Name: fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
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The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

신선한 S. 1. 분리 venezuelae 포자와 소비 문화 매체의 준비 <ol><li> divIVA-mcherry의 P의 ftsZ - 변형 SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P의 divIVA 10 μl의 포자로, 60 μL R2 미량 원소 용액 (TE)로 보충 된 30 ml의 말토오스 - 효모 추출물 - 맥아 추출물을 접종 (MYM) 매체, -ftsZ-ypet)]. 일관된 성장과 세포의 포자를 들어, 당황 플라스크 또는 충분한 통기 수 있도록 스프링이 들어있는 플라스크를 사용합니다. </li><li> 30 ° C에서 35 ~ 40 시간, 250 rpm으로 문화에 대한 세포. </li><li> 액체 장착 된 위상차 현미경으로 세포를 검사합니다. 이 시점에서 균사 조각과 포자 볼 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기는 1 분 400 XG에 테이블 탑 원심 분리기 1 ml의 세포는 균사체 큰 세포 조각을 펠렛합니다. </li><li> 약 300 ㎕의 상층 액을 공동으로 이동새로운 1.5 ML 튜브에 포자 현탁액을 ntaining과 얼음에 보관하십시오. 단계 1.7에 대한 나머지 배지를 유지합니다. </li><li> 포자에게 MYM-TE에서 1시 20분 희석 (최종 농도 : 0.5 × 10 7 포자 / ㎖) 및 필요할 때까지 얼음에 보관 (단계 2.3 참조). 주 : 스트렙토에서 포자를 트리거 정확한 조건은 포자 배양에서 알 수없는 세포 외 신호에 포함 소비 MYM-TE 매체를 이용하여 이해되지 않지만, 포자 형성을 자극한다. </li><li> 포자와 균사 조각 무료 MYM-TE 지출을 구하는 나머지 배지 10 ㎖를 필터 - 소독. 멸균 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 전송 멸균 15 ML 튜브에 MYM-TE를 보냈다. </li><li> 유사한 성장 조건을 사용하여 추가 실험을 수행 할 경우 39 ° C에서 몇 일 동안 제조 소요 MYM-TE 유지. </li></ol> 미세 유체 장치 2. 준비 참고 : 각 미세 유체 괞 찮아테가 수행하는 네 개의 독립적 인 실험까지 할 수 있습니다. 실험을 설정할 때 사용되지 않는 흐​​름 챔버의 오염을 방지하기 위해 멸균 솔루션과 근로 조건을 사용합니다. <ol><li> 미세 유체 플레이트에서 운송 솔루션을 제거하고 멸균 MYM-TE로 우물을 씻어. </li><li> 300 ㎕의 MYM-TE는 6 우물 2에 잘 1 300 μl를 보냈다 MYM-TE 입구에 추가. </li><li> 부하 40 μL는 레인 &quot;A&quot;의 셀 로딩 잘 8 단계 1.6에서 포자를 희석에 따른 플레이트에 매니 폴드 지침을 제조 밀봉. </li><li> , 미세 유체 제어 소프트웨어를 실행 적절한 플레이트 유형을 선택하고 잘 당 2 분 6 psi에서 5 입구 우물에서 흐르는 매체에 의해 1 주요 유동 채널과 문화 챔버로 흐름 프로그램을 설정합니다. </li><li> 발아 및 식물 세포의 성장을 허용하기 위해 6 시간 동안 흡입 웰 1 MYM-TE 흐르는 : 미세 유체 제어 소프트웨어, 실험 유량 프로토콜을 생성한다. 스위치다음 실험의 나머지 기간 동안 잘 2~5에서 소비 MYM-TE의 관류에 관한 것이다. 실험 과정 동안 (약 9 μL 매체 / 시간에 상응 함) 6 psi에서 유동 압력을 일정하게 유지한다. 단계 3.5 이후 흐름 프로그램을 시작합니다. </li></ol> 현미경 및 시간 경과 프로토콜의 3. 