The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Qu&#233;bec-Sant&#233; (FRQS).

주 : 프로토콜 센다이 바이러스 (SEV) 감염 A549 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 그러나, SDS-PAGE 및 기본 페이지에 대한 프로토콜은 지금까지 테스트 한 모든 인간과 쥐의 세포 유형, 다양한 IRF3-활성화 자극 9,15,19,24,25 자극 특히 골수 세포와 함께 작동합니다. A549 세포의 감염 1. <ol><li> 37 ° C / 5 % CO 2 (20)에 15cm 플레이트에서 배양 A549 세포를 유지 ml의 10 %를 열 불 활성화 소 태아 혈청 (HI-FBS), 1 % L- 글루타민을 함유하는 F12K / 햄 배지 (완전 F12K / 햄 매체). 참고 : 세포 배양 및 치료에 사용되는 모든 솔루션은 멸균해야합니다. </li><li> 감염 전에 24 시간에서 매체를 기음과 증류수 인산염 완충 생리 식염수 실온에서 (D-PBS) 10 mL로 세포를 씻어. </li><li> 세포를 커버하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양하기 위해 각 플레이트에 0.25 % 트립신 EDTA 용액 1ml를 추가합니다. </li><li> 빨리 번째로 부화 중지전자 세포는 부드럽게 한 손으로 판을 눌러 판에서 분리하기 시작. 접시 당 예열 완전한 F12K / 햄 10 ml의 배지를 첨가함으로써 트립신을 불 활성화하고 15ml의 원뿔형 튜브에 세포를 옮긴다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 350 XG에 원심 분리기. 상등액을 제거하고 균일 한 단일 세포 현탁액을 얻었다 완전한 F12K / 햄 매질 8 ml 중에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 예열 완료 F12K / 햄 배지 4 ㎖ 중의 60mm 판 당 1 × 106 세포의 밀도로 세포를 시드. 부화 20 - 37 ℃ / 5 % CO 2에서 24 시간 후에는 20 - 24 시간, 세포는 90 % 컨 플루 언트 단층 (이 1.5 × 106 세포에 상당)을 형성. </li><li> 매체를 제거하고 혈청이없는 F12K / 햄 매체의 2 ㎖ (SFM)로 세포를 씻어. 60mm 판 당 신선한 SFM 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 간단히 얼음과 소용돌이에 (저장 -80 ° C에서 분주) 센다이 바이러스 (SEV)의 나누어지는을 녹여. </li><li> 일을 희석예열 SFM의 E 바이러스 60 HAU / 100 μl를 얻었다. 아래로 부드럽게로 pipetting에 의해 혼합 40 HAU / 10 6 세포에 감염을 수행 할 판 당 희석 바이러스 100 μl를 추가합니다. 감염되지 않은 제어 판에서 바이러스를 추가하지 마십시오. </li><li> 37 ° C / 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 손으로 3 또는 4 회 플레이트를 교반하거나 감염의 최초 시간 동안 인큐베이터에 직접 배치하는 자동 궤도 또는 요동 쉐이커를 사용. </li><li> 2 시간의 감염 후에서 10 % HI-FBS의 최종 농도를 얻기 위해 20 % HI-FBS를 포함하는 F12K / 햄 배지 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 각각 3, 6, 9 hr의 총 감염 시간에 도달하기 위해 추가 1, 4, 7 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 이 시점 각각에서 2.1 단계로 진행합니다. </li></ol> 전 세포 추출물 2. 준비 (WCE) <ol><li> 감염 매체를 제거합니다. 1 ㎖에 의해 긁어 세포 수확빙냉 D-PBS로 미리 냉각 된 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 20 초 동안 4 ℃에서 16,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠릿 신중 D-PBS의 모든 흔적 캔트. 주 :이 단계에서, 세포 펠렛을 직접 단백질 추출 또는 플래시 냉동 액체 질소 나 드라이 아이스 / 에탄올 욕과 용해 될 때까지 -80 ℃에 보관을 실시 할 수있다. </li><li> 의 50 mM HEPES pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 10 % 글리세롤, 1 % Nonidet P-40 탈 이온수를 함유하는 용해 버퍼를 준비한다 (DDH 2 O). 즉석에서 프로테아제 (1 μg의 / ㎖ 류 펩틴 및 2 μg의 / ㎖ 아프로 티닌) 및 포스파타제 억제제를 추가 (5 mM의 불소화 나트륨을 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트 2 mM의 P 니트로 페닐 포스페이트, 10 mM의 β-글리세 산도 7.5 활성화). 주 : 억제제없이 용해 버퍼는 4 ℃에서 저장 될 수있다. 나트륨 오르토 바나 데이트의 활성화를위한 특정 프로토콜은 특정 시약 / 산업 장비의 표에 설명되어 있습니다NT. </li><li> 용해 완충액 70 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 일반적으로 해물 농도 / μL 약 2 μg의 것입니다. </li><li> 얼음에서 20 분 동안 배양한다. 15 초 동안 액체 질소 용기에 배양하여 해물을 플래시 동결. 그것은 완전히 10 초 동안 용융 소용돌이 될 때까지 실온에서 해물을 해동. 동결 / 해동 / 소용돌이 사이클을 3 회 반복합니다. <ol><li> 대안 적으로, 1 분 동안 에탄올 / 드라이 아이스 배스에서 동결 단계를 수행한다. </li></ol></li><li> 20 분 동안 4 ℃에서 16,000 XG에 원심 분리기. 새로운 사전 냉장 1.5 ML의 원심 관에 뜨는 (WCE에 해당)를 전송합니다. 