저자는 친절 물고기 설비 및 라인의 우수한 케어 Zebrabow-M 유전자 변형 라인, pDEST 벡터에 대한 제프리 번스와 르네 이티 - Daigle 공유를위한 알렉스 Schier 감사합니다. 자금 조달 : 우리는 어린이를위한 이너스 병원에서 어린이 (ECL) 및 박사후 연수 장학금에 대한 NIDCR RO3DE024490와 슈라 이너스 병원에서 관대 한 자금 지원 (LR 및 YK)에 대해 감사하고 있습니다.

매사 추세 츠 종합 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 프로토콜 번호 # 2010N000106에서 모든 절차를 승인했다. 이 평가 및 실험 동물 관리 국제 (AAALAC) 가이드 라인의 인증 협회을 준수합니다. 1. 시약 및 재료 준비 <ol><li> E3 배아 50X 배지 1 L을 제조 (표 2 참조) (표 1 참조)과 1X E3 배아 배지 1 L를 준비한다. </li><li> 1X E3의 1 L에 PTU 30mg을 첨가하여 N-페닐 티오 (PTU)와 E3 배아 매체를 준비한다. 저어 O / N은 ​​PTU가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> , 프로 나아 제 용액을 제조 1X E3 15 ml의 프로 나제​​ (0.5 ㎎ / ㎖) 150 ㎕의 희석. 이 금액은 1 페트리 접시에 충분하다. 즉시 사용합니다. </li><li> 메틸 셀룰로오스 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 25 ml의 0.2 % tricaine 75 ml를 혼합하여 E3-tricaine 솔루션을 준비1X E3의. E3-tricaine 용액의 75 mL에 메틸 셀룰로오스의 3g을 끓인다. </li><li> E3-tricaine 솔루션 100ml로 최종 볼륨을 확인합니다. 최종 메틸 셀룰로오스 용액은 황색 색조와 점성과 불투명하다. 저장 : RT 빛으로부터 보호. </li></ol></li><li> 타목시펜 재고 및 유도 솔루션 <ol><li> 4- hydroxytamoxifen 100 % 에탄올에 용해시켜 5 mM의에게 타목시펜 스톡 용액을 제조 하였다. -80 ° C에서 보관 재고. </li><li> 유도 용액을 얻었다 1X E3에서 소망 농도 타목시펜의 신선한 희석을 준비한다. 주의! 사용하기 전에 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 표 3에 따라 0.2 % tricaine의 1 리터를 준비합니다. </li><li> 공 초점 슬라이드를 얻습니다. 블록을 형성하기 위해 함께 네 개의 커브 글라스 (18 X 18) 접착제 다음 중간에 배아 장착 할 수 있도록 2cm 간격 24 X 60 커브 글라스에 2 블록을 배치합니다. </li></ol> 2. 배아 준비 <ol><li> 형질 전환 라인. <br/&gt; 참고 : Zebrabow-M은 알렉스 Schier의 실험실에서 관대 한 선물이었다. </li><li> sox10 : ERT2-Cre 호텔 참고 : 표준 분자 클로닝 방법을 사용하여 ERT2-Cre 호텔과 상용 기술을 복제 재결합을 얻을 : 대상 벡터 pDestTol2- sox10를 생성합니다. <ol><li> 렌즈 목적지와 LR 반응에 진입 클론 (pENTR3&#39; - 폴리 -A) 겸용 5 &#39;sox10 프로모터의 7.2Kb, 게이트웨이 중간 클론 (PME-ERT2-Cre 호텔)와 (3)을 포함하는 항목 클론 (pENTR5&#39;- sox10p)&#39; 벡터 pDestTol2-의 α-crystallin을 : YFP. </li><li> 구조를 정화 pDestTol2- sox10 : ERT2-Cre 호텔을. 