This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cient&#236;ficas (CSIC).

참고 : 실험 절차는 대학교 Autònoma 마드리드의 연구 윤리위원회의 승인을 스페인과 유럽 지침에 따라 동물 복지 및 보건 대학교 Autònoma 마드리드 헤드의 감독하에 실시 하였다. 마우스는 특정 병원체 무료 (SPF) 하우징에 자란하고 이산화탄소를 사용하여 훈련과 자격을 갖춘 사람 (CO 2) 흡입 방법으로 안락사시켰다. 1. 마우스 뼈 수지상 세포의 분화 및 감염 골수 유래 참고 : 그림 1은 첫 번째 단계를 요약 한 것입니다. 모든 절차 만 멸균 미디어, 악기, 피펫 팁 및 배양 접시를 사용하여,이 시점에서 후드에서 수행되어야한다. <ol><li> 마우스 골수 유래 수지상 차별화 <ol><li> 하나 C57 / BL6 마우스 (22)에서 경골과 대퇴골을 해부하고 RPMI 배지 10 ml의 플라스틱 접시에 전송합니다. </lI&gt; <li> 멸균 가위, 각 골단을 잘라 특성 밝은 붉은 색이 골수를 노출. </li><li> 멸균 페트리에 멸균 주사기를 사용하여 0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염 완충 식염수 10 ㎖ (PBS) (BSA), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (PBS / BSA / EDTA 완충액)로 뼈의 내부 달이다 요리. </li><li> 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 600 XG에 튜브에 세포 현탁액을 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> 암모늄 염화 칼륨 (ACK) 용균 완충액 (0.15 M NH4Cl 등, 10mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA) 1 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 적혈구를 제거하기 위해 RT에서 30 초 동안 배양한다. </li><li> 덩어리는 여과에 의해 제거 되었기 때문에 동일한 속도 (600 XG)에서 원심 분리하기 전에 뼈 조각 세포 덩어리를 제거하기 위해 셀 스트레이너 (70 μm의)을 통하여, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 RPMI 1640 배지 10 ㎖를 첨가하고 필터. </li><li> 셀 개수D RPMI, 10 % FBS (함유 50 μM의 B 머 캅토 에탄올, 1 mM 나트륨 피루 베이트)를 5 × 105 세포 / ml로 조정하고 20 NG / ml의 재조합 쥣과 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (RM-GM-CSF)를 추가 최종 농도. </li><li> CO 2 배양기에서 멸균, 미생물 학적 품질, 15cm 페트리 접시, 문화에 현탁액을 추가 (37 ℃, 5 % CO 2). </li><li> 3 일마다 20 NG / ㎖ RM-GM-CSF를 함유하는 신선한 배지로 세포 밀도 5 × 105 세포 / ml에서 비 - 부착 세포 및 PBS에 5mM의 EDTA와 분리 된 세포와 재현 탁을 모두 스핀 다운. </li></ol></li><li> DC의 항원로드의 성숙 <ol><li> 9 일에, 20 NG / ㎖ RM-GM-CSF를 함유하는 배지에서의 밀도 5 × 105 세포 / ㎖로 세포를 재현 탁. 그런 다음 세포에 높은 MHC-II의 발현을 허용하고 24 시간 동안이 아닌 조직 배양 처리 된 멸균 15cm 페트리 접시에서 배양 20 NG / 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)의 ㎖에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 한 후LPS 자극의 날, 유동 세포 계측법에 의해 수지상 세포의 분화를 확인하기 위해 마우스의 CD11c, MHCII 및 GR-1에 대한 항체와 일부 DC 세포를 얼룩. 수지상 세포의 유세포 분석의 예는도 3a 및도 3b에 도시된다. <ol><li> 샘플 당 50 μl의 PBS / BSA / EDTA 버퍼에 최종 농도 2.5 ㎍ / ㎖의에서 항 - 마우스-CD16 / CD32 단클론 항체와 DC가 (5 × 10 5 세포 / 샘플)을 품어. 그 후, MHCII (IA / IE)에 대한 항체의 50 μl를 추가하는 CD11c 1에서 서로 다른 형광 색소와 결합 GR-1 : 100, 1 : 200, 1 : 각각 PBS / BSA / EDTA 버퍼 (500). </li><li> 마지막으로, PBS / BSA / EDTA 버퍼와 DC가 씻어 제조 업체의 프로토콜에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분석한다. 참고 : 세포가 잘 분화 된 경우, 세포는 항원 로딩을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 워시 RPMI와 DC가 10 % (항생제없이) FBS, 10 μg의 / ㎖ OTII OVAp (OVA 323-339으로 그들을 품어; ISQA37 ºC에서 최소 1 시간 동안 5 × 106 수지상 RMPI 당 10 % FBS 배지 1 ㎖에 플라스틱 튜브 VHAAHAEINEAGR). 음성 대조군으로, OVAp으로 배양하지 않고 DC가 둡니다. </li></ol></li><li> 수지상 세포의 감염 <ol><li> CO 2 인큐베이터에서 1 시간 동안 10 세균 (박테리아 DC 당 10)의 감염 다중도 (MOI)에서 DC의 감염 (37 ° C, 5 % CO 2). </li><li> 워시 DC 세포는 세포 외 박테리아의 대부분을 세척하기 위해 RMPI 10 % FBS 450 XG에 원심 분리기에 PBS와 1 배에서 3 배. 마지막으로, 20 × 106 세포 / ml에서 (항생 물질없이) RMPI 10 % FBS 배지에서 세포를 재현 탁. </li></ol></li></ol> OTII 형질 전환 마우스에서 CD4 + T 림프구의 2. 