항상 얼음에 WCE를 유지합니다. </li><li> 이러한 브래드 포드 단백질 기반 분석 (26) 용해 완충액과 호환 어떤 단백질 정량 방법을 사용하여 단백질을 정량. </li></ol> 높은 해상도 SDS-PAGE에 의해 WCE 3. 해상도 <ol><li> 세 변성 전기 영동 젤을 준비합니다. <ol><li> 감응(1 37.5), 375 mM 트리스 - 염산 pH를 8.8 (RT), 0.1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS IRF3 형태는 7.5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드로 이루어지는 분리 겔 16cm 길이의 최소 두 겔을 부어 ), 1 %과 황산 암모늄 0.1 % DDH 2 O에 TEMED 및 4 %의 아크릴 아미드로 이루어지는 적층 겔, 62.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT), 0.05 % SDS, 1 %과 황산 암모늄 0.1 %의 DDH 2 TEMED 영형. 주의! 아크릴 아미드, TEMED 및 SDS는 독성 및 / 또는 자극이다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드를 조작 할 수 있습니다. </li><li> SEV 단백질의 검출을 위해, 분리 겔은 12 % 아크릴 아미드를 포함하는 것을 제외하고, 3.1.1에 기술 된 겔과 유사한 특성을 갖는 8.5 cm 길이의 최소 하나의 겔을 붓는다. </li></ol></li><li> 1 가산함으로써 단계 2.6에서 수득 WCE 변성 : 4 (v / v)의 5 배의 로딩 완충액 (125 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT), 10 % SDS, 20 % (P / V) 글리세롤, 0.0005 % 브로 모 페놀 블루 및 100 ℃에서 가열 하였다 DDH 2 O의 25 % β-머 캅토 에탄올)10 분 동안 C. 빠른 스핀 튜브 캡에 형성 응축을 가지고 있습니다. 주의! β-머 캅토 에탄올 흡입 독성. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드를 조작 할 수 있습니다. </li><li> 마이그레이션 장치에서 젤을 탑재합니다. 25 mM 트리스 - 자료, 0.1 % SDS 증류수에 192 mM의 글리신 (DH 2 O)를 포함하는 버퍼를 실행하는 상부 및 하부 챔버를 입력합니다. </li><li> 로드 각 16cm 젤 잘 하나에서 분자량 표준의 14 μL와 8.5 cm 젤 잘 하나에서 분자량 표준의 7 μL. IRF3 형태 검출 단계 3.1.1에서 제조 한 두 겔의 웰 당 변성 WCE의 30 μg의 부하 (단계 3.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). 부하 8 - SEV 분석 단계 3.1.2에서 제조 한 겔 변성 WCE 웰 당 10 μg의 (단계 3.2에 기재된 바와 같이 제조 됨). </li><li> 이주 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 정전류 30mA에서 젤을 실행. 참고 : 마이그레이션은 일반적으로 approxima 지속tely 16cm 젤 3 시간과 8.5 cm 젤 45 분. </li><li> 니트로 셀룰로오스 막 (5 단계) 상에 전송 진행합니다. </li></ol> 기본-PAGE에 의해 IRF3 이합체 4. 분석 참고 :이 방법은 원래 박사 T. 후지타 (27)의 그룹에 의해 설명되었다. <ol><li> (-) 및 하부 (+) 챔버 전기 영동 버퍼 상단을 준비합니다. 상부 챔버 버퍼는 DDH 2 O 25 mM 트리스 - 염산 pH가 8.4 (RT), 192 mM의 글리신과 1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트 (DOC)로 구성 하부 챔버 버퍼 DDH 2 O. 25 mM 트리스 - 염산 pH를 8.4 (RT) 및 192 mM의 글리신을 포함 주 : 상부 및 하부 챔버 전기 버퍼를 사용할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 그러나,이 전기를 수행하기 전에 실온으로 미리 예열되어 있는지 확인합니다. </li><li> 375 mM 트리스 - 염산 pH를 8.8 (RT), 1 % 탄약 : 7.5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (37.5 1)를 함유하는 8.5 cm 길이의 최소 비 변성 겔을 붓고 해결DDH 2 O.에서 TEMED 천년 황산 0.1 % </li><li> 얼음에 30 분 동안 40mA 정전류에서 젤을 사전 실행합니다. 대략 하부 챔버 영동 버퍼의 레벨을 얼음에 주행 장치를 누른다. 이것은 겔이 얼음에없는 것이 중요하다. </li><li> 1 (v / v)의 DDH 2 125 mM 트리스 - 염산 pH가 6.8 (RT), 30 % 글리세롤 및 0.1 % 브로 모 페놀 블루를 포함하는 오 : 사전 실행하는 동안 WCE는 2 배 기본 페이지 로딩 버퍼 1 얼음에 보관 혼합 </li><li> 부하 8 - 즉시 프리 런의 끝에서 (단계 4.4에 기재된 바와 같이 제조)의 10 μg의 WCE. </li><li> 프리 런에 대해 상술 된 바와 같이 이주 전면 겔 (약 40 분)의 바닥에 도달 할 때까지, 얼음에 25mA의 정전류에서 겔을 실행. </li></ol> IRF3 종 5. 면역 블롯 분석 <ol><li> DDH 2 O. 25 mM 트리스 -베이스 및 192 mM의 글리신을 함유하는 전송 버퍼를 준비 냉장 사용하기 전에 4 ° C에서 전송 버퍼. </li><li> 니트로 셀룰로오스 막 습윤 세 조각 전송 버퍼를 포함하는 플라스틱 / 유리 상자 겔보다 약간 큰 크기로 잘랐다. 한 코너를 절단함으로써 막의 배향을 나타낸다. 전송 버퍼는 3 번 재사용 될 수있다. 용도 사이에 4 ° C에서 버퍼를 저장합니다. </li><li> Uncast 겔 (SDS-PAGE 및 기본-PAGE)과 올바른 방향에 대한 각 젤의 한 모서리를 잘라. <ol><li> 네이티브-PAGE를 들어, 전송 버퍼에 전송하기 전에 DOC를 제거하기 위해 SDS-PAGE에서 러닝 버퍼에 적어도 30 분 동안 교반과 함께 RT에서 겔을 부화. </li></ol></li><li> 10 분 - 5 전송 버퍼에서 겔 (SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE)를 배양한다. </li><li> 양극 (폼 패드 / 종이 필터 / 멤브레인 / 젤 / 필터 종이 / 폼 패드)을 향해 막으로 전송 카세트에 젤 당 전송 샌드위치를​​ 탑재합니다. 