이 작품은 [CVB &amp; ME에 MOP-1112666] 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.

윤리 문 : 모든 실험과 절차는 브리티시 컬럼비아 주, 밴쿠버, 캐나다의 대학의 연구소 바이오 안전성 가이드 라인과 일치 실시 하였다. FRET 기반 공 초점 현미경을위한 35mm 유리 바닥 문화 요리 1. 준비 <ol><li> 다음 절차에 따라 36-48 시간 전에 실험에를 사용하여 플레이트를 준비합니다. </li><li> C 저장 ° -20에서 선택 젤라틴 단백질 혼합물 0.25 % 트립신 EDTA를 검색하고 사용할 때까지 이동 얼음 욕조에 보관하십시오. 주 : 단백질이 코팅 혼합물만을 사용 전에 고화 혼합을 방지하기 위해, 짧은 시간 동안 RT에 노출되어야한다. 필요할 때까지 트립신 용액은 냉장 보관한다; 대안으로, 트립신 단계 1.5 완료 후 -20 ° C 저장 영역에서 검색 할 수 있습니다. </li><li> DMEM (더 추가 된 혈청, 냉장) : 단백질 혼합물의 1시 25분 희석을 준비합니다. 각 플레이트가 준비되기 단백질 혼합물 / DMEM의 적절한 볼륨을 이동. 35mm 유리 바닥 판의 경우, 완전 판의 하단에 내부 유리 원을 충당하기 위해 약 200 μl를 추가합니다. </li><li> 안전 캐비닛 내부 및 실온에서 적어도 30 분 동안 앉아 접시를 남겨주세요. 이 기간 동안 물을 욕조에 37 ° C 10 % NCS와 따뜻한 DMEM. </li><li> 바로 전에 다음 단계에 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 트립신. </li><li> 유리 피펫 및 흡입을 사용하여 배양 플라스크 현재 DMEM를 제거합니다. 따뜻한 멸균 PBS와 플라스크의 워시 바닥은 남아있는 DMEM 찌꺼기를 제거합니다. </li><li> 플라스크의 바닥에서 미리 배양 평활근을 제거 : 참고 : 플라스크는 세포가 접시 준비하기 전에 원하는 컨 플루 (약 80 %)에 도달 할 수 있도록이 단계에 일 설립되었다. 세포들은 원래 10 % NCS로 DMEM 20 ml의 플라스크에 현탁시키고 DMEM 공급 재생 된 세포를 인큐베이터로 복귀 된 후 24 시간에 대해 5 % CO 2 공급하여 37 ℃에서 배양 하였다. DMEM는 이브를 갱신했다세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 공예 48 시간이 초기 단계에 따라. <ol><li> 워시는 트립신 1 ml의 신속 플라스크 다음 흡입을 사용하여 1 ml의 트립신을 제거합니다. </li><li> 트립신의 또 다른 1 ㎖에 추가하고 효소가 플라스크의 전체 바닥과 접촉 할 수 있도록 플라스크를 휘두르는, 더 긴 기간 (약 30 ~ 60 초)로 떠난다. </li><li> 플라스크에서 분리 만족 될 때까지 현미경으로 분리 얼마나 많은 세포를 관찰한다. 플라스크에서 분리 된 세포의 비율이 만족 될 때까지 대체 물​​기 제거 트립신 용액 및 검사 세포 분리. 주 : 플라스크를 37 ℃에서이 프로세스의 속도를 약 30-60 초 동안 인큐베이터로 복귀 할 수있다. </li><li> 세포를 트립신을 사용 빠질되고 나면 (트립신은 플라스크의 총 부피의 1/8 번째를 형성하도록 충분한 볼륨), 트립신 반응을 정지 플라스크에 10 % NCS 신선한 DMEM를 추가합니다. 주 : 250 ml의 배양 플라스크를 사용하는 경우, 예를 들어,이 것7 ㎖의 DMEM 세포 용액 8 ml의 결과 트립신 1 ㎖의에 추가. </li></ol></li><li> 깨끗한 (표시) 50 ML 원뿔 튜브에 플라스크에서 셀 솔루션을 결과로 전송. </li><li> 각 플레이트에 1 ml의 신선한 DMEM 플러스 10 % NCS 추가는 (충분한 매체가 24 시간을 지속하기 위해) 준비되고있다. </li><li> 부드럽게 튜브를 형성 할 수있는 모든 펠렛을 헤어 셀 솔루션을 여러 번 포함 반전. </li><li> 피펫은 각 플레이트에 부드럽게 혼합 셀 솔루션의 볼륨을 원하는. 참고 :이 프로토콜에 대한 도금 권장 SMCs 번호는 35mm 배양 접시 당 0.5-0.8 × 106이다. 