하나의 셀 단계에서 WT 배아 (F0)에 TOL2의 트랜스 mRNA의 (50 NG / μL)와 정제 된 구조 (100 NG / μL)를 공동 주입. </li><li> 세균 온라인 전송을위한 화면 F0 성인 설립자 F1 배아 강한 노란색 형광을 기반으로. </li></ol></li><li> sox10 : ERT2-Cre 호텔, Zebrabow-M <ol><li> Zebrabow-M을 교배ERT2-Cre 호텔 형질 전환 라인 : sox10와 라인 (2.1.1). </li><li> 강한 유비쿼터스 RFP 발현과 YFP 렌즈 마커와 성인까지 그들을 성장을 보이는 선택 배아. </li></ol></li></ol> 3. 배아 컬렉션 <ol><li> sox10의 여러 쌍을 설정 : ERT2-Cre 호텔을, Zebrabow-M 형질 전환 제브라 피쉬를 오후 5시와 1 일 오후 6시 사이. </li><li> 다음 날, 아침에 디바이더를 당겨 정오 경 계란을 수집합니다. </li><li> 요리를 페트리와 배아를 d​​echorionate하는 프로 나제​​ 용액 15ml를 추가로 전송. </li><li> 배아의 약 60 %가 dechorionated 때까지 1 분 5의 배아를 품어. 프로 나제​​ 솔루션을 경사하여 반응을 중지하고 신선한 E3 매체와 태아에게 3 ~ 4 회 반복한다. </li><li> RT O / N에서 E3에서 dechorionated 배아를 품어하고는 10 somites 단계에 도달하기 위해 개발 할 수 있습니다. 다른 발달 성장을 방지하기 위해 클러치 당 50 ~ 60 배아를 품어. </li></OL&gt; 4. 치료 <ol><li> 그들은 10 somites의 단계에 보장하기 위해 빛 필드 현미경으로 배아 &#39;발달 단계를 확인합니다. </li><li> 적색 형광 단백질 (RFP) 필터와 형광 현미경을 사용하여 밝은 빨간색 배아를 분리. </li><li> 페트리 접시에 hydroxytamoxifen 용액 10 μm의를 추가하고 3 시간 동안 28.5 ° C에서 분리 된 배아를 배양하여 Cre 호텔 - 재결합의 유도로 넘어갑니다. </li><li> 타목시펜 솔루션을 가만히 따르다 및 E3와 배아를 여러 번 씻는다. 주의! 특별한 생물학적 폐기물 용기에 타목시펜 솔루션을 폐기합니다. </li><li> 28.5 ° CO / N에서 배아를 품어. </li><li> 배아는 약 28 ~ 29 somites 단계 (24 시간 약 게시물 수정) 때, E3-PTU 솔루션 이하에서 28.5 ° C에서 배아를 배양한다. 참고 : PTU가 여기에 개발 배아에 melanophores의 형성을 억제하는 데 사용됩니다. 이 치료는 할 필요가자동 형광 melanophores 의한 형광의 신호 왜곡을 피하기. </li><li> 28.5 ° C에서 배아를 품어 </li></ol> 5. 