The authors thank Professor H. Troy Ghashghaei from NCSU Department of Molecular Biomedical Sciences for providing the whole mouse tissue. The authors also gratefully acknowledge the financial assistance received from National Institutes of Health (R01GM087964), the W.M. Keck foundation, and North Carolina State University.

참고 : 다음 프로토콜은 IR-MALDESI MSI 실험을 수행하기위한 필요한 모든 단계를 설명합니다. 에서 심층 최적화 된 IR-MALDESI 소스의 형상과 레이저, 무대와의 동기화 및 질량 분석기에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 5,6 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 동물 조직 샘플은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 노스 캐롤라이나 주립 대학의 규정에 따라 얻었다. 1. 조직 준비 <ol><li> 흄 후드에서 드라이 아이스의 보조 용기 내부에 깨끗한 비커에 ~ 이소 펜탄 200 ㎖를 배치하여 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕을 준비합니다. 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕조와 조직을 취급 할 때는 항상 보호 장갑과 보안경을 사용하십시오. <ol><li> AVERTIN 과다에 의한 2 일된 전체 신생아 마우스 새끼 (7.5 밀리그램 / g 체중)를 안락사하고 조직 구조를 보존하기 위해 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕에서 조직을 동결. 미리 청소를 사용집게의 에드 쌍을 배치하고 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕에서 cryomold에 마우스 강아지를 제거합니다. 분석 할 때까지 -80 ° C에서 플래시 냉동 조직을 저장합니다. </li></ol></li><li> 보호 장갑을 사용하여, 40mm의 시험편 저온 유지 디스크에 최적 절단 온도 OCT () 실장 매체의 층을 적용한다. 조심스럽게 절편에 대해 원하는 방향으로 디스크에 마우스를 부착하려면 OCT 코팅 시편 홀더에 고정 된 전체 마우스를 놓습니다. 참고 : 2009 년 10 월 단독 절편에 대한 표본 디스크에 조직을 부착하기 위해 사용된다. OCT에서 완전하게 삽입 조직을 수행 간섭 단층은 MSI 분석에 해로운 영향을 미칠 것으로 알려져으로 초과하지 마십시오. 젤라틴과 같은 다른 매체는,도 9를 슬라이싱 전에 조직을 포함-크라이하는데 사용될 수있다. </li><li> 저온 유지 장치를 눌러 펠티어 전원 버튼에 펠티에 샘플 홀더에 OCT (및 조직 섹션) 디스크를 넣습니다. 시료가 열 평형에 와서 10 분 정도 기다립니다. </li><li> 조직이에 장착와 (시편 디스크를 배치디스크 홀더 내부 IT) 및 분석을 위해 원하는 평면까지 조직에 직면한다. 그라 이오 스탯 (10)의 내부에 수납 로터리 마이크로톰을 사용하여 -20 ° C에서 원하는 두께의 섹션으로 조직을 조각입니다. 주 : 전신 분석을 위해, 조직의 무결성을 유지하기 위해 25 μm의 두께의 부분에 조직 조각. 작은 영역 (예를 들어, 간, 뇌, 신장)의 경우, 10 μm의 두께 섹션으로 조직을 슬라이스. <ol><li> 롤로부터 분리 된 조직 절편을 방지 티롤 유리판을 사용한다. 원치 않는 조직 파편을 제거하기 위해 저온 유지 장치 진공 호스와 브러시를 사용합니다. 조직을 절개 한 후에, 개인적인 부상을 방지하기 위해 날카로운 마이크로톰 블레이드를 덮도록 날 가드를 사용한다. </li></ol></li><li> 오리엔트 마우스 시험편 판 섹션과 열을 건드리지 않고, 조직 절편에 최대한 가깝게 슬라이드를 가져와 사전 세정 된 유리 현미경 슬라이드 위에 해동 - 장착. 주 : 정량적 MSI의 체험관은사항, 코트 전에 조직을 설치에 자동 공기 분무기를 사용하여 내부 표준 슬라이드 및-해동 마운트 코팅 된 슬라이드 (11)에 조직 섹션을. </li><li> 블레이드 이젝터를 사용하여 조직을 절편에 사용되는 마이크로톰 블레이드를 제거하고 안전하게 적절한 &quot;날카로운 폐기물&quot;컨테이너에서 블레이드를 폐기합니다. </li><li> 조직의 동결을 유지하기 위해 단계 3.2까지 저온 유지 장치 내부의 유리 슬라이드를 유지합니다. </li></ol> 2. IR-MALDESI 준비 / 교정 <ol><li> 중반 IR 레이저를 켜고 컴퓨터의 레이저 제어 응용 프로그램을 실행합니다. 제조자에 의해 공급되는 레이저 제어 프로그램을 사용하여 원하는 파장을 선택한다. IR-MALDESI 실험은 일반적으로 2,940 nm에서 수행된다. 참고 : 최근 실험은 중간 IR 레이저 파장의 의존성 8 특정 분석 것으로 보인다 주목 차이 얼음 행렬을 조사 하였다. </li><li> 사슴을 켭니다전자 컨트롤러는 사용자 정의 사용자 제어 프로그램 (RASTIR)를 시작하고, 홈 버튼을 사용해서 스테이지의 위치를​​ 조정. </li><li> 전기 분무 솔루션을 준비합니다. 일반적으로, 긍정적 인 이온 모드에서 전기 분무 용매 0.2 % 포름산 50:50 (v / v)의 메탄올 / 물을 사용합니다. 실험에 따른 전기 분무 용매 구성을 선택합니다. 예를 들어, 음 이온 모드에서 촬상 애플리케이션 일렉트로 개질제로서 5 mM의 수산화 암모늄을 사용한다. , IR-MALDESI MSI 전환 극성을 위해 수정으로 1 mM의 아세트산을 사용합니다. 이 수정은 포지티브 및 네거티브 이온 모드 (12) 모두에서 안정적이고 재생 가능한 신호를 얻기위한 최적의 발견되었다. </li><li> 전기 분무 용매로 1 ML의 주사기를 입력하고 새로운 용매로 실리카 모세관을 세척하십시오. </li><li> 이러한 ESI 스폿 거리가 소스 매개 변수를 사용하여 MS 유입구 축 상 ESI 터 정렬 통계적 DO를 이용하여 최적화 된 거리 샘플 높이 및 용매 유량 흡입구 자리<html> 조직 섹션 6의 분석을위한 E. 