Name: one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

인간의 혈액은 국립 칭화 대학의 임상 시험 심사위원회, 신주, 대만의 사전 서면 동의 및 승인을 건강한 지원자에서 수집 하였다. E.에서 재조합 HP-NAP의 1 식 대장균 <ol><li> H.에서 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 pET42a-NAP 준비 파이로리 26695 균주는 이전 16 설명했다. 설명 된 바와 같이 원하는 포인트 돌연변이 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 준비 (프로토콜, 단계 8 참조). </li><li> E.에 상기 DNA 플라스미드 10 ng의 변형 대장균 BL21 (DE3) 42 ° C 45 초 동안 열 충격에 의해 유능한 세포, 행진 50 μg의 / ㎖ 카나마이신, 그리고 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 포함 판 한천 원성 국물에 세포 (LB). </li><li> 50 μg의 / ㎖ 카나마이신과 LB 배지 5 ㎖를 포함하는 각각의 튜브에 단일 콜로니를 접종하고 3에서 precultures로 성장170 rpm으로 진탕 16 시간 동안 11 ° C를. </li><li> 1 L 플라스크를 50㎍ / ㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 200 ㎖에 상기 예비 배양 세포를 2 ㎖를 접종한다. 대략적은 UV / VIS 분광 광도계에 의해 검출 0.4-0.5 도달 내지 600 nm에서의 흡광도까지 170 rpm으로 진탕하면서 2 시간 동안 37 ℃에서 접종 된 배양 플라스크를 인큐베이션. </li><li> HP-NAP의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 상기 배양에 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)의 80 μL를 추가한다. 약 1.6-1.7에 도달 내지 600 nm에서의 흡광도 때까지 3 시간 동안 문화를 품어. </li><li> 원심 분리기에서 15 분 동안 4 ℃에서 6,000 XG에 세포 상층 액을 제거한다. 정화 될 때까지 -70 ℃에서 세포 펠렛을 저장합니다. </li></ol> HP-NAP를 포함하는 가용성 단백질 분획 2. 제조 참고 : 다음 단계는 모두 4 ℃에서 수행된다. <ol><li> 셀 (p)의 재현 탁 50 ㎖에서 프로토콜 단계 1.6에서 제조 ellet 20 20 mM 트리스 - 염산, pH가 9.0, 50 mM의 NaCl을 함유하는 0.13 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 0.03 mM의 N 알파 토실-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) 및 0.03 ml의 4 ° C에서 mM의 N-토실-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)는 이전과 같이 16을 설명했다. </li><li> 39 ° C에서 7 시간 15,000 20,000 PSI의 범위에서 작동되는 고압 균질화 통해 세균 현탁액을 전달하여 균체를 방해. </li><li> 원심 1 시간 동안 4 ℃에서 30,000 × g에서 파쇄를 초 원심 분리기를 사용하여 가용성 및 불용성 단백질 분획을 분리한다. 비커에 수용성 단백질 분획으로 뜨는을 전송합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)과 상업용 키트를 사용하여 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 가용성 단백질 분획의 단백질 농도를 측정한다. </li><li> 제 20 ㎖에 1 N 염산의 177.6 μl를 추가pH를 8.0으로 pH를 9.0의 pH 값을 조정 프로토콜 단계 2.3로부터 얻어지는 전자 수용성 단백질 분획. </li><li> 최종 단백질 농도가 0.5 ㎎ / ㎖가 될 수 있도록 상기 단백질 용액을 20 mM의 트리스 -HCl, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 추가. </li></ol> E.에서 재조합 HP-NAP 3. 