이 번호는 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 각각의 실험실에서 테스트하고 수정해야합니다. </li><li> 유리 바닥에서 세포의 평등 한 분배를 보장하기 위해 철저하게 / 시계 방향 반 시계 방향으로 각각의 판을 소용돌이 친다. </li></ol> D1SR 칼슘 2 + 표시를 실시 아데노 바이러스 벡터 2. 과도 형질 <ol><li> 나 또한 다음dium 각각의 접시에 세포 솔루션은 세포가 접시의 바닥에 유리에 제대로 부착 할 수 있도록 적어도 1 시간 동안 CO 2 공급 5 %와 37 ° C에서 배양 접시를 둡니다. 세포가 명확하게 부착 될 때까지 15 분 간격으로 현미경으로 번호판을 확인합니다. </li><li> -80 ° C 저장 영역에서 아데노 바이러스 D1SR 나누어지는을 검색하고 생물 안전 캐비닛에 전송하는 모바일 얼음 욕조에 보관하십시오. </li><li> 피펫 원하는 용량 각 플레이트에 냉장 D1SR의 (100의 감염의 다중성). 주 : 플레이트 당 필요한 아데노 바이러스 용액의 부피에 대한 계산은 플라크 형성 단위 (PFU)로 표시되는 원본 원액에 바이러스 역가에 의존한다. 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 배양 접시에 하나의 평활근 세포 (SMC)를 감염하는 데 필요한 번호 또는 바이러스 입자로 해석됩니다 (100)의 감염 (MOI)의 다양성을 권장합니다. </li><li> 5 % CO 2 공급 O / N 37 ° C에 감염된 세포를 품어. </li><li> 다음 날, 신선한 DMEM 1 ㎖ 플러스 10 % NCS와 세포를 보충. </li><li> CO 2 O / N 5 %에서 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 접시를 품어. </li></ol> FRET 기반 공 촛점 이미징을 사용하여 3. 측정 SR 내강의 Ca 2+ <ol><li> O / N 배양 후, 플레이트에서 배지를 제거합니다. </li><li> 포함 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼와 배양 접시를 씻으 (mmol·L에 - 1) 염화나트륨 (140), 포도당 (10), KCl을 5, HEPES (5), 염화칼슘 (2) 1.5의 MgCl 2 일 (PH 7.4) 세 번. </li><li> 직전 기록의 시작에 1 ml의 신선한 따뜻한 HEPES-PSS 버퍼를 추가합니다. </li><li> 공 초점 현미경의 관련 소프트웨어에 FRET SE (감응 방출) 응용 프로그램 (또는 유사한 기능)를 사용하여 초기 이미징을 수행합니다. <ol><li> 응용 프로그램이 열리면, 원하는 실험 조건을 달성하기 위해 설정을 조정하려면 &quot;설정&quot;탭으로 클릭합니다. </li> &lt;세포 (기증자과 채널 FRET) 440 nm에서 순차적으로 흥분과 (수용체 채널에 대한) 513 nm의 있도록 리&gt; 수동으로 채널 설정을 변경합니다. (기증자에 대한) 488 nm 내지 53​​5 nm의 (FRET 및 수용체에 대한)에서 방출 파장을 수집합니다. </li><li> 와 노출 사이에 10 초 간격 (세​​ 개의 연속 CFP 기증자, FRET 및 YFP 수용체 채널에 대한 녹화 시간) 세포의 150 밀리 여기 노출 시간, 15 %의 전송 빛의 강도를 설정합니다. </li></ol></li><li> 현미경 무대에서 판을 안정화. </li><li> 이미지 해상도를 확인하십시오 &quot;라이브&quot;버튼을 사용합니다. 원하는 해상도에 도달 할 때까지 추가 설정을 조정할. </li><li> 아직도 &quot;설정&quot;탭 아래의 &quot;캡처 이미지&quot;버튼을 사용하여 샘​​플의 이미지를 가져 가라. </li><li> 은 &quot;평가&quot;탭에 이동, 실험에 대한 FRET 효율이 수행되는 계산하는 적절한 방법을 선택합니다. 방법 3의 비례 계산 [E A (I) = B / A를 사용하여, 등 D1SR의 지표로 cameleons을 포함하는 실험을하는 것이 좋습니다. </li><li> 강도 값은 실험 중에 그래프 형태로 기록되는 것을 관찰 할 수 있도록 &quot;그래프&quot;탭으로 전환. </li><li> 실험이 진행되는 그래프에 관심이 지역의 해당 평균 강도를 관찰하는 이미지 뷰어에서 투자 수익 (ROI)을 그립니다. 