참고 : 조직 섹션의 MSI에 대한 개략적 인 묘사를 위해 이러한 매개 변수 최적화 값을 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 전기 분무를 시작하고,이 시점에서, 전적으로 주위 화합물로 구성되어 총 이온 전류 (TIC)를 모니터링하여 안정성 (&gt; 10 분)을 평가한다. 전형적으로, &lt;10 % 이상 ~ 15 분의 TIC 변형 안정성 좋은 지표이다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53942/53942fig1.jpg" /> 그림 1. IR-MALDESI 회로도 및 매개 변수. IR-MALDESI 소스 설정 (축척되지 않은) 및 조정 가능한 매개 변수의 (A) 도식. (B) 최적화 된 매개 변수 값은 조직 섹션의 이미징. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53942/53942fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 얼음 매트릭스의 제목 &quot;&gt; 3. 증착 <ol><li> 주의 : 무대에 샘플을 배치하기 전에 전기 분무의 전원을 끄십시오. </li><li> 카메라 뷰 내의 IR-MALDESI 샘플 플레이트 상에 해동 장착 된 조직을 놓습니다. </li><li> 확실히 손이 ESI 이미 터의 명확하고 전기 분무를 다시 시작합니다. </li><li> 조직의 표면에 물이 응축을 방지하기 위해 건조 질소로 IR-MALDESI 소스와 퍼지 인클로저의 액세스 도어를 닫습니다. 엔클로저 내부에 도달하면, 상대 습도 &lt;3 %, 샘플 플레이트를 냉각한다 펠티에 판에 DC 전원 (~ 12 V)를 켜. 참고 : 펠티어 냉각 단계에서 냉각 과정이 다른 곳에서 13 자세히 설명합니다. </li><li> C °에 -9 무대를 냉각 및 장착 된 조직이 열 평형 (~ 5 ~ 10 분)에 올 수 있습니다. </li><li> 질소 퍼지를 중지하고 소스 액세스 도어를 열고 주변 상대 습도에 조직을 노출. 얼음의 얇은 층이 공동에 증착 될LD의 펠티에 단계의 표면으로 인해 공기에서 물 desublimation에 조직 섹션을 탑재. 주 : 실험실에서 상대 습도 10 ~ 15 % 미만이면, 얼음 매트릭스 층의 형성을 용이하게하기 위해 시스템 내부의 온수를 비커에 배치. </li><li> 얼음 매트릭스 층을 형성 한 후, 덮개를 닫고 10 ± 2 %의 상대 습도를 감소시키기 위해, 건조 질소의 흐름을 다시 시작. 이 수준의 상대 습도를 유지하는 질소 유량을 조정 경험적 실험 6 걸쳐 얼음이 일정한 층을 유지하는 결빙 승화 균형 것으로 밝혀. </li></ol> 4. 질량 분석 이미징 데이터 수집 <ol><li> RASTIR GUI (그림 2)를 사용하여 &quot;LASER 위치&quot;버튼을 클릭하여 분석 위치로 무대를 이동합니다. 오프 조직 영역이 절제 될 수 있도록, 레이저의 조정 다이오드를 사용한다. 오프 조직 재에 레이저 총을 발사기온은 카메라 뷰에 대한 오프셋 (offset) 레이저를 교정합니다. 레이저의 위치를​​ 업데이트하기 위해 &quot;레이저 테스트 화재&quot;버튼을 클릭하십시오. </li><li> &quot;카메라 위치&quot;로 돌아 레이저 절제 자리 (그림 2-1)에 레이저 정렬 레티클을 배치하여 RASTIR에서 레이저의 위치를 업데이트합니다. </li><li> (그림 2-2) 관심 (ROI) 버튼의 영역을 클릭하고 분석되고 조직 섹션에 대한 ROI의 크기와 위치를 조정합니다. 입력 적절한 실험 등의 X 및 (mm)에 Y 방향 (그림 2-3)에서 스텝 크기 매개 변수, &quot;프로젝트 이름&quot;상자 (그림 2-4)에서 MSI 파일 이름을 지정합니다. <ol><li> 투자 수익 (ROI)을 그릴 때, 제어 역할을 오프 조직의 일부를 포함한다. 피크 피킹이 오프 조직 섹션 (5.4 단계)를 사용합니다. 주 : 조직상의 레이저 탈착 직경 (스폿 크기)은 약 150 ㎛의이며; 그러나, 높은 공간 해상도가 USI 얻을 수있다오버 샘플링 방법 14, 15을 ng를. </li></ol></li><li> 드롭 다운 상자 복셀마다 레이저 펄스 (정수 값)의 개수, 레이저 트리거 질량 분광계 신호 획득 (도 2-5) 사이의 지연에서 적절한 레이저 주파수를 선택한다. 일반적으로 측정 5 질량 분석기에 도달하는 이온 생성을 허용하기 위해 10 밀리 초 지연 시간으로 완전히 IR-MALDESI MSI 실험에서 물질 탈리 20 Hz에서 복셀마다 2 개의 레이저 펄스를 사용한다. 주 : 레이저가 작동 할 수있는 가장 높은 반복율을 선택. 또한 최근에는 더 높은 반복율을 사용하여 분석 물 검출 가능성 (16)을 향상시킬 것으로 나타났다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53942/53942fig2.jpg" /> IR-MALDESI MSI 동작 그림 2. 사용자 인터페이스를 제공합니다. RASTIR 스캔 제어 프로그램의 스크린 샷이 표시됩니다. 퍼포 레이션하는 단계(5) 적절한 개수를 선택하는, (1), 레이저 스폿의 위치 (2) ROI 드로잉, (3) (mm 단위) 단계의 스텝 사이즈를 선택하는, (4) 파일에 이름을 부여되는 MSI 실험 orming 이미징 및 MS 설정에 대한 목록을 확인 원하는 반복 속도, (6)과 함께 복셀 당 펄스의. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53942/53942fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="5"><li> 이러한 이온화 모드, 전기 분무 전압 용매 유속, 모세관 온도, 질량 분석 소프트웨어의 분사 시간과 질량 분석기의 파라미터를 선택한다. 전신 IR-MALDESI MSI에서 사용되는 매개 변수의 예는 표 1을 참조하십시오. 참고 : 인해 생물학적 시료와 MSI 분석에서의 분리 방법의 부족의 복잡성 때문에, IR-MALDESI 소스는 높은 해상력 및 높은 질량 정확도 기기에 결합된다. 취득 방법은 분석가로드 할 수 있습니다이러한 MSI (12) 스위칭 병렬 반응 모니터링 (PRM) 7 극성 말이지. </li><li> 일단 모든 매개 변수 (레이저, 무대, 그리고 질량 분석기)가 선택되었다, 동기화를위한 &quot;악수&quot;모드에서 MS를 배치하고, MS의 인수를 시작합니다. </li><li> 상자를 선택하여 완료 모든 단계 체크리스트 (그림 2-6)를 확인하고 프로그램을로드 RASTIR 이미징 소프트웨어를 사용하여. 프로그램이로드되면, &quot;실행&quot;버튼을 사용할 수 있습니다. 