분리 참고 : 그림 1은이 두 번째 단계를 요약 한 것입니다. 림프절은 대신 CD4 + T 세포를 분리하는 비장의 표기 림프절에서의 CD4 + 림프구 비율 때문에S (~ 50 %), 비장 (~ 25 %) 때문에, 정제가 더 효과적 일 것보다 크다. <ol><li> 림프절의 단일 세포 현탁액을 확인 <ol><li> OTII 형질 전환 마우스에서 23 노드 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부 및 장간막 림프절을 제거하고 RPMI 10 % FBS 배지 10 ml의 플라스틱 접시에 전송합니다. </li><li> 두 프로스트 현미경 슬라이드를 사용하여 멸균 후드 아래 갈기 림프절. 한 현미경 슬라이드의 프로스트 측에 림프절을 배치하고 장기 지상 될 때까지 두 번째 슬라이드의 프로스트면 문질러. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼에 단일 세포 현탁액을 씻으십시오. </li><li> 셀 스트레이너 (70 μm의)가 결합 조직을 제거하고 PBS / BSA / EDTA 버퍼로 씻어 불구하고 세포를 필터링합니다. </li><li> ACK 용해 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁하고, 적혈구를 제거하기 위해 RT에서 1 분 동안 배양한다. </li></ol></li><li> CD4 + T 세포의 분리 <ol><li> 단계 2.1.3 카운트로 다시 세척세포를 PBS / BSA / EDTA 완충액에서 100 × 106 세포 / ml로 재현 탁 그들을한다. 1 CD8, IgM의, B220, CD19, MHC 클래스 II (I-AB), CD11b를, 중 CD11c 및 DX5에 비오틴 항체를 추가 : (250)을 30 분 동안 얼음에 CD4 + T 세포의 이상 음의 선택에. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼에 세포를 씻고 얼음에 15 분 동안 제조 업체의 프로토콜에서 권장하는 농도에서 스트렙 타비 딘 마이크로 비드와 세포 (100 × 10 6 세포 / ml)을 품어. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼에 세포를 씻으와 CD4 + T 세포 분리하기 전에 셀 스트레이너 (30 μm의) 비록을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라, 자기 세포 분리 장치를 사용하여 음성 선별하여 CD4 + T 세포를 분리. </li><li> 세포를 세어 (항생 물질없이), 10 % FBS RPMI 배지 4 × 106 세포 / ml로 조정한다. </li><li> 수정 및 유동에 의해 순도를 확인하는 얼음 절연 CD4 + T 세포 (3 × 105 세포)에 유지같은 사이토 (24)을 설명했다. CD4 + T 세포를 정제의 예는도 3C에 도시되어있다. </li></ol></li></ol> 3. T 세포 Transinfection 측정 겐타 마이신 보호 분석에 의한 참고 : 그림 2는 프로토콜의 세 번째 단계를 요약 한 것입니다. <ol><li> T 세포 Transinfection <ol><li> 감염된 DC 세포 (1 : 1)과 함께 격리 CD4 + T 세포를 부화 CO2 인큐베이터 (37 ° C에서 면역 시냅스 형성을 허용하도록 30 분 동안 (DC에서 1 시간 동안 감염 제거하기 위해 세척 한 후 무료 박테리아), 5 % CO 2). </li><li> 추가 절연 CD4 + T 세포 (2 × 106 세포) 및 24 웰 배양 접시에 감염된 수지상 세포 (2 × 106 세포)를 0.1 mL의 0.5 mL의. 음성 대조군으로서, 30 분 동안 10 박테리아의 MOI에서 직접 0.5ml를 CD4 + T 세포를 감염. </li><li> 사용하여 T 세포에서 감염 DC가 분리 추가 컨트롤을 포함DC-T 물리적 접촉을 방해 (공경이 3 μm)와 폴리 카보네이트 트랜스 웰 배리어. 잘 (24 웰 플레이트)의 하부 구획으로 0.1 트랜스 웰 내부의 DC ㎖의 CD4 + T 세포의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 마지막으로, RMPI 매체를 갖춘 모든 샘플에서 동일한 볼륨을 만들기 위해 각 웰에 0.6 ml의가있을 때까지. </li><li> 면역 시냅스 형성의 30 분 후, 겐타 마이신 100 ㎍ / ㎖의 추가 및 CO 2 인큐베이터에서 세포를 수집하기 전에 1 시간 동안 배양 (37 ℃, 5 % CO 2). </li></ol></li><li> 다시 격리 CD4 + T 세포의 <ol><li> 비 부착 세포를 수집하고 PBS / BSA / EDTA 버퍼를 재현 탁. DC가 대부분의 플라스틱 배양 접시에 부착 된 상태로 유지. 소용돌이 튜브는 부드럽게 세포 세분화을 보장합니다. 겐타 마이신이 잘 작동 것을 보여 제어와 같은 세포 상층 액 500 μl를 유지합니다. </li><li> 단계 2.2에서와 같이 수지상 세포 및 T 세포를 포함하는 샘플로부터 CD4 + T 세포를 다시 분리, DC가 있지만 대부분은 접시에 부착해야합니다. 얼음에 제어 샘플을 보관하십시오. 계정에 2 % 미만 오염 만 실험을 가져 가라. transinfection 후 CD4 + T 세포를 정제의 예는도 3D에 도시된다. </li></ol></li><li> 를 Lyse T 세포와 박테리아 중간 한천 플레이트에 그들을 씨앗. <ol><li> PBS로 두 번 CD4 + T 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포를 세어 PBS에서 2 × 106 세포 / ml로 재현 탁 그들을. </li><li> T 세포의 세포 밖으로 방출 박테리아, 1 × 106 세포 / ml에서 그들을 용해시키기 위해 T 세포를 500 ㎕의 0.1 % 트리톤 X-100 500 ㎕를 추가하기. </li><li> 용해 세포의 3 연속 진수 희석을 확인하고 박테리아 매체 한천 플레이트에 각 희석의 50 μl를 시드. 4 부분으로 판을 나누고 각 부분에 용해 세포의 다른 희석 씨앗. 