참고 : 연구자가 여러 로아을 그리고 강도 기록하고 그래프에 동시에 표시 할 대응하도록 선택할 수 있습니다. 대안 적으로, 연구자들은 초기 기록을위한 단일 ROI 윤곽 및 소프트웨어의 데이터 분석 지향 버전 실험 파일을 열어 나중에 다수의 ROI 윤곽을 진행할 수있다. 참고 : FRET 기반 실험을 설정하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 세부 사항은 FRET 응용 프로그램 마법사 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. 현미경은 FRET 마법사 장착되지 않은 경우, 다음의 프로토콜에 대한 파라미터를 설정하는데 사용될 수있다수동으로 기록. </li><li> 녹화 시작 전에 관심 에이전트를 도입하여 신호의 정상 기저 기록을 위해 적어도 3 분 동안 데이터 수집을 허용한다. </li><li> -moving 에이전트를 칼슘을 소개합니다 (예 : 2 μM 쌥시 가르 긴 100 nm의 엔도 텔린-1) 수동으로이자 존재의 영역에 가깝게 자리에서 판에 직접 소정의 복용량을 피펫 팅에 의해, SR 칼슘 2 + 파괴하기위한 도구로 가능한 기록했다. 원하는 시간 후 처리에 대한 기록을 계속합니다. </li><li> 캡처 비율 계량은 FRET SE 응용 프로그램을 사용하여 공 초점 거꾸로 현미경의 63X 기름 침지 목적으로 일련의 이미지 (512 X 512 픽셀) FRET. </li><li> 포맷 및 통계 기반의 소프트웨어를 사용하여 분석이어서 관심 (ROI)의 각 지역에서 5 ~ 10 SMCs의 클러스터에서 영상에서 결과 데이터를 수집합니다. <ol><li> 나중에 사용하기 위해 데이터를 저장하기 위해, 기록 추적을 통해 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 SAV하기 위해 &quot;내보내기&quot;옵션을 선택합니다연구자가 선택한 드라이브에 기록 된 평균 신호 강도와 전자 스프레드 시트. </li><li> 시각 0 초에서 관찰 원료 강도 값에 의해 각 데이터를 분할하여 각각의 실험 데이터를 정규화. </li><li> 수동으로 복사하고 원래 스프레드 시트 / 초에서 관련 데이터 행을 붙여 넣기하여 통계 프로그램 프로젝트 파일에 스프레드 시트에서 가져 오기 정규화 된 데이터. </li><li> 자동으로 프로그램에 붙여 넣을 데이터 세트에 해당하는 그래프를 생성합니다. 참고 :이 프로그램의 기본 설정은 가져온 데이터에서 선 그래프를 생성합니다. 표시되는 그래프의 종류는 기본 도구 모음에서 발견 제목 &quot;변경&quot;에서 &quot;그래프의 다른 유형을 선택&quot;버튼을 클릭하여 수정할 수 있습니다. </li><li> 단일 데이터 시트로 동일한 실험 큰 그룹 내에서 여러 개의 독립적 인 실험을 대표하는 풀 데이터 수행 특정 테스트에 대한 평균 추적을 생성한다. </li></ol></li></oL&gt; 세포질 칼슘의 4 조제 2 + 표시 <ol><li> 검은 microcentrifuge 관에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 1 ml의 0.0125 g 플루로 닉 산 (PA)에 녹이고 (PA 용해 있도록 모바일 수욕 튜브를 따뜻하게 할 수있다). </li><li> -20 ° C 저장 영역에서 세포질 칼슘 지시 염료 (FLUO-4 AM)의 튜브 (50 μg의)를 검색합니다. </li><li> 빛과 접촉 최대한 보호하기 위해 호일 염료의 튜브를 감싸. </li><li> 피펫 염료를 함유하는 튜브에 DMSO + PA 용액 45 μL. 실온에서 박 및 저장소에 DMSO + PA 솔루션을 감싸. </li><li> 철저하게 솔루션 위아래로 여러 번 피펫 팅하여 튜브의 내용을 섞는다. 대안 적으로, 10 분 동안 염색 튜브를 초음파 처리. 참고 : 철저하게 충분한 될 것 DMSO + PA 솔루션을 통해 염료를 배포의 어느 단계; 단순히 연구자의 취향의 문제이다. 조사자 용액을 초음파 처리로 선택한 경우, 그것다른 사람들이 소음에 의해 영향을받지 않습니다 고립 된 지역 / 방에서 수행해야합니다. 