최대 주 :이 방법은 sCMOS 카메라, 메탈 할라이드 램프, 하드웨어 자동 초점, 96 웰 플레이트 단계 홀더 환경 챔버를 구비 한 완전 자동화 된 동력 위드 도립 현미경상에서 구현되었다. <ol><li> 실험 시작 후 오토 포커스 문제를 방지하기 위해서 사전에 30 ° C의 환경 챔버를 미리 가온. 필요한 시간은 사용 환경 챔버, 현미경 및 가열 시스템에 의존한다. 실험 전에 시스템을 밤을 가열하기 시작합니다. </li><li> 현미경 및 현미경 자동화 및 제어 softwa를 켭니다레. 이러한 100X, 1.46 NA 오일 DIC 목표로 최적의 신호 수집 및 공간 해상도에 대한 높은 개구 수 (NA) 오일 침지 목표를 사용합니다. 노란색 형광과 빨간색 형광 단백질 융합의 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지와 이미지를 수집하기 위해 적절한 필터 및 이색 거울을 선택합니다. </li><li> 목적에 침지 기름 방울을 놓고 이미지 획득 동안 셀 초점을 개선하는 미세 플레이트 촬상 창 아래쪽에 침지 유체를 추가한다. 조심스럽게 거꾸로 현미경의 스테이지로 밀봉 된 미세 유체 소자 (단계 2.5)를 탑재합니다. 판 안전하게 무대 홀더에 넣고 실험의 과정을 통해 이동하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 방향에 대한 매립 위치 마커를 사용하여 초점 미세 배양 챔버의 촬상 창을 가지고. 제 1 유동 챔버의 왼쪽 부분에 초점에 해당하는 트랩 크기 5 ( &quot;A&quot;를 표시)0.7 ㎛의 트랩 높이입니다. </li><li> 마이크로 유체 소프트웨어, 입구도 8에서로드 셀 15 초 4 PSI에. 촬상 창에 걸쳐 스테이지를 이동하여 배양 챔버에서 세포 밀도를 확인한다. 포자가 트랩되지 않은 경우, 셀 로딩 단계를 반복 또는 다른 원하는 세포 밀도 (2048 X 2048 픽셀 촬상 창 당 1-10 포자)에 도달 할 때까지 하중 압력 및 / 또는 시간을 증가시킨다. 문화 챔버를 과부하하지 마십시오. 우리는 일반적으로 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 이미징을위한 트랩 크기 5를 사용하지만, 우리는 4와 3 셀로드 프로세스를 최적화 추가 제안에 대한 공급 업체의 설명서를 참조하십시오 크기 트랩 좋은 결과를 얻었다 :합니다. </li><li> 단계 250에서 제어 흐름 소프트웨어 프로그램을 시작하고 미세 플레이트 화상 취득을 시작하기 전에 현미경 단계에서 1 시간 동안 평형을 가열 할 수있다. </li><li> 현미경 제어 소프트웨어에서 뮤를 취할 다차원 인수를 설정시간이 지남에 따라 여러 단계의 위치에서 ltiple 이미지 : <ol><li> 자동 저장의 경우 : 이미지 파일의 자동 저장을위한 디렉토리를 지정합니다. </li><li> 조명 설정에 대해서는 사전에 각 특정 구조에 대한 최적의 조명 설정을 결정합니다. DIC 150 밀리 초, YFP 250 밀리 초, RFP 100 밀리 : 설명 실험을 위해, 다음과 같은 노출 시간을 사용합니다. </li><li> 시계열 들어 : 시퀀스에서 원하는 시점에서 영상을 획득하는 시계열을 설정. S.의 수명을 이미징 venezuelae는 24 시간 동안 40 분의 시간 간격을 선택합니다. </li><li> 스테이지 위치 및 자동 초점 : 관심있는 각각의 결상 위치의 단계 및 저장 단계의 위치를​​ 이동하여 배양 챔버를 검사한다. 단일 단계의 위치가 충분히 떨어져 광표백과 phototoxicity.Typically (12)의 위치까지 사용할 최소화하기 위치되어 있는지 확인합니다. 각 시점에 대한 실행 자동 초점 루틴은 느린 초점 드리프트를 보정합니다. 만약 현미경 제어 소프트웨어에서 사용할&quot;하드웨어 자동 초점으로 지역의 표면 업데이트&quot;로 설정 자동 초점 전략. 