를 눌러 실행 MSI 신호 획득을 시작합니다. </li><li> 이미징 실험이 완료되면, 질량 분석기 수집을 중지하고 대기 모드에서 기기를 배치합니다. 인클로저에 질소 퍼지를 끄고 펠티에 판에 전원 공급 장치를 끄고 무대 컨트롤러와 레이저를 끄십시오. </li><li> 액세스 도어를 열고 소스 인클로저 내부에서 전기 분무 터 팁을 제거하고 보호 장갑을 사용하여 확장 된 가열 된 금속 MS 입구를 제거합니다. 주의 : 확장<html> 금속 MS 입구는 매우 뜨겁습니다. </li><li> 장갑 보안경 착용, 10 분 동안 HPL​​C 등급 메탄올 마지막 10 분 동안 HPL​​C 등급의 물에 10 분 동안 15 % 질산 초음파 욕으로 확장 금속 모세관 입구를 닦고. 질소 기류 하에서 금속 모세관 입구를 건조하고, MS에 다시 삽입합니다. 주 : 이후 적절한 폐기물 용기에 용매 폐기 할 것. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="432"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="22"><td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:216px;"> 매개 변수 </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 값 </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> 이온화 모드 </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 양 </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> 전기 분무 전압 </td><html> R &quot;스타일 =&quot;너비 : 216px; &quot;&gt; 3.8-4.2 kV의 </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> 용매 유량 </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 2 μL / 분 </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> 모세관 온도 </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 275 ° C </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> 검색 범위 </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> m / z 250-1,000 </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> 스캔 유형 </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 전체 검사 </td></tr><tr height="21"><td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:216px;"> 분사 시간 </td><td dir="LTR" style="width:216px;"> 110 밀리 초 </td></tr><tr height="22"><td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:216px;"> 해결 전원 </td>폭 : 216px; &quot;&gt; 140,000 </td></tr></tbody></table> 전신 IR-MALDESI MSI에서 사용되는 표 1. 악기 매개 변수를 설정합니다. 5. 데이터 분석 <ol><li> 이러한 MSConvert 17 imzML 컨버터 (19)와 같은 무료 소프트웨어를 사용하여 이러한 mzXML 17 imzML (18)과 같은 데이터 형식으로 악기에 의해 생성 된 원시 데이터 파일을 변환합니다. </li><li> MSiReader v1.0을 전용 처리 시스템에 높은 분해능 MSI 데이터 (20)의 분석을 위해 개발 된 오픈 소스 소프트웨어를 시작합니다. MSiReader 상에 이미지 파일을로드합니다. 사용자 MSiReader의 인터페이스와 내장 된 기능 중 일부를 들어, 그림 3을 참조하십시오. </li><li> 자신의 m / z를 입력하여 관심의 분석의 이온지도를 생성하고 만 당 부분에 적절한 m / z 창 (PPM) 또는 톰슨 (목) (그림 3-1)을 선택합니다. 높은 분해능 (RP) 악기낮은 ppm의 범위에서 창을 선택합니다. 주 : 해당 m / z 윈도우가 IR-MALDESI 소스가 결합되어 기기의 RP 질량 측정 정도 (MMA)에 의존한다. </li><li> 또한 이러한 보간 (도 3-2), 정규화 (도 3-3), 광학 이미지 오버레이 (도 3-4) 및 최고 (도 3-5) 20 따기와 같은 기본 기능을 이용하여 데이터 해석한다. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53942/53942fig3.jpg" /> 그림 3. MSiReader의 사용자 인터페이스; V1.0 20. 파일이 소프트웨어에로드되면, 관심있는 분석의 이온지도 (1) ppm으로 또는 목의 m / z와 관용을 입력하여 표시됩니다. 이러한 (2) 혹은 보간 ​​(3)과 같은 정규화 추가 분석도 행할 수있다. 조직의 광학 이미지는 수입과 중첩 될 수있다이온지도 (4) 더 나은 시각화를위한. 타겟이 불분명 한이 조직 (마젠타 라인)의 영역과 기준 영역 오프 조직 (녹색 박스)를 선택하여 조직 특이 적 피크를 추출하는 데 사용할 수있는 기능 (5) 따기 피크를 분석하십시오. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53942/53942fig3large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <ol start="5"><li> 사용자 정의 기준을 이용한 조직 - 특이 m / z 값의리스트를 생성하는 피크 피킹 함수를 사용한다. 주 : PeakFinder 알고리즘은 두 영역의 평균 질량 스펙트럼의 차이를 이용한다. 이러한 m / z 값은 다음과 같은 METLIN 21 지질 MAPS와 같은 대사 데이터베이스에 대해 검색 할 수 있습니다. (22) <ol><li> 심문 조직 영역 (마젠타 다각형 ROI) 및 오프 조직 참조 영역 (녹색 다각형 ROI를) 선택의 예 3을 참조하십시오. </li></ol></li></ol>