조사는 귀를 보호하기 위해 무거운 머플러를 사용해야합니다. <ol><li> 용액을 초음파 처리하는 경우, 2/3 전체 (와 DH 2 O) 초음파기 화장실 내부의 거품 튜브 홀더와 장소의 내부에 염료를 포함하는 포일 포장 튜브를 삽입합니다. </li><li> 격리 지역 / 공간 및 전력 시스템의 장소 소니 케이 온천 (보​​호 모자를 확인하기 전에 초음파 처리를 시작으로 장소에). 공간을두고 튜브를 (가능한 한 오랫동안 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸서 보관)을 차단하고 검색하기 전에 10 분 동안 실행중인 시스템을 그대로 둡니다. </li></ol></li><li> 어두운 마이크로 원심 튜브에 이제 완전히 혼합 용액 나누어지는 (튜브 당 5 μl를 10 튜브 총 만들 수 있어야합니다). </li><li> 포일의 각 나누어지는 튜브를 감싸. 사용할 때까지 -20 ° C 조건에서 건조에 레이블 튜브 및 저장. </li></ol> 5. 세포질 칼슘의 측정 2 + <ol><li> 쥐 대동맥 SMCs의 문화 판을 준비하는 1.1-1.12의 단계를 따릅니다. </li><li> 48 시간 포스트 문화의 접시에서 배양 배지를 제거합니다. </li><li> -20 ° C 저장 영역에서 세포질 칼슘 2 + 표시 등 (5 μL)의 이전 준비 나누어지는을 제거하고 사용할 때까지 이동 얼음 조에서 유지한다. </li><li> 포함 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼와 배양 접시를 씻으 (mmol·L에 - 1) 염화나트륨 (140), 포도당 (10), KCl을 5, HEPES (5), 염화칼슘 (2) 1.5의 MgCl 2 일 (PH 7.4) 세 번. </li><li> 따뜻한 HEPES-PSS 1 ml의 지표를 혼합 배양 접시에로드합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 표시기 (24 °에 C)와 SMCs을 품어. </li><li> 문화 판에서 표시를 제거하고 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼로 3 회 세척한다. </li><li> 직전 기록의 시작에 1 ml의 신선한 따뜻한 HEPES-PSS 버퍼를 추가합니다. </li><li> 63X 오와 직렬 이미지 (512 X 512 픽셀) 캡처공 촛점 거꾸로 현미경의 IL-침지 목표. <ol><li> 수동 세포를 488 nm에서 흥분하도록 설정을 변경하고, 발광 파장은 700 Hz의 스캔 속도로 555 nm에서 수집된다. </li><li> 세포를 150 밀리 여진 노출 시간 (세포 촬영 중에 지정된 시간 간격으로 빛에 노출되는 시간)과 노출 사이 5 초 간격으로, 15 %의 투과에서의 광 강도를 설정한다. </li></ol></li><li> 현미경 무대에서 판을 안정화하고 녹음을 시작. </li><li> 적어도 3 분 녹음하기 전에 관심의 제를 도입하여 신호의 꾸준한 기초 기록을 확인합니다. </li><li> (단계 3.16에 설명 된대로) 2 + SR 칼슘을 고갈 및 시간 후 처리의 원하는 금액에 대한 기록을 계속위한 도구로 칼슘 -moving 에이전트 (예를 들면, 2㎛ 쌥시 가르 긴) 소개합니다. </li><li> 녹음 신호 강도 형광 SI 평균을 현미경 특정 소프트웨어를 사용하여관심 (ROI)의 각 지역에서 5 ~ 10 SMCs의 클러스터에서 gnals (F / F 0). 수집 형식 및 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 영상에서 얻어진 데이터를 분석한다. 이 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집의 설명과 분석을위한 단계를 3.18.1-3.18.5 참조하십시오. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 SR의 루멘 내 칼슘 농도를 연구하기 D1SR 아데노 바이러스와 혈관 평활근 세포의 형질을 설명합니다. 이 방법은 직접이 소기관 내 칼슘의 측정뿐만 아니라 다른 칼슘 이동 에이전트 애플리케이션의 결과로서 SR 만점으로의 이동 / 허용한다. 이 방법은 SR과 세포질 칼슘 수준에 변화가 전체 세포의 건강에 영향을 미칠 어떻게 이러한 변화는 상호 관련있는 방법?...