선택한 스테이지 위치의 Z 좌표가 확인되면, 하드웨어 자동 초점을 활성화합니다. </li></ol></li><li> 현미경 제어 소프트웨어의 시간 경과 실험을 시작합니다. </li><li> 모든 단계의 위치가 나중에 지점에서 초점이 아직도 있는지 확인합니다. 자동 초점을 사용할 때 몇 시간에 걸쳐 실행 시간 경과 실험을 위해, 우리는 때때로 심지어 무대 드리프트를 관찰합니다. 스테이지 위치가 재 집중해야하는 경우, 적절한 시점에서 실험을 중지 포커스 조정 정의 묘화 시간 간격 (단계 3.7.3) 내에 실험을 재시작. 시계열을 연결하는 방법에 대한 단계 4.3를 참조하십시오. </li><li> 24-30 시간 후 이미지 수집을 중지 또는 관심의 영역에서 균사가 포자로 분화 한 경우 (DIC 이미지 시리즈 참조). 소프트웨어 흐름 프로그램을 중지하고 미세 유체 장치를 분해. </li><li> 단기 석재 중고 미세 유체 플레이트를 준비합니다격노. MYM-TE 나머지 제거하고 6도 1에서 MYM-TE를 보냈다 빈 폐기물도 7 및 멸균 조건에서 세포로드 웰 (8), 다시 채우기에 레인 &quot;A&quot;의 우물과 사용하지 않은 차선의 우물 ( &quot;B&quot;를 사용 멸균 인산 완충 식염수와 함께 접시에 &quot;D&quot;) (PBS). 4 ° C에서 출력 및 저장 건조되는 것을 방지하기 위해 파라 필름과 판을 밀봉합니다. </li></ol> 피지 소프트웨어를 사용하여 시간 경과 영화의 4 세대 참고 : 우리는 다른 상용 및 무료 소프트웨어 패키지가 ZenBlue, MetaMorph로부터, ICY, ImagePro 또는 ImageJ에 포함 시간 경과 현미경 이미지를 처리​​ 할 수​​ 있음을 유의하십시오. 여기에서 우리는 오픈 소스 영상 처리 ImageJ에 기반으로 프로그램 및있는 이미 유용한 사전 설치된 플러그인을 제공합니다이다 피지에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> 피지가 설치되어있는 컴퓨터로 시간 경과 실험에서 전송 영상 데이터입니다. </li><li> 프로그램을 실행 및 사용하여 이미지 파일을 가져옵니다# 34; 파일&gt; 가져 오기&gt; 바이오 형식 &quot;. 또는에서 단순히 피지로 이미지 파일을 드래그하여&quot;바이오 형식 가져 오기 옵션 각 조명 채널에 대한 별도의 이미지 스택을 얻기 위해 분할 채널 &quot;&quot;확인란을 선택 &quot;(DIC , RFP, YFP). </li><li> 옵션 : (DIC, RFP, YFP 각 채널에 의한 재 초점 (단계 3.9)에 이미지 수집에서의 휴식으로 인한 별도의 시계열을 병합 각각의 이미지 스택을 열고 실행 &quot;이미지&gt; 스택&gt; 도구&gt; 연결하여&quot;하려면 ). </li><li> 화상 스택 스크롤하여 저속 데이터의 품질을 평가한다. 시간이 지남에 초점에 머물렀다 균사, 쇼 균사 생장을 찾아 결국 포자 (DIC 스택)을 형성한다. 각각 식물 또는 sporogenic 균사 (YFP 스택)에 하나의 고리 또는 여러 사다리 형 구조를 형성 균사 끝을 DivIVA-mCherry (RFP 스택)과 FtsZ-YPet의 예상 세포 내 현지화를 검사합니다. </li><li> 다운 스트림 플라스틱 가공에 대한 관심의 영역을 분리이미지의 NG. 시간 경과 현미경은 종종 피지에 의해 처리 속도가 느려질 수 있습니다 큰 파일을 생성합니다. 이는 따라서 식별하고 ROI (region of interest)를 분리하고 화상 스택의 작은 버전이 상기 화상 처리 단계를 수행 할 것을 권장한다. <ol><li> 메뉴의 &quot;사각형 선택&quot;툴을 선택하고 현상 균사가 이미지 시리즈에 걸쳐 ROI 둘러싸인되는 방식으로 DIC 화상 스택 직사각형 ROI를 그린다. </li><li> &quot;Ctrl 키&quot;+ &quot;시프트&quot;+ &quot;D&quot;와 ROI 스택 중복. </li><li> YFP 이미지 스택의 이름 표시 줄을 클릭하고 &quot;편집&gt; 선택&gt; 선택 