샌드위치의 층 사이에있는 모든 거품을 제거하기 위해주의해야합니다. </li><li> 추천 B로 전송을 수행Y 사용 전송 장치 제조업체. 참고 : 흔들 또는 궤도 떨고 플랫폼에서 다음 단계의 모든 배양 및 세척을 수행합니다. </li><li> 전송 시간의 끝에서, DDH 2 O. 7 % 아세트산, 40 % 에탄올을 3 % 글리세롤을 함유하는 고정액에 15 분 동안 막을 배양 세포막을 씻어 PBS의 3 배 5 분 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10.2 밀리미터 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4 DH 2 O에서). 주의! 아세트산은 독성, 자극과 가연성이다. 보호 장갑을 착용하고, 흄 후드에서 조작 할 수 있습니다. 주 : 고정 용액은 여러 번 재사용 될 수있다. </li><li> 기본 페이지 막 들어 5.11 단계로 바로 진행합니다. </li><li> DDH 2 O.에서 6.57 mM의 붉은 개양귀비 빛 1 % 아세트산을 함유 개양귀비 빛 적색 용액에 1 분 동안 배양 하였다 그들을 DH 2 O 빠르게 세 SDS-PAGE 막을 린스 주 : 빨간 개양귀비 빛 솔루션은 R 수 있습니다<html> 수회 eused. </li><li> 배경이 빨간색으로 염색 단백질 밴드를 볼 수있을만큼 흰색 때까지 DH 2 O의 세포막을 씻어. 연필로 표시를 참고 단백질 주위 초과 막 잘라. 교반하면서 PBS에서 5 분 동안 인큐베이션 막을 Destain. </li><li> 블로킹 용액에 4 ° C (PBS, 0.05 % 트윈 20, 5 % 비 지방 건조 우유를 함유하는 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 막을 배양한다 (PBS-T-우유). 상기 멤브레인을 3X 5 분간 씻어 PBS-T. 주 : PBS-T 세척 선택적 5 % 소 혈청 알부민 (PBS-T-BSA) 다음 단계에서 (도 1 및 표 1)을 함유하는 PBS-T에 희석 항체를 적용 할 때 엄격하게 요구된다. </li><li> . 그림 1 및 표 1에 설명 된 순서에 따라 차 항체 (SDS-PAGE 및 네이티브 페이지에서) 네 멤브레인을 품어 PBS-T에서 5 배 5 분 세척을 수행합니다. </li></ol>&quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> 면역 블롯의 분석 그림 1. 순서. 계통도에서는 다양한 IRF3 인산화 및 이량 체 / 단량체 형태를 감지하는 데 필요한 개별 SDS-PAGE 및 기본-PAGE 젤을 설명합니다. 면역 과정의 각 겔로부터 생성 된 막에인가 된 항체의 구체적인 순서를 설명한다. 항 - 액틴 항체는 다른 특이적인 항체를 적용하기 전에 샘플의 동일한 로딩을 위해 사용되는 제 유의. 항 - 액틴 항체 대체 시퀀스는 또한 동작, 항 - 포스 포 IRF3 항체 후에 적용된다. 스트립 안티 굴지 및 안티 SEV 항체 또는 항 - 포스 IRF3 때문에 신호의 크기를 중복 방지 IRF3 항체 사이에 사용된다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together부근에 자리 잡고 페이지 = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> 차 항체 </td><td> 노동 희석 </td><td> 희석 버퍼 </td><td> 잠복 </td><td> 차 항체 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 안티 굴지 </td><td> 1 / 10,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> RT에서 15 분 </td><td> 반대로 마우스 </td><td> SDS-PAGE 후 사용 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-P-Ser386 </td><td> 1/200 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N 4 ° C에서 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> 기본-PAGE 후 사용하십시오. 그것은 희석 된 항체를 재사용하지 않는 것이 좋습니다 </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-P-Ser396 </td><td> 1 / 10,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N 4 ° C에서 </td><tD&gt; 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 그것은 희석 된 항체 안티 IRF3-P-396은 또한 세포 신호에서 사용할 수 있습니다 재사용하지 않는 것이 좋습니다. 최적의 희석이 항체에 대한 1 / 1,000로 정의 하였다, 그러나 많은 사이에 차이가있을 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-P-Ser398 </td><td> 1 / 10,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N 4 ° C에서 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 그것은 희석 된 항체를 재사용하지 않는 것이 좋습니다 </td></tr><tr><td> 안티 IRF3 전체 길이 </td><td> 1 / 7,500 </td><td> PBS-T-우유 </td><td> 실온에서 3 시간 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 안티 IRF3 전체 길이 항체 네이티브-PAGE 후에 사용될 수 있지만, 단량체를 검출에 덜 민감하다. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 된 항체는 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td> 안티 IRF3-NE에스 </td><td> 0.5 μg의 / ㎖ </td><td> PBS-T-우유 </td><td> 실온에서 3 시간 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> 기본-PAGE 후 사용하십시오. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td> 안티 SEV </td><td> 1 / 14,000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 실온에서 3 시간 </td><td> 안티 - 토끼 </td><td> SDS-PAGE 후 사용하십시오. 0.02 % 나트륨 아 지드의 존재하에 4 ℃에서 보관하는 경우 희석 antibodyies 여러 번 재사용 될 수있다. </td></tr><tr><td colspan="6"> 참고 : HRP 결합 된 이차 항체에 사용되는 희석 ​​버퍼는 한 회사에서 다른 변화에 따라 최적화 될 필요가있다. </td></tr></tbody></table> 항체의 표 1. 사양은 면역 블 롯팅 절차에 사용됩니다. <ol start="13"><li> (인사를 고추 냉이 퍼 옥시 다제와 세포막을 품어P)는 그림 1과 표 1에 설명 된대로 차 항체를 π 공역. 완전히 트윈의 흔적을 제거하기 위해 멤브레인을 PBS에서 2 배 5 분 뒤에 PBS-T에서 5 배 5 분을 씻으십시오. </li><li> 완전히 막을 덮을 향상된 발광 시약의 부피로 1 분 동안 막을 배양한다. 여과지를 사용하여 멤브레인을 건조. </li><li> 면역 밴드를 시각화하기 위해 발광 영상 분석기에서 세포막을 놓습니다. <ol><li> 대안 적으로, 민감한 X 선 필름을 사용하여 면역 반응성 밴드의 검출을 수행. </li></ol></li><li> PBS에서 5 분 3 배 세포막을 씻으십시오. 주 :이 단계에서 멤브레인 건조하게 유지 될 수있다. 상기 스트립이 요구되는 경우, 이는 막 건조 전에 스트리핑을 수행하는 것이 낫다. 막은 또한 PBS 단기 저장 될 수있다. </li><li> 항체와 배양 사이에 제거 필요하지 않은 막 들어 단계로 바로 진행합니다 (그림 1 참조)5.20. </li><li> 스트리핑은 항체, 50 ° C에서 DDH 2 O 2 % SDS, 62.5 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8 (RT) 및 0.7 %의 β 머 캅토 에탄올을 함유하는 예비 가온 스트리핑 용액 막을 배양 (도 1 참조) 사이에 요구되는 경우 일반 교반하면서 20 분. PBS에서 5 분 3 배 세포막을 씻으십시오. 참고 : 제거 절차를 수행하는 동안 교반이 핵심입니다. 스트리핑은 혼성화 오븐에서 수행 될 수있다. 대안 적으로, 수욕 비닐 봉투에 밀봉 침지 멤브레인을 사용하여 수행 될 수있다 스트리핑. 배양 동안 5 회 -이 경우, 멤브레인 (4)을 교반을하는 것이 중요하다. </li><li> PBS-T-우유에서 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 세포막을 품어. </li><li> 반복 그림 1 항에있어서 5.16로 5.12 단계를 반복합니다. </li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+IRF-3+reveals+mechanism+of+autoinhibition+and+virus-induced+phosphoactivation.">Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).</li><li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystal+structure+of+IRF-3+and+its+functional+implications.">X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).</li><li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ser-386+of+interferon+regulatory+factor+3+as+critical+target+for+inducible+phosphorylation+that+determines+activation.">Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation.</a> J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).</li><li>Clement, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+IRF-3+on+Ser+339+generates+a+hyperactive+form+of+IRF-3+through+regulation+of+dimerization+and+CBP+association.">Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association.</a> J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).</li><li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+interferon-regulatory+factor+3-dependent+innate+antiviral+response+by+the+prolyl+isomerase+Pin1.">Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1.</a> Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).</li><li>Wathelet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+infection+induces+the+assembly+of+coordinately+activated+transcription+factors+on+the+IFN-beta+enhancer+in+vivo.">Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo.</a> Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).</li><li>Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor-3+is+an+in+vivo+target+of+DNA-PK.">Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TAK1-JNK+cascade+is+required+for+IRF3+function+in+the+innate+immune+response.">The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response.</a> Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).</li><li>Solis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+TBK1+and+IKKepsilon+in+lipopolysaccharide-induced+activation+of+the+interferon+response+in+primary+human+macrophages.">Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages.</a> Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).</li><li>Soucy-Faulkner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NOX2+and+reactive+oxygen+species+for+efficient+RIG-I-mediated+antiviral+response+through+regulation+of+MAVS+expression.">Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).</li><li>Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-dependent+phosphorylation+of+the+IRF-3+transcription+factor+regulates+nuclear+translocation,+transactivation+potential,+and+proteasome-mediated+degradation.">Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation.</a> Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).</li><li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+triggering+of+the+type+I+interferon+system+by+virus+infection:+activation+of+a+transcription+factor+complex+containing+IRF-3+and+CBP/p300.">Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300.</a> EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).</li><li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+minimal+phosphoacceptor+site+required+for+in+vivo+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+response+to+virus+and+double-stranded+RNA.">Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA.</a> J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).</li><li>Bergstroem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+in+vivo+virus-targeted+phosphorylation+site+in+interferon+regulatory+factor-3+(IRF3).">Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3).</a> J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).</li><li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser386+phosphorylation+of+transcription+factor+IRF-3+induces+dimerization+and+association+with+CBP/p300+without+overall+conformational+change.">Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change.</a> Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).</li><li>Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modification+of+interferon+regulatory+factor+3+following+virus+particle+entry.">Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry.</a> J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).</li><li>McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+inhibit+IRF3+phosphorylation+in+response+to+Toll-like+receptor-3+and+-4+by+targeting+TBK1+activation.">Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).