칼슘은 신체의 모든 단일 세포 내에서 풍부하게 발견되는 매우 중요한 이온입니다. 그것은 성장, 증식, 이동 및 세포 사멸 1-4 등 다양한 세포 기능에 중요한 역할을 가지고있다. 잘 칼슘이 모두 직간접적인 행동을 통해 이러한 프로세스에 영향을 미칠 수 있음을 설립, 따라서,이 이온의 정상적인 세포 내 농도 변화는 쉽게 영향을받는 세포에 대한 부정적인 결과가 발생할 수 있습니다. 스케줄링은 셀 (5) 내에서 가장 큰 세포 내 칼슘 저장소로 간주됩니다. 스케줄링 및 세포질 모두에서 칼슘의 정상 상태 수준은 일반적으로이 세포 기관의 칼슘 수송성 채널 중 일정한 유량을 통해 유지된다. 인한 부상 또는 질병의 형태로 세포에 가해지는 스트레스 조건은 일반적으로 그가 온 오래 지속되는 효과를 가지고 갈 SR 칼슘의 중요한 변화 2+와 관련된셀의 alth. 케이스의 가장 심각한에서 스트레스 셀의 무능력 복구하고 정상 상태 SR의 칼슘을 유지 2+ 수준도 사멸 6-8으로 사망 절정에 달하다 수 있습니다. 세포의 칼슘 역학에 대한 현재의 연구는 몇몇 연구 시험 칼슘 저장소의 콘텐츠를 직접 9-11 세포 기관 있다는 사실에 의해 제한된다. 가장 일반적인 방법은 대신 SR 칼슘 함량 12-14에서 변화의 간접적 인 측정과 같은 세포 내 칼슘 수준의 측정을 포함한다. 이 실험에서, 칼슘은 일반적으로 세포 소기관의 고갈을 초래되는 약물 (예 쌥시 가르 긴)의 사용을 통해 SR로부터 방출되도록 유도된다. 결론은 다음 세포질 칼슘 농도의 변동에 따라 SR 칼슘의 변경과 관련하여 그려집니다. 로터리 엄마에 같은 결론을 도출하기 위해 연구자 남은 능력에도 불구하고nner, SR 칼슘 측정이 방법은 수집 된 데이터의 해석에 관한 많은 제한과 같은 정보를 수집합니다 할 수있는 간접적 인 방법은 분명히있다. 이 명확한 제한을 우회시키기 위해서는, SR 내강 네트워크 내에서 직접 발견 칼슘의 양을 측정 할 필요가있다. 직접 관내 SR 칼슘 수준을 기록 할 수있는의 최종 결과에 필수적은 세포 배양 용 공구 및 사용되는 칼슘 지표이다. 현재의 논문에 언급 된 데이터의 경우, 사용되는 혈관 평활근 세포는 냉동 세포주로부터 왔다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 세포는 5 % CO 2 공급 일정 37 ° C에서 배양 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) +를 설명 실험 구절 22-26을 통해 10 %의 신생아 혈청 (NCS)에서 배양 하였다. 현재의 방법을 이용하여, 예를 들어, 세포는 매우 성공적 세포 시뮬레이션 단백질 혼합물에 성장 된조직 (15)의 많은 다른 유형의 환경을 제공합니다. SR 칼슘 정맥 따른 성공에 중요 2+ 연구는 사용 된 단백질 혼합물의 형태이고; 이 경우, 낮은 성장 인자 다양한 일반 칼슘 신호 전달에 영향을주는 동작과 끊임없이 시험 셀 내에서 발생하는이 도구의 부품을 피할 필요가 있었다. 시험 셀의 성공적인 성장 후, 칼슘 인디케이터 효과적으로 이러한 배양 세포에 도입한다. 이 SR-상주 칼슘 2+ D1SR 지표를 전달하는 아데노 바이러스 벡터를 이용하여 가능하게되었다. 높은 형질 전환 효율을 달성하기 위해, 셀은 종래 촬상 적어도 36-48 시간 동안 바이러스 벡터와 함께 배양해야한다. 이 제제는 칼슘에게 높은 정확성과 재현성을 가진 SR 루멘 내에서 2 + 과도 전압을 측정 할 수있는 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다. 이 프로토콜에서 사용 D1SR 표시가 D1ER 칼슘의 수정 된 변종이다 2+ 난원래 캘리포니아 대학에서 박사 로저 첸의 실험실, 샌디에고, 미국 9,16에 의해 만들어진 ndicator. 원래 D1ER는 이전 칼슘 2 + 지표 9,16에 비해 훨씬 넓은 범위 (0.5-160 μM)을 통해 칼슘 감도를 표시 cameleons라는 유전자 인코딩 칼슘 지표의 2 세대에 속한다. 새로운 변형 D1SR 박사 웨인 첸 (캐나다 앨버타 대학)에서 일종의 선물은, 그러나, 돌연변이 calsequestrin 시퀀스 (대신 원래 D1ER에서와 같이 칼레 티 큘린 순서)를 수행한다. 돌연변이 calsequestrin는 11 루멘 SR 내에서 칼슘 결합에 내인성 calsequestrin과 경쟁의 문제를 제거 칼슘 결합 감소했다. D1SR 표시등​​이 잘린 강화 시안 형광 단백질 (CFP)과 노란색 형광 단백질 (YFP) 수정 칼 모듈 린 (CAM) 및 M13을 포함하는 링커 단백질에 의한 바인드 (t을 운반CAM) 시퀀스에 결합 미오신 경쇄 키나제의 그는 26 잔류 물 펩타이드. 캠-M13 순서는 내생 칼 모듈 린 결합에서 M13을 방지하기 위해 수정되었습니다. 또한, SR 유지를 보장하기 calsequestrin 시퀀스 CFP (11)의 5&#39;- 말단에 첨가되었다. 