복원&quot;YFP 스택의 동일한 배치하기 위해서만 스택 원래 DIC부터 사각형 선택을 복원하고 &quot;Ctrl 키&quot;로 ROI를 복제하기 위해 메뉴에서 + &quot;시프트&quot;+ &quot;D&quot;. </li><li> RFP 스택에 대해이 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 세 개의 이미지가 t 스택의 이미지를 맞 춥니 다오 시간이 지남에 xy 평면에서 무대 드리프트를 제거합니다. DIC 스택의 마지막 프레임에 스크롤 메뉴에서 &quot;플러그인&gt; 등록&gt; StackReg&gt; Ri​​gedBody&quot;를 선택합니다. RFP와 YFP 이미지 스택에 대해이 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 단계 4.5.1-4.5.3를 반복하여 투자 수익 (ROI)을 잘라. </li><li> 옵션 : &quot;&gt; 프로세스 대비 강화&quot; &quot;밝기 및 대비 도구를 조정&quot;( &quot;Ctrl 키&quot;+ &quot;시프트&quot;+ &quot;C&quot;) 또는 선택 각 이미지 스택 수동으로 밝기와 대비를 조정 메뉴에서하고 &quot;표준화&quot;를 적용 스택의 모든 이미지에 대한 명령. 이 후자의 명령 하류 화상 해석에 영향을 미칠 수 있으므로, 화소 값을 변경하고 것을 주목해야한다. </li><li> 옵션 : 가로 또는 세로로 &quot;이미지&gt; 스택&gt; 도구&gt; 겸용&quot;플러그인을 사용하여 (RGB 파일 형식으로 변환 4.11 참조) 개별 스택을 결합합니다. </li><li> (한 번 스탬퍼 ( &quot;&gt;&gt; 스케일 바 도구 분석&quot;) 규모 바 추가# 34; 이미지&gt; 스택&gt; 시간 스탬퍼 &quot;). </li><li> &quot;티파니&quot;형식의 이미지 시퀀스로 수정 된 이미지 스택을 저장합니다. 동영상을 제작하려면, &quot;아비&quot;로 저장합니다. 또한, &quot;바이오 형식&gt; 바이오 포맷 수출 &#39;플러그인하고&quot;.MOV &quot;파일 형식을 선택을 사용하여 QuickTime 포맷 수출 이미지 시리즈. </li><li> 하나의 프레임에서 사진을 얻으려면 + &quot;D&quot;관심있는 프레임을 선택하고 이미지 &quot;Ctrl 키&quot;+ &quot;시프트&quot;중복. &quot;이미지&gt; 유형&gt; RGB 색상 또는 8 비트&quot;의 결과 이​​미지에 &quot;RGB&quot;또는 &quot;8 비트&quot;의 유형을 변경하고 &quot;티파니&quot;로 이미지를 저장합니다. 참고 : 피지 추가로 더 주석을 기능이나 처리 시간 경과 시리즈의 번호를 제공합니다. 자세한 내용은 (http://fiji.sc/Fiji) 피지 온라인 지원으로 이동합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 수명주기의 시간 경과 현미경은 과거에 기술적으로 도전하고있다. 여기에서는 (도 2)를 시각화하고 개발 과정을 통해 진행을 추적 할 수 있도록 셀 극성 마커 DivIVA 및 세포 분열 단백질 FtsZ에 형광 단백질 융합체를 사용하여 전체 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징을 수행하기 위해 강력한 프로토콜을 제시한다. 이 방법의 핵심은 S.의 재배입니다 (MYM-TE을 보냈다) 소비 매체와 일정한 매체 관류 정상적인 성장 매체 (MYM-TE)의 교환을 할 수있는 미세 유체 장치에 venezuelae. 배양 조건의 변화는 영양이 풍부한 매체의 지속적인 공급이 식물 growt을 자극하는 반면, 포자 형성을 촉진하기 때문에 폐 배지에서 어떤 아직 알 수없는 세포 외 신호로 우물 (예 : 쿼럼 센싱 신호)로 영양 하향 변속 설명 프로토콜 중요하다거의 모든 포자 형성 시간 (데이터는 보이지 않음). 