정제 DEAE 이온 교환 수지에 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피에 의한 대장균 <ol><li> DEAE 수지 15 ml의를 준비합니다. <ol><li> DEAE 수지 중 0.6 g 건조 분말의 무게를 적어도 1 일 동안 실온에서 20 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 30 mL의에 중단. </li><li> 10,000 X에서 수지를 원심 분리기 1 분 4 ° C에서 g. </li><li> 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 염화나트륨의 15 ML을 추가합니다. </li><li> 프로토콜 3.1.2 사 3.1.4에 번 단계를 반복합니다. </li><li> 15 ml의 후속 사용을 위해 4 ℃에서 수지 (30 ㎖ 트리스 완충액 중의 50 % 슬러리)을 정착 저장한다. 주 : 다음 단계의 모두의 4 ° C에서 수행된다. </li></ol></li><li> 수지의 15 ml의 프로토콜 단계 2.6에서 제조 된 수용성 단백질의 45 ML을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 자석 교반기와 단백질 / 수지 슬러리를 교반한다. </li><li> 스톱 콕이 장착 된 플라스틱 또는 유리 컬럼에 단백질 / 수지 슬러리를 따르십시오. 수지가 중력 정착하도록 허용합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 열을 실행할 수 있도록하는 콕을 열고. 플로우를 통해 정제 된 HP-NAP를 포함하는 언 바운드 분수 등을 수집합니다. </li><li> 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 NaCl을 15 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 아니라 수지를 초과 할 때까지 세척 완충액이 중력 흐름에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 세척 분획으로서 수집. </li><li> 의정서는 추가 세척 분수를 수집하기 위해 3.5 네 3​​.6 번 단계를 반복합니다. </li><li> 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 1 M NaCl을 15 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 용출 완충제는 중력 유동에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 용출 분획으로서 수집. </li><li> 프로토콜이 추가​​ 용출 분수를 수집하기 위해 3.8 네 3.9 번 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 버퍼 Exchange 및 DEAE 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피로 정제하여 HP-NAP의 독소 제거 참고 : 정제 된 HP-NAP는 E. 표현 대장균 교환 및 호중구를 자극하기 전 독소 제거 버퍼링 실시 할 필요가있다. <ol><li> 이전 24 바와 같이 14 kDa의 분자량 컷오프 투석 튜빙을 사용하여 4 ℃에서, 둘 베코 인산 완충 생리 식염수 (D-PBS), pH를 7.2로 정제 HP-NAP의 버퍼를 변경 투석을 수행한다. </li><li> syring를 통해 투석 HP-NAP 필터독소를 제거하기 위해 4 ℃에서 2.5 내지 4 ㎖ / 분 범위의 유속으로 20 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 양으로 하전 된 친수성 ​​막과 E 필터. </li></ol> 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 웨스턴 블로 팅, 기본-PAGE, 젤 여과 크로마토 그래피하고, 원 편광 이색 분광학에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP의 분자 특성 5. 특성 <ol><li> 마우스 단일 클론 항체 단클론 항체 16F4 (25)를 포함하는 하이 브리 도마 배양 상층 액과 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP 분석으로 이전 24 설명했다. </li><li> 이전 26 바와 같이 올리고머의 상태를 검사하는 네이티브-PAGE 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정제하여 HP-NAP 분석. </li><li> 이전 26 설명 된 바와 같이 그 차 구조를 조사하기 위해 원 편광 이색 분광기에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP를 분석합니다. </li></ol> SDS-PAGE 젤의 실버 염색하여 HP-NAP의 순도 6. 평가 <ol><li> 실버 염색 키트 제조업체의 지시에 따라, 용액은 용액, 현상액 민감 정착 용액을 조제 액을 정지하고, 세정 용액. </li><li> 실버 염색 키트 제조업체의 지침에 따라 SDS-PAGE 젤은 염색을 수행합니다. </li><li> 촬상 시스템 겔의 화상을 취득. </li></ol> HP-NAP에 의해 유도 된 호중구에서 ROS 생산 7. 