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<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>Schramm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImzML+-+A+common+data+format+for+the+flexible+exchange+and+processing+of+mass+spectrometry+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ImzML - A common data format for the flexible exchange and processing of mass spectrometry imaging data.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5106-5110 (2012).</li>
<li>Race, A. M., Styles, I. B., Bunch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusive+sharing+of+mass+spectrometry+imaging+data+requires+a+converter+for+all%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Inclusive sharing of mass spectrometry imaging data requires a converter for all.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5111-5112 (2012).</li>
<li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSiReader%3A+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li>
<li>Smith, C. A., O'Maille, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+a+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug.+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN: a metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug. Monit. 27 (6), 747-751 (2005).</li>
<li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMSD%3A+LIPID+MAPS+structure+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Res. 35, D527-D532 (2007).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Takai, N., Tanaka, Y., Inazawa, K., Saji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+pharmaceutical+drug+distribution+in+multiple+organs+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of pharmaceutical drug distribution in multiple organs by imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 26 (13), 1549-1556 (2012).</li>
<li>Liu, J., Gingras, J., Ganley, K. P., Vismeh, R., Teffera, Y., Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+distribution+study+of+drugs+in+neonate+mice+using+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue distribution study of drugs in neonate mice using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (2), 185-190 (2014).</li>
</ol>