따라서,이 마이크로 유체 시스템의 세포를 배양하는 실험 더 유연성을 제공하며, 배양 조건의 변화에​​ 따라 변화 세균 성장​​을 장기간 모니터링을 허용하므로, 아가 로스에 세포를 배양 우수하다. 미세 플레이트를 하나의 사용을 위해 설계되지만 단지 이후 실험에 이용 될 수있는 셀을 접종하지 않은 채널을 흐른다. 우리는 긴 시간을 위하여 개방 된 판에 매니 폴드를 밀봉 문제를 경험으로 우리는 주일 이내에 미세 유체 플레이트의 모든 채널을 사용하는 것이 좋습니다. 실험 설정하면, 우리는 생식 관 (데이터 미도시) 출현 전에 냉동 글리세롤 스톡으로부터 유도 포자는 적어도 6 시간 필요한 반면, 새로 제조 된 포자가 유동 챔버로 로딩되는 두 시간 내에 발아하였습니다. 발아의 이러한 지연은 실험의 길이 연장을 방해 할장비의 가용성 및 실험 조건. 이 세균 튜브 개발 및 생장에 충분한 영양분을 제공하기 위해 적어도 3 시간 동안 MYM-TE의 재관류로 실험​​을 시작하는 것이 중요하다. 실험은 식물의 성장을 연구 설계된다면 MYM-TE와 관류 초기 3 시간 이상 확장 할 수있다. 포자 출발 물질 선호를 제공하는 반면, 짧은 균사 단편은 미세 플레이트에 장착 될 수있다. 그러나, 전단 균사체를 이용하여 적재 효율이 낮은 중요하다 종종 비 포자 돌연변이를 검사 할 때 제한을 제시 할 수있다 여러로드 실행이 필요합니다. 에 관계없이 사용 접종의 종류, 미디어의 확산을 방해하고 이미지 분석을 복잡하게 할 수 급속한 인구 과잉으로 이어질 것입니다이 같은 포자 또는 균사 조각과 문화 실에 과부하를하지 않는 것이 중요합니다. 이 기자 단백질의 구조를 계획하는 것이 중요합니다 carefu에서야 베드로 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)에서 형광 시간 경과 영상에 사용. 표적 단백질과 형광 리포터 및 N- 또는 C- 말단 융합체의 선택 사이의 링커의 길이는 매우 중요 할 수있다. 또한, 촬상 주파수 및 노출 시간을 포함하여 최적의 실험 조건은, 각각의 형광 표지 된 단백질을 미리 결정되어야한다. S.을 낮은 수준으로 발현되는 형광 표지 된 단백질을 이미징 할 때 문제가 될 수 있습니다 녹색 / 노란색 채널 venezuelae 균사 전시 자동 형광. 또한,이 발아 및 식물 성장의 초기 단계에서, S. 동안 주목해야한다 venezuelae 짧은 파장 광 (예 CFP로 융합 단백질을 사용하는 경우)에 특히 민감하다. 박테리아의 라이브 세포 이미징을위한 이미징 기술 및 형광 리포터 시스템의 연속 발전에도 불구하고, 소프트웨어 패키지의 대부분 (예 MicrobeTracker, Schnitzelc데이터 세트의 이러한 종류의 후속 처리를위한 자동 학습 학생, CellProfiler)는 다세포 라이프 스타일 27-29으로 사상균 유래의 영상 분석을 지원하지 않는다. 따라서, 스트렙토 다른 사상균로부터 촬상 데이터의 정량적 고 처리량 분석에 적합한 알고리즘을 개발하는 것이 필요하다. 요약하면, 여기에 설명 된 작업은 S.의 엄청난 잠재력을 보여줍니다 때문에 액체에 sporulate 할 수있는 능력의 속을위한 새로운 모델 개발 시스템으로 venezuelae. 미세 유체 배양 장치는 경험이없는 사용자도 사용하기 간단합니다. 그것은 동적 단백질 지역화, 편광 성장, 그리고 unigenomic 포자의 체인에 다세포 균사의 형태 분화를 포함하여 스트렙토 마이 라이프 사이클에 중앙 세포 생물학적 과정을 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 또한이 실험 유를 설정P은 또한 펩티도 글리 칸 합성 또는 프로피 듐 요오다 이드 및 4를 모니터링하는 형광 D 아미노 산 &#39;6 diamidino -2- 페닐 인돌 등의 배양 조건을 교대 필요한 개발 이벤트 또는 형광 염료의 사용을 조사 유혹 시작점을 제공 (DAPI)는 염색체 조직 (30, 31)를 시각화합니다.