배아 선택 <ol><li> 완전히 개발 된 두개 안면 구조를 시각화하기 위해, 레드 신호와 Cre 호텔 표현 마커 양성 (망막 노란색)의 강도 4 일 후 수정의 배아를 선택합니다. </li><li> E3 / 0.015 %의 tricaine 솔루션 배아를 마취. 부드럽게 배아를 괴롭히는 경우 활성 운동 또는 지느러미 활동이 관찰되지 않을 때 마취가 확인된다. </li></ol> 6. 프로필 메틸 셀룰로오스에서 배아를 장착 <ol><li> 메틸 방울을 함유하는 페트리 접시에 이미징 선택된 배아를 전송하고 부드럽게 메틸 셀룰로스와 배아 방부. </li><li> 깨끗한 공 초점 슬라이드에서 신선한 메틸 한 방울을 배치하고 microloader 팁을 사용하여 드롭 내에서 배아를 탑재합니다. 위치 배아는 등쪽으로 만지지 않도록주의를 복용직접 배아. </li><li> 25 × 25 커버 슬립으로 장착 배아를 커버하고, 필요한 경우 커버 슬립을 조작함으로써 태아의 위치를​​ 조정한다. </li><li> 배아는 이제 이미지에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 형광 현미경으로 7. 분석 <ol><li> 배아를 초점을 맞추기 위해, 20 배 건조 렌즈 목표 (핀홀 크기 2.0 μm의 개구 수 0.75)를 사용합니다. </li><li> 현미경에 L100 버튼을 눌러 소프트웨어의 채널을 선택합니다. </li><li> 공 초점 설정 버튼을 선택하고 &#39;자동&#39;을 클릭하고 창을 닫기 전에 다음과 같은 채널을 선택 : 채널 1 : CFP, 채널 2 : GFP, CH3 : RFP 또는 mCherry을 </li><li> &#39;연동을 제거&#39;버튼을 클릭하기 전에 채널 2와 CH3의 전원을 켭니다. 스캔을 시작하는 &#39;놀이&#39;를 클릭하십시오. </li><li> 원하는 화질 AC 때까지 가장 ½ 프레임 / 초 고전압 (HV) (150)로 시작하고 따라서 설정을 조정함으로써 행해진 다 관심 구조에 초점hieved. RFP 따라서 HV를 조정, 다른 색상보다 밝은 것입니다. YFP 및 RFP 양성 세포를 모두 찾을 수있는 Z 위치를 변경합니다. </li><li> 설정으로 설정하면, 당신의 배의 이미지를 캡처합니다. 각 분할 채널에서 이미지 처리를 위해 공 촛점 이미징 소프트웨어 형식 및 TIFF 형식으로 사진을 저장합니다. </li><li> 다음으로, CFP 이미징, 채널 2와 CH3를 끄고 채널 1의 전원을 켭니다. 초점 영역을 변경하지 않고, 단계 5와 설정을 다시 조정한다. 참고 : CFP 인해 핀홀 크기를 조정하여 회피 할 수있다 파랑 채널에서 배경 신호를 감지하기 정말 어려울 수 있습니다. 큰 핀홀 크기는 신호 / 배경 잡음 비를 감소시켜보다 효율적으로 형광을 검출 할 수있게한다. 그러나, 큰 핀홀 이미지 품질 저하, 공 초점 효과를 감소시킬 것이다. 따라서, 설정 조절은 조심 원하는 이미지의 품질 및 강도를 달성하기 위해 요구된다. </li><li> 이미지를 캡처 (모두 형식으로 공 초점 소프트웨어와 T를 저장이미지 처리를위한 IFF). 이미지는 다음 레이어를 병합하고 8 팬과 동료들에 의해 설명 된 바와 같이 색 설정을 개선하기 위해 공통의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다. </li></ol>