The authors declare no competing financial interests.

프로토콜은 위의 IR-MALDESI MSI 실험을 수행하기위한 주요 단계를 설명한다. 매트릭스 신청 절차 (제 3 장)은 로봇 분무기를 사용하여 코팅 스프레이 승화 또는하여 MALDI MSI 실험의 일반적인 매트릭스 응용 프로그램 프로세스와 유사 약 20 분 걸립니다. 또한, IR-MALDESI 매트릭스의 결정 (6)에 분석 물의 분할에 의존하지 않고, 얼음 행렬 보편적 관계없이 질량, 크기, 화학적 성질의 분석 모두에 사...

마이크로 프로브 모드에서 질량 분석 이미징 (MSI)는 샘플의 표면에 분리 위치에서, 빔 (레이저 또는 이온)에 의해 표면으로부터 시료의 탈착을 포함한다. 각 래스터 지점에서, 질량 스펙트럼을 생성하고, 획득 된 스펙트럼들은 수집되었던 공간 위치와 함께 동시에 수많은 샘플 내 분석을 매핑하는데 사용될 수있다. 감도와 질량 분석의 특이성에 결합 이미징이 레이블없는 방식 MSI는 질량 분석 1, 2에서 가장 빠르게 발전하는 분야 중 하나가 도왔다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)는 MSI 분석에 사용되는 가장 일반적인 이온화 방법이다. 그러나, 유기 매트릭스에 대한 필요성 및 MALDI의 진공 요구 재현성 샘플 처리량 및 방법을 이용하여 분석 될 수있는 샘플의 유형에 상당한 제한을 야기. 대기압 (AP) IO의 수그러한 조직 방법은 이러한 제한을 피하기 위해 3 최근 개발되어왔다. 이러한 주변 이온화 방법은 자연 상태에 매우 가까운 분석에 앞서 샘플 제조 단계를 단순화하는 환경에서 생체 시료의 분석을 허용한다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화가 일렉트로 (MALDESI)은 이러한 이온화 방법 -4,5-의 일례이다. IR-MALDESI 실험에서 얼음의 얇은 층은 에너지 흡수 매트릭스 조직 표면 상에 증착된다. 미드 IR 레이저 펄스는 얼음 행렬에 의해 흡수 및 물 신장 모드로 공진을 여기하여 OH 표면으로부터 중성 물질의 탈착을 용이하게한다. 직교 전기 분무의 대전 방울에 탈착 중성 파티션 후 이온화 ESI 같은 방식으로 4-6에 있습니다. 외인성 얼음 행렬의 첨가는 AC 도움 때문에 조직 내의 내생 물에만 의존보다 선호다른 조직 구획에서 물 함량의 변화를 계산하고, ~ 티슈 이미징 실험 7,8 15 배 이온 풍부 탈착 6을 강화하고 개선하는 것으로 나타났다. 이 작품에서 우리는 IR-MALDESI MSI는 신생아 마우스 온 몸의 여러 장기에서 대사 산물의 분포를 유도하기 위해 사용한다. Ir이 MALDESI 소스 조정 파라미터의 개요가 부여되며, 조직 절편을 성공적으로 이미징을위한 필요한 단계가 증명된다.