A correction was made to: <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

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The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes는 휴면, unigenomic 포자 1-3 다세포, 영양 청소 균사체에서 형태 적 분화를 포함하는 복합 개발 사이클을 특징으로 토양에 서식하는 박테리아입니다. 양호한 성장 조건 하에서 전형적인 스트렙토 포자는 하나 또는 두 개의 배아 튜브 (도 1)를 돌출시켜 발아하기 시작한다. 이 튜브는 팁 확장에 의해 신장과 식물 균사체로 알려진 분기 균사 네트워크로 성장. 폴라 성장과 균사 분기는 필수 단백질 DivIVA로 이동합니다. 이 꼬인 코일 단백질은 세포질 큰 복합체의 일부가 연장되는 선단 4-7에서 새로운 세포 외피 재의 삽입 중요 polarisome를 불린다. 식물 성장 동안, 균사 필라멘트 소위 크로스 벽 (8)의 형성에 의해 간헐적으로 구획화된다. 다시 이러한 가교 벽 형성<html> 첩 FtsZ, 대부분의 세균 9 세포 분열에 필수적인 튜 불린과 같은 세포 골격 단백질. 스트렙토 그러나 이러한 식물 간 벽 수축 및 세포 - 세포 분리를 유도하지 않고 따라서 균사 덩어리 상호 접속 포체 구획 네트워크로서 유지된다. 잘 이해되지 않는 영양소 제한 및 다른 신호에 응답하여, 전문 공중 균사는 식물 균사체에서 이탈 공기 3로 성장한다. 이러한 구조의 발기가 긴 멀티 게놈 공중 균사가 동일한 크기의 unigenomic prespore 구획 수십으로 나누어 그 동안 개발의 생식 단계를 시작합니다. 이 거대한 세포 분열 이벤트는 하나의 sporogenic 균사의 2,10 내에서 여러 FtsZ 반지의 동기 수축에 의해 구동된다. 형태 학적 분화는 휴면, 두꺼운 벽, 착색 포자의 방출에 의해 완성된다. t &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> 그림 1. 고체 배지에 스트렙토 라이프 사이클 이것은 S. 고전 연구에 기초하여 라이프 사이클 모델 한천 플레이트에 성장 coelicolor. 포자의 세포 발달 균사 분지 네트워크를 형성하도록 팁 확장 성장 하나 또는 두 생식 관의 형성으로 시작된다. 폴라 성장과 식물 균사의 분기는 DivIVA (빨간색)으로 이동합니다. 식물 교차 벽의 형성은 FtsZ (녹색)가 필요합니다. 영양 제한 및 다른 신호에 응답하여, 공중 균사가 건립된다. 공중 성장의 체포 단단히 상자 같은 prespore 구획에 sporogenic 균사를 구획 포자의 격막을 야기 할 FtsZ 링, 사다리의 조립과 조정됩니다. 이 구획은 두꺼운 포자 벽을 조립하고 결국 relea 있습니다성숙 색소 포자를 나오지. 스트렙토 라이프 사이클의 키 이벤트가 잘 발달 1,3- 특징으로한다. 그러나 아직 어떤 부족한 단백질 현지화 역학, 염색체의 움직임과 발달 제어 세포 분열로 차별화를 뒷받침 세포 내 프로세스에 대한 통찰력을 제공하기 위해 형광 시간 경과 현미경을 사용하는 세포 생물학적 연구이다. 