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	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

위에서 서로를 보완 설명으로 알 시안 블루와 photoconvertible 형질 전환 라인은 연골과 뼈 개발의 복잡한 프로세스를 정의 할 수 있습니다. 그러나, 기관 형성기 동안 라이브 세포의 이동과 조직은 오랫동안 가정 간접적으로 증명하지만 시각 적이있다. 연골 특정 Cre 호텔과 함께 Zebrabow-M 형질 전환 라인은 뼈와 연골 형성에 관여하는 모든 별개의 이벤트를 동시에 실시간 관찰을 허용합니다. 이 기술?...

두개 안면 개발은 세포 증식, 이동 및 분화, 2, 3를 구동하는 복잡한 분자, 세포 및 조직의 상호 작용을 필요로한다. 이 엄격하게 규제하고 복잡한 과정은 두개 안면 기형이 가장 흔한 선천성 기형 1-9의 사이 있도록 유전과 환경 교란에 될 수 있습니다. 수술 개입이 개발 기초를 이해, 두개 안면 기형 치료의 의지가 남아 있지만 미래의 치료를 혁신하는 것이 필수적이다. 따라서, 통합 및 확장과 세포 통합의 형태 형성과 메커니즘을 연구하는 것은 두개 안면 골격 (1)의 형성에 새로운 통찰력을 제공합니다. 두개골 신경 크레스트 마이그레이션 및 첫 번째 인두 아치 하악을 prefigures 멕켈의 연골을 형성 확장, 다음 짝을 형성 하악 프로세스를 채 웁니다. 형태 형성 오멕켈의 연골 f를 방향 증식, 세포 편광과 차별화 1,10 통해 연골 세포 조직을 필요로한다. 그러나, 멕켈의 연골의 성장과 확장에 연골 세포 조직의 복잡함은 확실하지 않다. 동적 세포의 행동을 이해하는 것은 이러한 형성 부전 하악 표현형 (11) 하악의 크기에 영향을 미치는 선천성 기형을 이해하는 것이 중요합니다. Zebrafish의 배아는 멕켈의 연골 형태 형성의 자세한 연구를위한 많은 발달과 유전 적 장점을 제공한다. 유전 취급 용이성, 투명성, 생체 및 급속한 발전은 라이브 영상 6 세포의 이동과 조직의 관찰 잘 빌려주는 강력한 장점이다. 같은 sox10 같은 혈통-추적 도구 사용 : 카에데 형질 전환 라인을, 우리와 다른 배아 두개 안면 골격 1.5의 신경 크레스트 기원을 묘사했다. USIUBI와 ERT2-Cre 호텔 : sox10을 겨 Zebrabow-M 유전자 변형 라인은 두개 안면 개발 과정에서 세포 운동의 세부 사항을 탐험 할 수있게되었습니다. Zebrabow-M은, 서로 다른 형광 물질의 발현을 구동 유비퀴틴 프로모터의 LOX 사이트 (8)에 의해 각각 측면으로 설계된 트랜스 제닉 라인이다. Zebrabow-M의 기본 형광이 RFP를 표현, 빨간색입니다. Cre 호텔의 발현 유도 후, Zebrabow-M은 재결합을 구성하고 세포는 배아에서 멀티 스펙트럼 표현을 생성하는 다른 형광체 (RFP, CFP와 YFP)의 조합을 표현한다. 다른 병치 된 전구 세포에서 유래하는 세포 집단이 클론 적 표시되도록 재조합 이벤트 이후의 표지 세포 분열 모든 딸 세포를 클론 적, 표시되어 있습니다. 이 복제 셀 라벨에 의해, 클론 해상도와 세포 증식 및 마이그레이션 (그림 1, 2) 다음에 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Pronase</td><td>Roche Life Sciences</td><td>10165921001</td><td>Prepare 500 &amp;mu;l stock aliquots at 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-Phenylthiourea)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7619</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>4-HydoxyTamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T176</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>25 x 25 coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540C</td><td></td></tr><tr><td>pENTR5&#039;-TOPO TA Cloning Kit</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>K591-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR3&#039;-pA</td><td>Tol2Kit</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>pDEST</td><td></td><td></td><td>Gift from Geoffrey Burns labs</td></tr><tr><td>Bright field microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image processing software</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