측정 <ol><li> 이전 24 바와 같은 밀도 구배 원심 분리하여 인간 덱스 트란 침강 헤파린 혈액으로부터 인간 호중구를 분리. </li><li> 호중구에서 ROS 생성의 측정은 루미놀 의존 화학 발광 분석을 사용하여 HP-NAP 자극. <ol><li> 접시 리더의 전원을 켜고 37 ° C의 온도를 설정합니다. 배치그것은 37 ° C로 예열 할 수 있도록 플레이트 리더 챔버 내부의 빈 평평한 바닥 96 웰 흰색 접시. </li><li> 유무와 0.9 mM의 CaCl2를 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 13.3 μM 5- 아미노 -2,3- 디 히드로 -1,4- phthalazinedione (루미놀)를 포함하는 상기 D-PBS, pH를 7.2에서 부양 혼합물을 준비 프로토콜 단계 4.2에서 준비 0.67 μm의 독소를 제거 HP-NAP의. </li><li> 5 mM의 포도당을 함유하는 D-PBS, pH를 7.2에서 7.1 × 106 내지 2 세포 / ㎖, 프로토콜 단계에서 제조 된 인간 호중구의 농도를 조정한다. </li><li> 96 웰 동안 플레이트의 각 웰에 호중구 현탁액의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 웰 당 5 초 간격으로 웰에 호중구 함유 프로토콜 단계 7.2.2에서 제조 한 자극의 혼합물 150 μl를 추가한다. </li><li> 플레이트 판독기를 사용하여 한 3 시간에 걸쳐 웰 당 5 초 동안 화학 발광의 발광을 측정한다. </li></ol></li></ol> 8.중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 DNA 플라스미드 숨겨 HP-NAP 돌연변이의 건설 사이트에 직접 돌연변이 유발을 기반 참고 : &quot;침묵&quot;제한 부위가 부위 특이 적 변이 (SDM) -assist 소프트웨어 (28)에 의해 돌연변이 유발 프라이머에 도입 된 것을 제외하고 이전 27 설명 된대로 PCR 기반의 사이트에 직접 돌연변이는 기본적으로 생성되었습니다. <ol><li> PCR 반응을 수행합니다. <ol><li> 최종주는 플라스미드 pET42a-NAP 10ng의 표 1에 열거 된 돌연변이 유발 성 프라이머 쌍을 1 μM, 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (dNTPs를), 및 탈 이온수를 함유하는 PCR 튜브에 고성능 PCR 효소 믹스 3 유닛 200 μM 추가 25 μL의 볼륨. </li><li> 95에서 PCR 사이클을 시작 10 분 동안 ° C가 주형 DNA를 변성하고, 1 분 동안 95 ° C에서 12 증폭 사이클에 따라, T는 1 분 C ° -5 더 m이없고, 6 분 72 입출력 C. </li><li> 하여 PCR 사이클을 완료1 분의 T m PP -5 ℃로 어닐링 단계와 30 분 동안 72 ℃에서 연장 단계. </li></ol></li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 DPN I 제한 효소 0.4 μL와 PCR 생성물의 15 μl를 처리 한 후 아가 로스 겔 전기 영동으로 처리 DPN I-PCR 생성물의 2 μL를 분석한다. </li><li> 화면 돌연변이. <ol><li> E.으로 PCR 생성물의 2 μL 변환 42 ° C에서 45 초 동안 열 충격에 의해 대장균 DH5α 유능한 세포. </li><li> 를 50㎍ / ㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 확산하고 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 알칼리 용해 키트를 이용한 박테리아 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 원하는 침묵 돌연변이의 존재를 확인하기를 XhoI 제한 효소로 프로토콜 단계 8.3.3에서 격리 플라스미드 DNA를 처리한다. </li><li> 시퀀스플라스미드 DNA는 제조자의 프로토콜에 따라 HP-NAP 돌연변이 체의 코딩 서열의 보정을 확인하기 위해 T7 프로모터 프라이머 프로토콜 단계 8.3.4로 확인 하였다. </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis.">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+'silent'+restriction+sites.">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li></ol>

HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

여기서 제시 DEAE 음이온 교환 수지와 네가티브 모드 배치 크로마토 그래피 E 대장균 과발현 재조합 HP-NAP의 정제에 적합하다. 세포 용해 및 정제의 단계에서 사용 된 완충액의 pH 값은 E.에서 HP-NAP의 용해도를 보장하기 위해 매우 중요 대장균 해물 각각 숙주 세포 불순물 재조합 HP-NAP를 효율적으로 분리. 균체을 pH 9.0에 용해되어야하고, 음의 정제는 높은 수율 및 고순도 HP-NAP를 ?...

헬리코박터 파이로리 (H. pylori의)는 위염 및 소화성 궤양의 주요 원인이다. 이 박테리아는 또한 암, 세계 보건기구 (WHO)의 일부 연구에 대한 국제기구에 의해 인간 발암 물질로 분류되어, 1994 년에 그것은 추정되었음을 H.의 보급 pylori 감염은 개발 도상국의 70 %와 선진국 (1) 30 ~ 40 %이다. 비록 H.의 감염률 파이로리는 산업화 된 국가에서 H.의 감염률을 감소 개발 도상국에서 파이로리는 여전히이 높다. 표준 치료는 H.을 근절하기 pylori 감염은 프로톤 펌프 억제제, PPI, 2 개의 항생제, 클라리스로 마이신 플러스 아목시실린 또는 메트로니다졸 (3)의 관리로 구성되어 있습니다. H. 항생제 내성 그러나, 상승 파이로리는 궤양 치료 O 방지하는 새로운 전략의 개발을 촉구 - 관련R 감염을 치료. H.에 대한 예방 및 / 또는 치료 백신 개발 H. 파이로리를 제어하는 대안적인 방법을 제공 할 수있다 pylori 감염. 헬리코박터 파일로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP), H 파일로리의 주요 독성 요인은 첫째 H.의 물 추출물에서 확인되었다 내피 세포 및 활성 산소 종 (ROS) (4)를 생성하기 위해 접착 호중구 활성화하는 능력 파이로리. H.에서 발견 된 위 점막의 호중구 침윤 pylori- 활성 위염에 감염 환자는 위장의 염증과 조직 손상 될 수 있습니다. 따라서, HP-NAP는 상기 궤양 H. 발생 위장 염증을 유도 호중구 활성화에 의해 병리학적인 역할을 할 수있다 파이로리는 위 질병을 -associated. 그럼에도 불구하고, HP-NAP 임상 응용 5,6에 대한 잠재적 인 후보입니다. 때문에 면역 원성 및 면역 프로에HP-NAP의 perties이 단백질은 백신, 치료제 및 진단 도구 개발하는데 사용될 수있다. 임상 실험은 H. 대 단백질 백신의 성분의 하나로서, 재조합 HP-NAP를 사용해 수행 한 파이로리. 이 백신은 수산화 알루미늄 제형 재조합 HP-NAP, 세포 독소 - 관련 유전자 A (cagA 유전자) 및 vacuolating 세포 독소의 A (바카) 단백질로 구성되며 상기 안전하고 인체 7 원성 것으로 입증되었다. 또한, HP-NAP는 암 치료 (8)에 대한 면역 반응을 -polarized 아래로 알레르기 반응 및 기생충 감염 9,10에 의해 유발 TH2 매개 면역 반응을 조절하는 (받은 Th1) T 도우미 타입 1을 트리거 강력한 면역 조절제 역할을합니다. 진단 같이, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 HP-NAP 대해 혈청 항체를 검출하기 위해 적용되어왔다 pylori 감염 환자 11 -infected. 한 연구는 보여 주었다 H.에서 혈청에서 HP-NAP 특정 항체의 수준 평로리는 위암 환자가 만성 위염 (12)을 가진 환자에서보다 유의하게 높았다 -infected. 또 다른 연구는 또한 HP-NAP에 대한 혈청 항체가 비 문부 위암 (13)의 존재와 연관된 것으로 나타났다. 따라서, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 위암의 예후에 대한 HP-NAP에 대한 혈청 항체를 검출하기 위해 적용 할 수있다 균은 환자 -infected. 함께 찍은, 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated. 재조합 HP-NAP의 정화에 사용하는 여러 방법 중에서 네이티브 형태의 대장균 (대장균)에서 발현 두번째 정제 단계를 포함하는 겔 여과 크로마토 그래피는 고순도 HP-NAP 14-16 얻기 위해 필요한, 지금까지보고 . 여기서, 마이너스 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하는 방법디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지는 E. 과발현 HP-NAP 정화용 설명 고 수율 및 고순도 대장균. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분에서 발견된다. 네거티브 모드에서 DEAE 이온 교환 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 간단하고 시간 미 결합 분획의 수집을 한 단계 크로마토 재조합 HP-NAP의 정화를 허용함으로써 절약된다. (17) 면역 글로불린 G (IgG의) 18, 헤모글로빈 19 단백질 포스파타제 (20) 및 독성 인자 편모 21 바이러스와 같은, 또한 음극에 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 정제하는 것으로보고 된 예 HP-NAP 여러 다른 생체 분자 이외에 방법. 불순물이 미량 인 경우 음의 모드는 이온 교환 크로마토 그래피 바람직대상 시료에 존재하는 구성 요소 (22)를 정제 할 수있다. 천연 또는 재조합 생체 분자의 정제에 부정적인 크로마토 그래피의 응용 프로그램은 최근에 23을 검토하고있다. 본 보고서는 E.에서 재조합 HP-NAP의 발현을위한 단계 프로토콜에 의해 단계를 제공합니다 콜라이, DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 이용하여 HP-NAP의 세포 용해 및 정제. 정제 목적 단백질이 네거티브 모드에서 이온 교환 크로마토 그래피에 적합한 경우, 설명 된 프로토콜은 또한 정제 공정의 개발을위한 출발점으로 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&amp;amp;supplier=search&amp;amp;name&lt;br/&gt;=IPTG%20</td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Protein standard (bovine serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&amp;nbsp;</td><td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&amp;ndash;Sephadex &amp;nbsp;A-25 chloride form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Spectrum/Por dialysis tubing</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>with molecular weight cutoff of 14 kDa&lt;br/&gt; http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Acrodisc&amp;reg; units with Mustang&amp;reg; E membrane</td><td>Pall</td><td>MSTG25E3</td><td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min&lt;br/&gt; http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&amp;nbsp; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>for gel filtration chromatography&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>PlusOne silver staining kit, protein</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure&lt;br/&gt;_16963/17144002</td></tr><tr><td>Flat bottom 96-well white plate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>protected from light&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Expand &amp;nbsp;long template PCR system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>source of High Fidelity PCR enzyme mix&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Product Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td><td>Hitachi&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>out of market and upgraded to a new model&lt;br/&gt; http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; lysates&lt;br/&gt; http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>for gel filtration chromatography&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>LAS-3000 imaging system</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>discontinued and replaced&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>for chemiluminescence detection&lt;br/&gt; http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