대표적인 결과를도 4에 나타낸다. <ol><li> 대조군으로서, 또한 판형그 겐타 마이신을 보장하기 위해 한천의 접합체의 저장 세포 상층 액을 잘 근무하고있다. 또한 추가 제어로 감염된 DC의 플레이트. 경우 낮은 DC가 오염 (&lt;2 %), 낮은 DC 오염에 대응하는 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 빼기 발생합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 정량 유동 세포 계측법에 의한 T 세포 Transinfection의 참고 : 그림 2는이 단계를 요약 한 것입니다. <ol><li> T 세포 Transinfection <ol><li> 단계 1.3에서와 같이 BMDCs 감염,하지만이 경우 GFP 표현 박테리아를 사용합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 37에서 30 분 동안 세포 추적기 클로로 aminocoumarin (CMAC)와 (단계 2.2에서 림프절에서 격리) 얼룩 CD4 + T 세포 ºC. </li><li> 두 번 (항생제없이) RMPI 10 % FBS으로 표시 CD4 + T 세포를 씻으십시오. </li><li> 감염된 수지상 세포를 품어 표시 CD4 +와 (박테리아와 1 시간 배양 후)30 분 동안 T 세포 단계 3.1.1에서 설명하는 모든 컨트롤을 포함하여 37 ºC에서 면역 시냅스 형성을 허용합니다. </li></ol></li><li> 감염된 CD4 + T 세포의 염색 <ol><li> DC-T 면역 시냅스 형성의 30 분 후, 세포를 수집하고 PBS / BSA / EDTA에 씻어. </li><li> PBS / BSA / EDTA 버퍼, 부드럽게 튜브를 텍싱하여 별도의 집계 세포와 두 세척 후. </li><li> 0.2 ㎖ / PBS 실온에서 15 분 동안 3 % 함유의 PFA 튜브에 샘플을 고정한다. 그런 다음 PBS로 씻어. </li><li> 수지상 세포 된 Fc 수용체를 차단하는 얼음에 15 분 동안 PBS / BSA / EDTA 50 μL / 샘플에서 항 - 마우스 CD16 / CD32 모노클로 날 항체 (2.5 μg의 / ml)로 배양한다. </li><li> 세포 외 박테리아를 얼룩 얼음에 30 분 동안 50 μL / PBS / BSA / EDTA의 샘플에서 항균 항체 (최종 농도 10 μg의 / ㎖) 토끼를 추가합니다. </li><li> PBS / BSA는 / EDTA로 세포를 씻으 및 피코 에리 트린 (PE)가 결합 마우스의 CD11c에 대한 항체 및 그 자체로 품어토끼에 대한 condary 항체는 1 알렉사 - 형석 647과 같은 다른 형광 색소가 결합 : 얼음에 30 분 동안 PBS / BSA / EDTA의 200 μL 100 / 샘플. </li><li> 세포를 세척하고 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 비 - 형광성 박테리아에게 샘플들을 보상 및 설정 (25) 유동 세포 계측법을 조정 실험에 사용 된 각각의 형광 색소로 표지 한 음성 대조군 샘플을 사용 transinfected T 세포의 시료를 포함하는 것을 잊지 마십시오. 대표 분석은 그림 5에 표시됩니다. 참고 : 박테리아가 GFP를 표현하지 않는 경우, 5 분 동안 PBS에 0.​​5 %에서 트리톤 X-100 샘플을, 세포 내와 세포 외 박테리아, 라벨 외 박테리아를 구별 수정 및 Permeabilize 하시려면 할 수 있습니다. 그 후 다른 형광 색소와 총 박테리아 (세포 + 세포)를 얼룩. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response.">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).</li><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (1989).</li><li>Pancer, Z., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+adaptive+immunity.">The evolution of adaptive immunity.</a> Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).</li><li>Rhoades, R. A., Bell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medical Phisiology. , (2012).</li><li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Invasion:+The+Paradigms+of+Enteroinvasive+Pathogens.">Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens.</a> Science. 304 (5668), 242-248 (2004).</li><li>Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+and+recognition+in+bacterial+infections.">Antigen presentation and recognition in bacterial infections.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Adhesion+and+Entry+into+Host+Cells.">Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells.</a> Cell. 124 (4), 715-727 (2006).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).</li><li>Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+clathrin+drives+actin+accumulation+at+the+immunological+synapse.">Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse.</a> Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).</li><li>Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+bone+marrow-derived+dendritic+cells+and+macrophages+to+productive+infection+with+Listeria+monocytogenes.">Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes.</a> Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).</li><li>Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-SIGN,+a+dendritic+cell-specific+HIV-1-binding+protein+that+enhances+trans-infection+of+T+cells.">DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.</a> Cell. 100 (5), 587-597 (2000).</li><li>Izquierdo-Useros, N., Naranjo-G&#242;mez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+mature+dendritic+cells:+Trojan+exosomes+riding+the+Trojan+horse.">HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse.</a> PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).</li><li>Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+communication:+diverse+structures+for+exchange+of+genetic+information.">Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information.</a> Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).</li><li>McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+serve+as+a+reservoir+for+Listeria+monocytogenes+growth+during+infection+of+mice.">Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).</li><li>Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+impairs+T+lymphocyte+dynamics+in+vivo.">Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).</li><li>Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+kill+bacteria+captured+by+transinfection+from+dendritic+cells+and+confer+protection+in+mice.">T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice.</a> Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).</li><li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging.">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).</li><li>Inaba, K., Inaba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li><li>Th&#246;ne, F., Schwanh&#228;usser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-isolation+of+Salmonella-infected+cells+with+defined+bacterial+load+from+mouse+spleen.">FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current protocols in immunology. , Unit 14.1 (2008).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+na&#239;ve+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of na&#239;ve CD4 T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li><li>Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+operation+of+a+flow+cytometric+immunophenotyping+laboratory.">Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory.</a> Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).</li><li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node.">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

T 세포 또는 T 림프구는 적응성 면역 반응 (26)에 세포 성 면역에 중요한 역할을 담당하고 속하는 백혈구 유형이다. T 세포는 시험 관내에서 감염에 반응하지만 일부 리포트들은 생체 14,15에 감염 될 수 있다는 것을 나타낸다. 면역 시냅스 동안 APC와 T 세포의 친밀한 접촉은 HIV (11)와 같은 일부 바이러스를 포함하는 생체 재료 (13)를 교환하기위한 플랫폼 ...