<table><tbody><tr><td>IR-MALDESI Source</td><td>Custom-made</td><td>N/A</td><td>Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development.</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td></tr><tr><td>Water, HPLC Grade</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson&amp;nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC Grade</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson&amp;nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Tunable mid-IR Laser</td><td>Opotek Inc.</td><td>IR Opolette</td><td>Tunable 2,700-3,100&amp;nbsp;nm IR OPO laser</td></tr><tr><td>Nitrogen Gas</td><td>Arc3 Gases</td><td>AG S-NI300-5.0</td><td>Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM 1950</td><td>Cryomicrotome</td></tr><tr><td>High Profile Microtome Blades</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802123</td><td>Leica DB80HS</td></tr><tr><td>Mounting Medium (OCT)</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801480</td><td>Surgipath FSC 22 mounting medium</td></tr><tr><td>Cryostat Specimen Disc</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740045</td><td>40 mm diameter</td></tr><tr><td>Glass Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Frosted, selected, pre-cleaned</td></tr></tbody></table>

whole-body mass spectrometry imaging by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (ir-maldesi)

질량 분석 (MS)에 대한 주변 이온화 소스는 지난 10 년간 많은 관심의 대상이되어왔다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 전기 분무 이온화 (MALDESI)는 이러한 방법의 일례이다 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) (예를 들어, 탈착 펄스 특성)과 전기 분무 이온화 (ESI) (예를 들어, 소프트 - 이온화 기능 ) 결합된다. MALDESI의 주요 이점 중 하나는 고유의 다양성이다. MALDESI 실험에서 자외선 (UV) 또는 적외선 (IR​​) 레이저로 공진 내인성 또는 외인성 매트릭스를 여기 시키는데 사용될 수있다. 행렬의 선택은 피 분석 물에 의존하지 않고, 여기에 사용되는 레이저 파장에 전적으로 의존한다. IR-MALDESI 실험에서 얼음의 얇은 층은 에너지 흡수 매트릭스 시료 표면에 증착된다. 적외선 - MALDESI 소스 형상은 통계 액체 샘플의 분석을위한 실험 (DOE)의 디자인뿐만 아니라 B​​IOL를 사용하여 최적화 된ogical 조직 표본. 또한, 강력한 IR-MALDESI 촬상 소스는 가변 중간 IR 레이저는 컴퓨터 제어 XY 병진 스테이지 및 고분해능 질량 분석 장치와 동기화되는 경우, 개발되었다. 커스텀 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)는 레이저의 반복률의 사용자 선택을 허용 복셀마다 촬영, 시료 스테이지의 스텝 크기 및 탈착 사이의 지연 소스를위한 이벤트를 검색 번호. IR-MALDESI는 생체 조직 절편의 섬유와 염료 및 MSI의 법의학 분석과 같은 응용 프로그램의 다양한 사용되어왔다. 내인성 대사에서 조직 절편 내에 외래 생체 이물질에 이르는 상이한 분석 물의 분포를 측정하고,이 기술을 이용하여 정량화 할 수있다. 이 논문에 제시된 프로토콜은 전신 조직 섹션의 IR-MALDESI MSI에 필요한 주요 단계를 설명합니다.