헬리코박터 파이로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP)은 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)의 주요 독성 요소이다. 또한 H.에 중요한 역할을 파이로리는 호중구, 단핵구 및 비만 세포를 포함한 여러 선천성 백혈구 활성화에 의해 유도 된 위장 염증. HP-NAP의 면역 원성 및 면역 속성은 H.에 대한 잠재적 인 진단 및 백신 후보 확인 유문 및 암 치료 용 신약 후보. 임상 적 용도에 사용 그래피 HP-NAP 상당량을 얻기 위해서 효율적인 방법은 높은 수율과 순도의 단백질이 확립되어야 정제한다. 이러한 프로토콜에서는, 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지를 이용하여 대장균 (E. 콜라이)에서 과발현 재조합 HP-NAP의 일 단계 제외 크로마토 그래피 정제 방법을 기술 하였다 (예., 세파 덱스)를 난n 개의 배치 모드. 재조합 HP-NAP는 E. 총 단백질의 약 70 %를 구성한다 대장균과 거의 완전히 pH를 9.0에서 세포 용해시의 가용성 분획에서 회수된다. pH가 8.0에서 최적의 조건에서, HP-NAP의 대부분은 언 바운드 분획에서 회수되는 반면, E.에서 내인성 단백질 대장균 효율적으로 수지에 의해 제거된다. DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 E.에서 기능적 HP-NAP를 얻을 높은 수율 및 순도의 기본 형태로 대장균. 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated.

재조합 HP-NAP의 부정적인 정제의 실험 절차의 개략도는 E. 표현 배치 모드에서 DEAE 이온 교환 수지를 사용하여 대장균은도 1에 도시된다. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 네이티브 형태의 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분 (그림 2A와 <stro...

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One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

재조합 헬리코박터의 원스텝 제외 정제 고 수율 방법에 대하여 설명한다 배치 모드에서 디 에틸 아미노 에틸 수지를 이용하여 대장균에서 과발현 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP) 파이로리. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 H. 백신, 약물, 또는 진단의 발전을 위해 도움이됩니다 파이로리는 질병을 -associated.

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em&gt; 호중구 - 활성화 단백질 과발현<em&gt; 대장균</em&gt; 배치 모드에서

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

9.6K 조회수.  National Tsing Hua University.  재조합 헬리코박터의 원스텝 제외 정제 고 수율 방법에 대하여 설명한다 배치 모드에서 디 에틸 아미노 에틸 수지를 이용하여 대장균에서 과발현 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP) 파이로리. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 H. 백신, 약물, 또는 진단의 발전을 위해 도움이됩니다 파이로리는 질병을 -associated. 