스트렙토 개발의 라이브 세포 이미징 때문에 라이프 사이클의 복잡성과 유기체의 생리 학적 특성에 도전하고있다. 식물 성장 이전 연구 및 포자의 격막의 초기 단계에서는 산소 투과성 촬상 챔버 또는 현미경 단계 11-15에서 스트렙토 coelicolor의 아가 성장을 지원 채용했다. 이러한 방법은 그러나, 여러 가지 요인에 의해 제한된다. 일부 시스템은 세포 성장의 단기 촬상 허용세포 전에 D 형광 단백질은 산소 공급 부족으로 고생하거나 인해 균사 개발의 3 차원 패턴에 초점면에서 성장한다. 장기 이미징 세포 대체 성장 또는 응력 조건에 노출하고, 아가로 오스 패드의 매체로부터 배경 형광이 심각 강한 형광을 모니터링하는 능력을 제한 할 수 없기 때문에 아가 패드 한계 실험 유연성에 세포를 배양하는 것이 가능하다 경우 신호. 여기에서 우리는 우수한 정밀도와 감도 완전한 스트렙토 마이 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명합니다. 위드 형광 현미경 (도 2)에 접속 된 마이크로 유체 장치 스트렙토을 성장시킴으로써, 우리는 지금까지 30 시간의 기간 동안 발아, 식물의 성장과 포자의 격막을 모니터링 할 수있다. 이것은 크게 새로운 모델 생물의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 사용에 의해 촉진된다 </EM&gt; venezuelae 그것은 침수 문화에 거의 완성 단계에 sporulates하여 클래식 모델 종 S.의 한계를 극복 할 수 있기 때문에 고체 배지 16 ~ 20에만 sporulates coelicolor. 식물의 성장과 포자 형성을 시각화하기 위해, 우리는 공동 명시 형광 셀 극성 마커 DivIVA와 키 세포 분열 단백질 FtsZ 버전의 태그. 우리는 성공적 마이코 박테리아, 대장균, 코리 네 박테 리움 글루 타미 쿰, 고초균, 효모 및 21-25에 이용 된 상업적으로 이용 가능한 미세 유동 장치를 이용하고있다. 시스템은 단일 초점 평면 셀 트랩 상이한 저장조로부터 배지 연속 관류의 제어를 허용한다. 상세한 프로토콜에서는 S. 노출이 기능을 활용할 포자 형성을 촉진하는 영양 하향 변속에 식물 균사체를 venezuelae. 프로토콜 드스크라이브 전체 스트렙토 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징을위한,하지만, 특정 발달 단계가 특히 관심이 있다면 다른 미디어 환경이나 현미경 설정이 선택 될 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> 그림 2 : 회로도 실험적인 작업 흐름을 묘사. 프로토콜에서 설명하는 세 가지 주요 단계가 표시됩니다. 첫째, 포자 및 소비 매체는 고정 상 문화에서 제조된다. 둘째, 새로운 포자 마이크로 유체 시스템 및 S.로로드 venezuelae는 발달주기가 최적 성장 온도를 유지하기 위해 배양 챔버 전자동 도립 현미경을 사용하여 전체에 결상된다. 셋째, 얻어진 시간 경과 시리즈 분석 및 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 처리됩니다.