도 4에 제시되는 이미지는 전신 조직 절편의 여러 장기에서 대사 산물의 공간적 분포를 나타낸다. 신체의 특정 영역에 고유의 m / z 값은 이미지 생성을 위해 일괄 처리 한 후, MSiReader PeakFinder를 이용하여 발견되었다. 화상 오버레이 도구 (도 3-4) 얻어진 이온 맵 얼음 행렬 증착 전에 촬영 한 광학 이미지를 정렬하는 데 사용 하였다. 동물 세포...

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Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

whole-body-mass-spectrometry-imaging-infrared-matrix-assisted-laser

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

9.4K 조회수.  North Carolina State University. A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse. 

비디오: Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

연구

화학

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

생화학

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

생체공학

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample types have been analyzed using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) to visualize the distribution of proteins, lipids, and metabolites across the biological sample of interest. We have developed a novel sample preparation method that combines the strengths of the three previous applications to address an underexplored approach for identifying chemical communication in cancer, by seeding mammalian cell cultures into agarose in coculture with healthy tissues followed by desiccation of the sample. Mammalian tissue and cells are cocultured in close proximity allowing chemical communication via diffusion between the tissue and cells. At specific time points, the agarose-based sample is dried in the same manner as microbial colonies prepared for IMS analysis. Our method was developed to model the communication between high grade serous ovarian cancer derived from the fallopian tube as it interacts with the ovary during metastasis. Optimization of the sample preparation resulted in the identification of norepinephrine as a key chemical component in the ovarian microenvironment. This newly developed method can be applied to other biological systems that require an understanding of chemical communication between adjacent cells or tissues.

A novel method of sample preparation was developed to accommodate cell and tissue coculture to detect small molecule exchange using imaging mass spectrometry.