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Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

뉴클레아제 없는 산소 제거제 프로토카테의 발현 및 정제 3,4-디옥시게나아제

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

연구

생화학

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is also a key component in the development of new therapeutics. The evolving era of functional proteomics is fueling the demand for high-throughput protein purification and improved techniques to facilitate this. It was hypothesized that a multi column plate adaptor (MCPA) can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. This method offers an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum, rivaling the speed of an automated system. The MCPA can be used to recover milligram yields of protein by an affordable and time efficient method for subsequent characterization and analysis. The MCPA has been used for high-throughput affinity purification of SH3 domains. Ion exchange has also been demonstrated via the MCPA to purify protein post Ni-NTA affinity chromatography, indicating how this system can be adapted to other purification types. Due to its setup with multiple columns, individual customization of parameters can be made in the same purification, unachievable by the current plate-based methods.

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하는 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정화 시스템

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

생물학

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

면역학 및 감염병학

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many bacteria. There are a variety of methods for quantifying polyP in biological materials, many of which are either labor-intensive or insensitive, limiting their usefulness. We present here a streamlined method for polyP quantification in bacteria, using a silica membrane column extraction optimized for rapid processing of multiple samples, digestion of polyP with the polyP-specific exopolyphosphatase ScPPX, and detection of the resulting free phosphate with a sensitive ascorbic acid-based colorimetric assay. This procedure is straightforward, inexpensive, and allows reliable polyP quantification in diverse bacterial species. We present representative polyP quantification from the Gram-negative bacterium (Escherichia coli), the Gram-positive lactic acid bacterium (Lactobacillus reuteri), and the mycobacterial species (Mycobacterium smegmatis). We also include a simple protocol for nickel affinity purification of mg quantities of ScPPX, which is not currently commercially available.

We describe a simple method for rapid quantification of inorganic polyphosphate in diverse bacteria, including Gram-negative, Gram-positive, and mycobacterial species.

무기 Polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

qPCR 기반 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성에 대한 신속한 비침습적 진단

Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-Based Rapid Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Antibiotic Resistance

Helicobacter pylori is a major human pathogen that&#160;infects approximately half of the global population and is becoming a serious health threat due to its increasing antibiotic resistance. It is the causative agent of chronic active gastritis, peptic ulcer disease, and gastric cancer and has been classified as a Group I Carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. Therefore, the rapid and accurate diagnosis of H. pylori and the determination of its antibiotic resistance are important for the efficient eradication of this bacterial pathogen. Currently, H. pylori diagnosis methods mainly include the urea breath test (UBT), the antigen test, the serum antibody test, gastroscopy, the rapid urease test (RUT), and bacterial culture. Among them, the first three detection methods are noninvasive, meaning they are easy tests to conduct. However, bacteria cannot be retrieved through these techniques; thus, drug resistance testing cannot be performed. The last three are invasive examinations, but they are costly, require high skills, and have the potential to cause damage to patients. Therefore, a noninvasive, rapid, and simultaneous method for H. pylori detection and drug resistance testing is very important for efficiently eradicating H. pylori in clinical practice. This protocol aims to present a specific procedure involving the string test in combination with quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for the rapid detection of H. pylori infection and antibiotic resistance. Unlike bacterial cultures, this method allows for easy, rapid, noninvasive diagnosis of H. pylori infection status and drug resistance. Specifically, we used qPCR to detect rea for H. pylori infection and mutations in the 23S rRNA and gyrA genes, which encode resistance against clarithromycin and levofloxacin, respectively. Compared to routinely used culturing techniques, this protocol provides a noninvasive, low-cost, and time-saving technique to detect H. pylori infection and determine its antibiotic resistance using qPCR.

저자 스포트라이트: 헬리코박터 파일로리 감염의 발견 및 치료 

The protocol presents a noninvasive method for the rapid diagnosis of Helicobacter pylori stomach infections through the string test and determines its antibiotic resistance to clarithromycin and levofloxacin using quantitative polymerase chain reaction (qPCR).

정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기반 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 신속 진단

Helicobacter pylori is a major human pathogen that&#160;infects approximately half of the global population and is becoming a serious health threat due to ...

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제

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다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하는 경제적이고 다재다능한 고처리량 단백질 정화 시스템

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

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정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기반 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 신속 진단

정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 기반 헬리코박터 파일로리 감염 및 항생제 내성 신속 진단

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