칼슘 이온에 결합 할 때, 캠 M13 도메인은 FRET 신호 강도의 증가로 기록되는 측면 CFP와 YFP 사이의 에너지 전달이 증가 될 구조적 변화를 통해 진행한다. 2+ SR 내강 칼슘의 농도가 떨어질 때 한편, 캠 M13 도메인은 측면 CFP 및 YFP 및 FRET 신호 강도의 현저한 저하의 에너지 전달의 감소를 초래 역방향 구조적 변화를 통해 진행 .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (high glucose, pyruvate)</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>35 mm glass-bottomed plates</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 &amp;mu;M vented blue plug seal cap flask</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Life technologies</td><td>25200056</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene Conical Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gift</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C until right before use</td></tr><tr><td>1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of calcium fluctuations within the sarcoplasmic reticulum of cultured smooth muscle cells using fret-based confocal imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

이 섹션은 간접적 세포질 칼슘의 변동을 관찰함으로써 칼슘 저장소 농도 소기관하는 변화를 측정 통상 사용되고있는 방법에 비해, SR 내강 칼슘 농도 데이터를 캡처하는 한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 제공 2+ . 도 1a는 YFP 채널 (514 nm의 여기 / 535 nm의 방출)에 D1SR 아데노 바이...

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Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K 조회수.  University of British Columbia. Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

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Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Fura - 2 오전 사용하여 두피 뉴런의 칼슘 이미징

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

연구

생물학

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

발생학

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

<meta charset="utf8"></head><body>채널 활성화 연구를 위한 단세포 칼슘 이미징

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

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인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

초점 칼슘^{2 + 과도 감지}

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

이미징 로컬 CA

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

요약

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Fura - 2 오전 사용하여 두피 뉴런의 칼슘 이미징

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유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

이미징 로컬 CA

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표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링

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초점 칼슘^{2 + 과도 감지}