</li><li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+(SOCS1).">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).</li><li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IRF-3/-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection:+common+and+unique+pathways.">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li><li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation.">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li><li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+I{kappa}B+Kinase+(IKK)-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1/IKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation.">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li><li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5.">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 여기 설명 프로토콜 IRF3의 이합체 / 단량체 및 phosphoforms I-IV를 구별하기 위해 여러 포스 포 항체의 용도에 결합 고해상도 SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE의 조합으로 이루어져있다. 이 IRF3 종의 적절한 검출은 완전히 특정 설정에 IRF3 활성화를 특성화하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 활성화 된 대 식세포의 LPS의 자극, 인산화 (II 형)를 전시 이량 체, Ser396 / 398 인산화 ​​IRF3의 형성을 유도하지만, S...

<html> 재하와 구조적으로 표현 전사 인자 인터페론 (IFN) 규제 요인 3 (IRF3)는 주로 IFNβ의 유도를 통해 병원균에 대한 방어의 첫 번째 줄에 중요뿐만 아니라, 케모카인 (CC 모티브)의 유도 리간드 (5) (CCL5 통해 ) 및 tetratricopeptide와 인터페론 유도 단백질 등 여러 가지 바이러스 단백질은 IFIT1 / 2 / 3월 1일부터 3일까지 반복합니다. 또는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 4 : IRF3 활성화 polyinosinic - polycytidylic 산 (C 폴리 I)에 다음과 같은 다수의 바이러스 감염 또는 노출을보고되었다. 중요한 것은, 대부분의 연구 바이러스는 IRF3 매개 응답을 회피하고, 이에 호스트 선천성 면역 방어 5 탈출 메커니즘을 진화했다. 따라서 IRF3 활성화를 모니터링하는 것은 선천성 바이러스 숙주 방어의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 또한 본 반응을 방해하는 바이러스에 의해 사용되는 전략을 식별하는 데 매우 중요하다. ENT &quot;&gt; 많은 출판 리포트 그러나 저해상도 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 IRF3 표적 유전자 도입의 모니터링 (IFNB1 및 IFIT1)에 의해 수행 IRF3 활성화 및 / 또는 루시퍼 라제 리포터 유전자 분석의 제한된 분석을 제공 (SDS- PAGE) IRF3 분석. 그러나, 다수의 생화학 적 연구는 다양한 IRF3 돌연변이 IRF3 결정 구조 6-11의 해명의 행동 분석에서의 인산화에 의해 순차 번역 후 변형의 복잡한 실시된다 IRF3를 확립 기여 여러 사이트. IRF3 활성화에 관여하는 인산화의 집합은 세포 유형의 자극에 따라 가장 가능성이있을 것으로 보인다. 감염되지 않은 세포에서 IRF3 비 인산화 및 인산화되어 종은 1, Thr135 및 Ser173 포함 phosphoresidues을 포함하는 것으로 공존 -198 AA의 N 말단 지역 6,12-14.이 인산화되어 F의 축적IRF3의 ORM은 스트레스 유도, 성장 인자 및 DNA를 손상 에이전트 (6)에 의해 유도된다. 전이 활성화 영역을 포함 IRF3의 C 말단 영역에서 빼앗아 /의 Thr 잔기의 인산화에 의해 활성화 바이러스는 다음의 트리거됩니다 폴리 I : 셀형 의존적 15-17에서 C 또는 LPS. IRF3의 C- 말단 인산화는 각각 이합체를 통해 IRF3 활성화, 핵 축적, CREB와 관련에 기여, 두 가지 주요 클러스터, Ser385 / Ser386 및 Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 구성에는보다 7 별개의 phosphoacceptor 사이트를 포함하지 - 결합 단백질 (CBP) / P300의 공동 활성화 인자, 민감한 반응 요소 (ISRE) 합의 시퀀스 및 표적 유전자 9,10,17-19의 전이 활성화를 IFN하는 DNA 결합. Thr390의 인산화는 또한 바이러스 - 유도 IRF3 활성화 (20)에 기여하는 것으로 생각된다. 질량 분석은 IRF3 분석 Ser386, Thr390, Ser396 및 Ser402 잔류 물이 직접 phosphorylat 것을 증명하고있다κB 키나제 ε의 억제제 (IKKε)에 의해 에드 / 탱크 결합 키나제 1 (TBK1)는 9,10 키나아제. C- 말단 잔기의 인산화는 polyubiquitination 및 프로 테아 매개 저하 (10)를 통해 IRF3 활성화의 종료가 필요합니다. 이 과정은 또한 프로필 이성화 핀 1 10, 11의 채용에 필요한 Ser339의 인산화에 따라 달라집니다. 적어도 포스 Ser339 / 396분의 386 잔류 물을 포함 IRF3 종은 hyperphosphorylated 형태로 간주됩니다. 