병원균은 숙주를 감염 할 때, 일반적으로 세균 통관에 필요한 타고난 및 적응 면역 반응의 활성화가있다. 선천성 면역은 대부분의 감염을 방지 방어의 첫 번째 줄입니다. 선천성 면역은 미생물의 다양한 그룹들 사이에서 보존되는 정확한 방법 요소 (병원체 관련 분자 패턴, PAMPS) 1 구분합니다. 선천성 면역 메카니즘 식세포 (대 식세포, 호중구 및 수지상 세포), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및 천연 킬러 세포를 포함 실제 피부와 같은 장벽 화학 장벽 (항균 펩티드 리소자임) 및 선천적 백혈구를 포함 2. 이 세포는 접촉을 통해 또는 병원체 덮어 및 살해를 포함 식균 작용을 통해 그들을 공격하여 하나 확인하고 병원균을 제거한다. 이 시스템은 P에 대한 면역 학적 기억을 부여 적응 면역, 대조적으로, 평생 방어를 허용하지 않습니다athogens. 적응 면역 시스템은 방어의 두 번째 라인 및 인식하고 여러 미생물 및 비 미생물 물질 3의 특정 항원에 반응 할 수있다. 적응 면역 시스템의 주요 구성 요소는 B 및 T 세포 림프구를 포함이다. B 세포는 병원체 또는 외래 단백질에 대한 항체를 분비, 체액 성 반응에 관여한다. 그러나, T 세포의 사이토 카인 분비 또는 죽이는 병원체에 감염된 세포를 4 면역 반응을 조절, 세포 성 면역을 나타낸다. 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 5-7에 의해 세포 표면에 제시되는 항원에 탐식 병원균 세균성 및 공정 요소를 인식 할 수있는 수상 세포 또는 대 식세포, 선천 면역의 성분을 포함하여 항원 제시 세포 (APC를). 장갑차가 병원균을 phagocytized 한 후, 그들은 일반적으로 그들이 T와 상호 작용 배수 림프절로 이동세포. T 림프구는 T 세포 수용체에 의해 특정 MHC 펩티드 복합체를 인식 할 수있다. 면역 시냅스 (IS) 항원 제시 8,9 동안 항원 - 로딩 APC 및 림프구 사이의 인터페이스에서 발생한다. 일부 박테리아는 식균 작용을 생존과 장갑차 내에서 체계적으로 보급 할 수 있습니다. 이보기에서 감염된 장갑차는 세균 저수지 또는 세균 확산 (10)를 용이하게 &quot;트로이 목마&quot;의 역할을한다. 장갑차 및 IS 형성 도중에 일어난다 림프구 사이의 긴밀한 접촉은 또한 막, 유전 물질 및 엑소 좀의 일부의 교환을위한 플랫폼으로 기능과 T 세포를 감염시킬 수있는 어떤 바이러스 탈취 할 수있다; 이 과정은 transinfection 11 ~ 13이라고합니다. 일부 병원성 세균 (리스테리아, 살모넬라 엔테과 시겔의 flexneri)은 생체 내에서 T 림프구를 침공과 행동 14-16을 수정할 수 있습니다. 우리는 가지고있다최근 T 림프구는 항원 제시 16의 과정 이전에 감염된 수지상 세포로부터 transinfection 의해 박테리아를 캡처 할 수있는 것을 설명했다. T 세포의 직접 감염보다 (1,000-4,000x) 대단히 더 효과적 transinfection에 의해 세균 캡처. 보다 transinfection 나타내는 T 세포 캡처 병원체 및 비 병원균 박테리아는 T 세포에 의해 구동되는 프로세스이다. 놀랍게도, 세포는 빠르게 캡처 박테리아를 죽이고 전문 식세포 (16)보다 그렇게 더 효율적으로 한 T (가슴) transinfected. 면역학 도그마 휴식이 결과, 적응 면역 세포는 선천성 면역의 가정 배타적이었다 기능을 수행 할 수 있음을 보여준다. 또, 유방 세포 염증성 사이토 카인의 다량 분비 및 생체 내에서 세균 감염으로부터 보호하는 것으로 나타났다. 여기에서 우리는에 세균 transinfection 과정을 연구하는 데 사용되는 다른 프로토콜을 제시마우스 모델. 이 모델은 박테리아에 감염된 뼈 구체적 I-Ab의 상호 작용 (17)의 맥락에서 OVA (OVAp)의 펩티드 3백23부터 3백39까지 대한 TCR의 특정 베어 OTII 트랜스 제닉 마우스에서 CD4 + T 세포의 사용에 기초한다 marrow- 안정적인 면역 시냅스를 형성 OVAp로드 유래 수지상 세포 (BMDCs) 18, 19,. T 세포 transinfection 시각화 및 형광 현미경을 사용하여 추적 될 수있다. 또한, 유동 세포 계측법, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 박테리아 16, 20에 의해 방출 된 형광을 이용하여 감염된 세포를 검출하기 위해 사용될 수있다. 또한, T 세포는 transinfection 더 민감한 방법, 이벤트의 다수의 측정이 가능 젠타 생존 분석으로 정량 할 수있다. 겐타 마이신은 진핵 세포에 침투 할 수 없습니다 항생제이다. 따라서,이 항생제를 사용하는 것은 항생제 첨가 FR 살아남은 세포 내 박테리아의 분화를 허용(21) 사망했다 톰 외 것.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RPMI</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3025501</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">r-GMCSF</td>
			<td style="width:131px;">Peprotech</td>
			<td style="width:104px;">315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LPS</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">L2630-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3023901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">2-ME</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">OVAp OTII (323&#8211;339)</td>
			<td style="width:131px;">GenScript</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cell Strainer 70uM</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;30uM Syringe Filcons Sterile</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">340598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">AutoMacs Classic</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-088-887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:131px;">Normon</td>