조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

암 연구학

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

LAESI 질량 분석법에 의해 생물 학적 조직 및 Biofilms의 대기 압력 분자 이미징

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

생물학

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

신경과학

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

의 대사 산물의 조사를위한 MALDI-질량 분석 이미징<em&gt; 개자리 truncatula</em&gt; 루트 결절

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

MALDI-TOF Mass Spectrometry

Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) is a mass spectrometry ion source ideal for the analysis of biomolecules. Instead of ionizing compounds in the gaseous state, samples are embedded in a matrix, which is struck by a laser. The matrix absorbs the majority of the energy; some of this energy is then transferred to the sample, which ionizes as a result. Sample ions can then be identified using a time-of-flight analyzer (TOF).
This video covers principles of MALDI-TOF, including matrix selection and how TOF is used to elucidate mass-to-charge ratios. This procedure shows the preparation of a MALDI plate, the loading of samples onto the plate, and the operation of the TOF-mass spectrometer. In the final section, applications and variations are shown, including whole-cell analysis, characterization of complex biological samples, and electron spray ionization.
<div class="chapter_text" id="script_0">
Matrix-assisted laser desorption ionization, or MALDI, is a mass spectrometry ion source ideal for the analysis of biomolecules. Most ion sources remove structural information from large, fragile biomolecules. MALDI maintains structural integrity, and therefore information, while accelerating the molecules into the mass analyzer, which separates the compounds based on size and charge. The most commonly coupled with MALDI is the time of flight, or TOF, mass analyzer. This video will show the concepts of MALDI ionization, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
For mass spectrometry to function, molecules must be ionized into the gaseous state. In MALDI, the sample is embedded in a matrix, typically an organic compound containing aromatic and conjugated double bonds.
When a laser pulse strikes this mixture the matrix absorbs the majority of the energy, rapidly heats, and is desorbed, or released, from the surface. The energized matrix transfers some of its energy to the biomolecules, desorbing and then ionizing them.
MALDI is typically paired with a time of flight, or TOF, mass analyzer. An electric field applies kinetic energy to the ions, moving them into a field-free region called a drift tube. The velocity of the ions as they move through the tube is related to their mass-to-charge ratio, so heavier particles travel slower through instrument. A detector at the end of the tube measures each ion&#39;s flight time. With this knowledge, as well as the tube length and applied field strength, the mass-to-charge ratio of each ion can be elucidated.
This plot of signal intensity to mass-to-charge-ratio, known as a mass spectrum, can be compared to a library of collected spectra. If no matches are found, it can molecules can be identified by further techniques, such as tandem mass spectrometry. For more information, see this collection&#39;s video on the topic.
Now that the basics of MALDI-TOF have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
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Before beginning an experiment, it&#39;s important to consider the choice of matrix from which samples will be desorbed. It must absorb the laser energy, be stable in a vacuum, not react with the target molecules, and be able to desorb. Depending on the sample, different matrices are preferred. For a large protein, a combination of CHCA and DHB has shown better separation of the peaks, called resolution, than the individual matrices.
There are a number of ways to prepare samples. We&#39;ll show what is known as the &#34;double-layer&#34;, or &#34;sandwich,&#34; method. To begin, clean the MALDI plate with ultra-pure reagents, as mass spectrometry is very sensitive to contamination. Dry the plate with a stream of inert gas.
Next, a saturated matrix solution is made, typically with an organic solvent . The solution is streaked onto the MALDI plate and dried. A second saturated solution of matrix containing trifluoroacetic acid, or TFA, is prepared. TFA helps ions into the gaseous phase.
Next, the sample solution is added on top of the dried matrix spot. Add the matrix solution containing TFA on top of the sample, thereby completing the matrix &#34;sandwich&#34;. Homogeneity of the spot can be verified under a low-powered microscope.
Plate a calibration standard, which is a mixture with a wide range of known masses and is used to correlate the time-of-flight to m/z. Finally, plate the matrix alone as a negative control.
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To analyze the spots, place the target plate into the instrument. Ensure there&#39;s no debris present, allowing for the formation of a tight vacuum. In the software, select the standard, negative control, and samples of interest. Label the spots with the correct identification.
The ion source and lens voltages can be manipulated to improve performance of the analysis. This will depend on the specifics of the instrument and sample. Focus on the standard spot and calibrate the instrument with the software.
Next, collect spectra from each of the sample spots. Try a few different locations on the spot to maximize the quality of the collected data. Once finished, the MALDI plate can be collected and reused after cleaning.
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Now that we&#39;ve reviewed a procedure, let&#39;s look at some of the ways MALDI is utilized, and a different ionization technique.
In addition to biomolecules, MALDI can be used to analyze living cells. Macrophages are immune cells that take on one of several different forms, based on their microenvironment. After exposing the cells to various signaling molecules, or cytokines, they can be added directly to the plate, and analyzed. The MALDI spectra can be used as unique &#34;fingerprints&#34;, depending on the cytokine used.
Complex biological samples like mammalian sebaceous secretions require a step of purification before MALDI analysis. Thin layer chromatography is one such technique that relies on the components&#39; polarity. The compounds are collected from the TLC pate, purified, and transferred to a MALDI matrix. The resulting spectra verify the identity and purity of the separated biomolecules from the mammalian sebaceous secretions.
Another common ion source for biomolecules is electrospray ionization, or ESI. In this method, the sample is injected into the instrument, where a high voltage is applied, creating an aerosol of charged droplets. As the solvent in the droplet evaporates, the charge is moved to the sample molecules, till they are completely gaseous. ESI doesn&#39;t require the spotting procedure, and the sample can be injected directly into the instrument. On the other hand, ESI is more sensitive to the presence of buffer components and other contaminants, meaning MALDI is more robust.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on MALDI mass spectrometry. This video described the theory behind the instrument, went over a general procedure, and covered some of the uses of the technique. Thanks for watching!
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MALDI-TOF Mass Spectrometry-Principle, Operation and Uses

MALDI-TOF 질량 분석

Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) is a mass spectrometry ion source ideal for the analysis of biomolecules. Instead of ionizing ...

교육

JoVE Science Education

Introduction to Mass Spectrometry

Source: Laboratory of Dr. Khuloud Al-Jamal - King&#39;s College London

Mass spectrometry is an analytical chemistry technique that enables the identification of unknown compounds within a sample, the quantification of known materials, the determination of the structure, and chemical properties of different molecules.
A mass spectrometer is composed of an ionization source, an analyzer,&#160;and a detector. The process involves the ionization of chemical compounds to generate ions. When using inductively coupled plasma (ICP), samples containing elements of interest are introduced into argon plasma as aerosol droplets. The plasma dries the aerosol, dissociates the molecules, and then removes an electron from the components to be detected by the mass spectrometer. Other ionization methods such as electrospray ionization (ESI) and matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) are used to analyze biological samples. Following the ionization procedure, ions are separated in the mass spectrometer according to their mass-to-charge ratio (m/z), and the relative abundance of each ion type is measured. Finally, the detector commonly consists in an electron multiplier where the collision of ions with a charged anode leads to a cascade of increasing number of electrons, which can be detected by an electrical circuit connected to a computer.
In this video, the procedure of ICP-MS analysis will be described by the detection of 56Fe as an example.