각 사이트의 정확한 순서와 기능은 토론 10,21의 문제가 남아있다. 그것은 활성화 IRF3가 균일 한 상태를 나타내지 않는,하지만 별개의 인산화 또는 이량 특성을 나타내는 서로 다른 활성 종 10,22 존재 이니까 분명하다. 특정 병원체에 응답 IRF3 활성화의 완전한 이해를 제공하기 위해, 그것은으로 Ch 필요가있다유도 활성 종의 어느 aracterize. IRF3 대상 유전자, IFNB1 및 IFIT1의 유도는 IRF3 활성화를위한 신뢰할 수있는 판독을 제공하기 위해 입증되었습니다. 그러나, 이들 유전자의 발현을 모니터링 IRF3의 다른 활성화 상태를 구분하지 않습니다. 특정 설정에서 IRF3 활성화 상태의 포괄적 인 분석은 인산화 및 이량 상태 (10)의 상세한 특성에 의존한다. Unphosphorylated (폼 나는), (II 형) 및 hyperphosphorylated, 인산화 (형태 III 및 IV) IRF3 양식 6,18,23이 성공적으로 고해상도의 SDS-PAGE 분석 감소 이동성을 해결할 수 있습니다. 단량체 및 이량 IRF3 종 효율적 네이티브-PAGE 분석에 의해 식별 될 수있다. 별개의 IRF3 phosphoacceptor 부위에 대해 지시 한 포스 포 항체와 조합하여 사용할 때 이러한 방법이 크게 개선된다. 표준 프로토콜의 가난한 해상도를 허용별개의 IRF3 인산화 된 형태의 효율적인 분리를 허용하지 않습니다 단백질. 여기서는 총 및 포스 포 - 항체를 사용하여 면역 블롯과 조합 네이티브-PAGE에 결합 SDS-PAGE를 이용하여 고유 바이러스 활성 IRF3 종의 유도를 모니터링하기 위해 높은 해상도를 얻기 위해 상세 절차를 설명한다. 활성화 된 다른 간의 생체 차별 IRF3 형태의 SDS-PAGE상에서 관찰 그들의 이동성 변화에 기초하여 수행된다. 또한 IRF3 단량체 및 이량 체는 비 변성 전기 영동으로 구별 될 수있다. 면역 이들 두 기법의 상보 결합 IRF3의 인산화 - 매개 활성의 완전한 분석에 필요한 모든 정보를 획득하기위한 저렴하고 민감한 방식으로 증명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">F12/Ham</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td style="width:429px;">Warm in a 37&#176;C bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-PBS</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td>For cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypsin/EDTA 0.25 %</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sendai virus Cantell Strain</td>
			<td style="width:191px;">Charles River Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">600503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Hepes</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">HEP001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">EDTA</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">EDT001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycerol</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">GLY001.1</td>
			<td style="width:429px;">Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7771</td>
			<td style="width:429px;">Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">LEU001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Aprotinin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>APR600.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>159664</td>
			<td style="width:429px;">Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6376&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bio-Rad Protein Assay Reagent&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006&#160;</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 %</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ACR005&#160;</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:191px;">Bioshop</td>
			<td>DEO701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC15320-4&#160;</td>
			<td>Work under fume hood. Toxic and irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SDS001.1&#160;</td>
			<td>Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Amonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td>Toxic and irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td style="width:429px;">Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SHY700&#160;</td>