<table><tbody><tr><td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Microfluidic culture plates</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td></tr><tr><td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>Environmental chamber surrounding the microscope</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td></tr><tr><td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>Stage holder for microfluidic plate</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>Microscope control software</td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/Positions</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open-source software package</td><td>&lt;u&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/u&gt;</td><td>Generation of time-lapse movies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 4 g Maltose&lt;br/&gt; 4 g Yeast extract&lt;br/&gt; 10 g Malt extract&lt;br/&gt; add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td><td></td><td></td><td>Sporulation medium used to culture &lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; SV60</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;R2 Trace element solution (TE)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 8 mg ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 40 mg FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;-10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;Mo&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; add 200 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; Autoclave and store at 4 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td><td></td><td></td><td>Add 0.002 volumes to MYM</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>Preparation of spent MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Centre strain collection</td><td></td><td>&lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; strain expressing &lt;em&gt;divIVA-mcherry&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;ftsZ-ypet&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

전체 S.의 성공적인 라이브 세포 이미징 venezuelae 라이프 사이클 발아, 식물의 성장과 포자 형성 (도 3, 영화 1)의 주요 발달 단계를 포함하는 연속 시계열을 산출한다. 수명주기를 통해 진행의 시각화는 더 DivIVA-mCherry 및 FtsZ-YPet의 별개의 세포 내 지역화에 의해 강화된다. 발아 및 식물 성장하는 동안, DivIVA-mCherry 독점적으로 성장 균사 조언, 새로 분기점을 (그림 4A)을 형성 마크에 축적한다. 이러한 결과는 DivIVA 12,26의 이전에보고 된 세포 내 위치와 일치한다. 반대로 FtsZ-YPet은 균사 성장 (도 4b)에 불규칙한 간격으로 단일 고리 형 구조를 형성한다. 이러한 구조는 interconn의 형성으로 이어지는 비 협착 식물 간 벽의 합성 지지체를 제공반사된다 균사 구획 8. sporogenic 균사로 균사 성장의 세포 분화가 극성 DivIVA-mCherry의 초점의 실종에 의해 표시되고, 극성 성장의 체포와 FtsZ-YPet 형광의 동반 증가 (그림 4C). 균사를 포자에서 FtsZ - YPet의 현지화 패턴이 크게 변화; 제 1 나선형 FtsZ-YPet 필라멘트는 균사 함께 공중제비 다음, 갑자기, 거의 동기 이벤트에서,이 나선 정기적 간격 FtsZ-YPet 반지의 사다리로 합체. 여기에 설명 된 실험 조건 하에서, 이들 고르게 분포 FtsZ-YPet 사다리 약 2 시간 동안 유지. 마지막으로, 포자의 격막은 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 (그림 4D) 결국 새로운 포자가 출시에 식별됩니다. 로 제공 피지 소프트웨어를 사용하여 화상 처리를 설명 후속 프로토콜<html> TEP 단계별 획득 시간 경과 시리즈 (동영상 1)에서 게시를 위해 동영상을 제작하는 방법을 설명합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> 그림 3 : S.의 대표 시간 경과 형광 현미경 시리즈에서 스냅 샷 이미지 venezuelae 생산 형광 표지 FtsZ (녹색) 및 DivIVA (적색) 병합 된 이미지의 선택된 프레임이 보이고있는 바와 같다 (상단 패널 : RFP-YFP-DIC, 하단 패널 : DIC). 발아, 식물의 성장과 포자를 포함하여 스트렙토 마이 세스 라이프 사이클을 시각화. 이미지가 영화 1 시간에서 찍은이 시간에 : 분. 스케일 바 = 5 μm의. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> D / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4 : 스트렙토 마이 라이프 사이클의 성공적인 시간 경과 시리즈의 대표 결과 DivIVA-mCherry의 (A) 버전.. RFP 및 DIC 채널의 병합 된 이미지와 함께 영화 1에서 두 개의 연속적인 시간 지점의 스냅 샷을 보이고있는 바와 같다. DivIVA-mCherry 새로운 균사 분기 사이트 (채워진 화살표 머리)를 표시하고 극성 성장 (오픈 화살표 머리)를 지시하는 균사의 끝에 지역화. 스케일 바 = 10 식물 성장 (화살표 머리) 동안 μm의 (B) FtsZ-YPet 현지화. FtsZ-YPet은 (DIC, 낮은 패널)을 수축하지 않는 하나의 고리 형 구조 (상판)를 형성한다. 포자의 격막시 (C) FtsZ-YPet (녹색) 지역화. (: 분 시간) DivIVA-mCherry의 초점은 아래에 묘사 된 경과 시간, 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바 : 5 μm의. (C)에서 포자의 균사의 DIC 이미지를 대응 (D) 양식을 보여주는결국 포자의 체인 (오른쪽 이미지)로 성숙 볼 수 포자 격막 (왼쪽 이미지)와 prespore 구획의 ATION. 시간은 시간에 : 분. 스케일 바 = 5 μm의. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1 프레임" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> 영화 1 : 라이프 사이클 venezuelae 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 시간 경과 형광 현미경 시리즈 영화가 병합 된 RFP-YFP 이미지 (왼쪽)와 해당 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 (오른쪽)으로 구성되어 있습니다.. DivIVA-mCherry 녹색에서 빨간색과 FtsZ - YPet에 표시됩니다. 단일 프레임 사이의 시간 간격은 40 분이다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">생을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>의 영화.

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Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

전체의 형광 시간 경과 영상<em&gt; S. venezuelae</em미세 유체 장치를 사용&gt; 수명주기

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.8K 조회수.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

비디오: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

연구

생체공학

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

형광 라이브 셀 이미징의 완전 한 식물 세포의 주기 느린 성장 사회 박테리아 Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

생화학

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

발생학

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

생물학

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

신경과학

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

FLIM 기반 대사 및 저산소증 분석을 위한 다세포 스페로이드 형성

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

저자 스포트라이트: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 대사 및 산소화 분석을 위한 스페로이드 형성 방법 표준화

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

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단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)