현미경 (EM). 메 톡시 X04은 고밀도 코어 Aβ 플라크에서 발견 된 β-주름 시트에 바인딩 선택적으로 혈액 - 뇌 장벽을 통과하고 형광 염료입니다. 메 톡시 X04과 동물의 주입 전에 희생 뇌 고정 미리 선별하고 시간 소모적 인 조작으로 추가 처리를 위해 플라크 함유 뇌 구간 선택을 허용한다. 섹션의 작은 분획에 존재하는 거의 플라크를 포함 할 수있는 특정 뇌 영역 또는 층 내의 초기 AD 병리를 연구 할 때 특히 유용하다. 콩고 레드, Thioflavin S, 및 Thiofl와 조직 섹션의 사후 처리AVIN의 T (또는 메 톡시 X04과)는 β-주름 시트 레이블을하지만, 여분의 염료를 제거하기 위해 에탄올 광범위한 청산이 필요하며 이러한 절차는 미세 보존과 호환되지 않습니다 수 있습니다. 또한 단지 올바른 위치에서 Aβ 플라크를 포함하는 작은 부분을 산출하기 위해, Aβ (및 IBA1 같은 다른 세포 마커) 관심있는 지역의 모든 뇌 부분에 대한 표시를 수행하는 비효율적 인 것입니다. 중요한 것은, Aβ 플라크는 전자 현미경으로 검사 할 영역의 정확한 식별 (일반적으로 몇 평방 밀리미터에 이르기까지)을 허용, EM을위한 조직 처리 후에도 볼 수 있습니다.

이 섹션은 프로토콜의 다른 중요한 단계에서 획득 할 수있는 결과를 나타낸다. 해마 CA1, 지층 radiatum 및 lacunosum-moleculare : 특히 결과는 뇌 메 톡시 X04 스테인드 특정 지역에 플라크와 관심 층을 포함하는 섹션의 예를 보여줍니다. 플라크 및 해마의 라멜라 / 지방 조직은 연속 UV 밝은 필드 필터 (도 1)의 조합을 사용하여 가시화된다. 선택된 뇌 섹션 이후 면역 염?...

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Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다.

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K 조회수.  CHU de Québec Research Center.  이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다. 

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

연구

신경과학

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

에 타고난 및 시간주기 규제 Photobehavior을 공부하는 빛 환경의 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

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