			<td>Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nitrocellulose membrane (0.45mm)</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetic acid glacial</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ACE222.4</td>
			<td>Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Red ponceau</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911&#160;</td>
			<td>For PBS composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Na2HPO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.5</td>
			<td>For PBS composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662&#160;</td>
			<td>For PBS composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td>For PBS-T-BSA composition for immunoblot.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:191px;">Carnation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Poly sorbate 20 (Tween)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>103168</td>
			<td style="width:429px;">Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-P-Ser386</td>
			<td style="width:191px;">IBL-America</td>
			<td style="width:119px;">18783</td>
			<td>Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-P-Ser396</td>
			<td style="width:191px;">Home made19</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td>
			<td style="width:191px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">4947s</td>
			<td>Store at -20oC.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-P-Ser398</td>
			<td style="width:191px;">Home made15</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF-3-full length</td>
			<td style="width:191px;">Actif motif</td>
			<td style="width:119px;">39033</td>
			<td>Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Anti-IRF3-NES</td>
			<td style="width:191px;">IBL-America</td>
			<td style="width:119px;">18781</td>
			<td>Store aliquoted at -20oC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus</td>
			<td>Perkin-Elmer Life Sciences</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LAS4000mini CCD camera apparatus</td>
			<td style="width:191px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0317</td>
			<td>Store aliquoted at -20oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high resolution method to monitor phosphorylation-dependent activation of irf3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

그림 2는 고해상도 SDS-PAGE에 의해 WCE의 해상도 후 Ser396 및 Ser398에 대한 IRF3 총 항체 및 IRF3 - 포스 포 - 항체 검출 IRF3의 전형적인 면역 이미지를 보여줍니다. 자극되지 않은 A549 세포에서, IRF3은 50 개의 대역과 비 - 인산화 (형태 I)에 대응하는 SDS-PAGE의 53 kDa 이상, 인산화 결정 (II)의 IRF3 종으로서 검출된다. 시간에 따른 변화에 9 시간 결과 천천히 나는를 양식에서 ...

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A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K 조회수.  Université de Montréal. Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

연구

생물학

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

파우더 샘플의 절대 양자 수율 측정

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

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