			<td style="width:104px;">624601.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Transwell</td>
			<td style="width:131px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LB</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:341px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD8 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">IgM Biot</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td style="width:104px;">Clone RMM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">B220 Biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD19 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MHC-II Biot (I-A/I-E)</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11b biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td style="width:104px;">11BB-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11c biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td>11CB3-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DX5 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gr-1 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD16/CD32</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td>M16PU-05MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">anti Salmonella</td>
			<td style="width:131px;">ABD Serotec</td>
			<td style="width:104px;">8209-4006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11cPE</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:131px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">20-0041-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gr-1 APC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-II (I-A/I-E) FITC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)</td>
			<td style="width:131px;">Life technologies</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Streptavidin MicroBeads</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t cells capture bacteria by transinfection from dendritic cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

유동 세포 계측법 및 겐타 마이신 생존 분석 그림 1은 세포를 획득하는 절차를 요약 한 것입니다. 여기에서 우리는 감염된 골수 유래-DC가 어떻게 두 개의 서로 다른 접근 방식을 통해 박테리아 transinfection을 측정하는 방법에서 쥐의 T 세포 박테리아 transinfection을 수행하는 방법을 설명했다. 수지상 9 일간 GM-CSF와 골수 세포를 배양하여 생성된다. 그리고 DCS는 OVA...

Watch this Scientific Journal Video about T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells at JoVE.com

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

여기 프로토콜은 사전에 감염된 수지상 세포 (DC)에서 transinfection 통해 항원 제시 동안 발생하는 CD4 + T 세포에 의해 세균 캡처를 측정하기 위해 제공됩니다. 일차 전지, DC, DC / T 세포 복합체 형성의 감염, 박테리아 T 세포 형질의 측정의 분리 : 우리는 필요한 단계를 수행하는 방법을 보여줍니다.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

t-cells-capture-bacteria-by-transinfection-from-dendritic-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K 조회수.  Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC).  여기 프로토콜은 사전에 감염된 수지상 세포 (DC)에서 transinfection 통해 항원 제시 동안 발생하는 CD4 + T 세포에 의해 세균 캡처를 측정하기 위해 제공됩니다. 일차 전지, DC, DC / T 세포 복합체 형성의 감염, 박테리아 T 세포 형질의 측정의 분리 : 우리는 필요한 단계를 수행하는 방법을 보여줍니다. 

비디오: T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

에 셀 운명을 따라