척추 동물의 두개 안면 구조의 개발은 세포 이동, 확산, 접착 및 분화의 정확한 조정이 필요합니다. 멕켈의 연골, 제 인두 아치 유도체의 패터닝은 두개골 신경 크레스트 (CNC) 세포의 이동과 진보적 인 분할, 증식 및 분화 된 연골 세포의 조직을 포함한다. 몇몇 연구는 아래턱 형태 발생 동안 CNC 마이그레이션을 설명했지만,이 연골 세포의 연골 멕켈의 성장 및 확대에 조직을 실현하는 방법의 상세는 불분명. sox10은 제한 및 화학적으로 유도 Cre 호텔 재조합 효소 - 중재 재조합하여 별개의 클론 인구를 반영 전구 세포 및 그들의 자손의 멀티 스펙트럼 라벨을 만드는, 독특한 형광 단백질 (RFP, YFP와 CFP)의 순열을 생성합니다. 공 촛점 시간 경과 사진을 사용하면, 연골 세포를 관찰 할 수있다 behavi또는 제브라 피쉬 멕켈의 연골의 개발 과정. 멀티 스펙트럼 셀 라벨은 멕켈의 연골 세포의 확장을 보여 과학자 수 있습니다. 하악을 prefigures 멕켈의 연골의 확장 단계에서 연골 세포들은 조직 단일 셀 계층 행에 스택으로 확장에 영향을하는 층간 삽입. 세포 확장을 중재하기 위해이 조직 인터 프로세스의 실패는 우리가 하악 기형에서 관찰 형성 부전 하악의 세포 기계적인 설명을 제공합니다.

전체 마운트 알 시안 블루 얼룩에 의해 전통적인 연골 시각화 개발 멕켈의 연골을 관찰하고 일반적으로 최종 세포 조직 (12) (그림 1A)를 시각화하는 데 사용에 귀중한하고있다. 더 혈통은 sox10를 사용하여 추적, 초과 근무 개발 연골 세포를 분석하기 : 카에데 유전자 변형 라인 라이브 배아 2,12 (그림 1B)에 세포 이동, 통합 및 확장을 연구 수있?...

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서 영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.0K 조회수.  Harvard Medical School.  두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서 영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다. 

비디오: Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel’s Cartilage

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

연구

발생학

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

신경과학

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its longevity can be a powerful way to reveal mechanisms of tissue development and maintenance. One of the most important tools currently available to monitor cells in vivo is the Confetti mouse model. The Confetti model can be used to genetically label individual cells in living mice with various fluorescent proteins in a cell type-specific manner and monitor their fate, as well as the fate of their progeny over time, in a process called clonal genetic tracing or clonal lineage tracing. This model was generated almost a decade ago and has contributed to an improved understanding of many biological processes, particularly related to stem cell biology, development, and renewal of adult tissues. However, preserving the fluorescent signal until image collection and simultaneous capturing of various fluorescent signals is technically challenging, particularly for mineralized tissue. This publication describes a step-by-step protocol for using the Confetti model to analyze growth plate cartilage that can be applied to any mineralized or nonmineralized tissue.

This method describes the use of the R26R-Confetti (Confetti) mouse model to study mineralized tissues, covering all steps from the breeding strategy to the image acquirements. Included is a general protocol that can be applied to all soft tissues and a modified protocol that can be applied to mineralized tissues.

광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a wide range of techniques encompassing ex vivo and in vitro approaches. However, most studies still rely on the analysis of two-dimensional (2D) imaging data, which limits proper evaluation of a developmental process like axial extension and somitogenesis involving highly dynamic interactions in a complex 3D space. Here we describe techniques that allow mouse live imaging acquisition, dataset processing, visualization and analysis in 3D and 4D to study the cells (e.g., neuromesodermal progenitors) involved in these developmental processes. We also provide a step-by-step protocol for optical projection tomography and whole-mount immunofluorescence microscopy in mouse embryos (from sample preparation to image acquisition) and show a pipeline that we developed to process and visualize 3D image data. We extend the use of some of these techniques and highlight specific features of different available software (e.g., Fiji/ImageJ, Drishti, Amira and Imaris) that can be used to improve our current understanding of axial extension and somite formation (e.g., 3D reconstructions). Altogether, the techniques here described emphasize the importance of 3D data visualization and analysis in developmental biology, and might help other researchers to better address 3D and 4D image data in the context of vertebrate axial extension and segmentation. Finally, the work also employs novel tools to facilitate teaching vertebrate embryonic development.

Here, we describe computational tools and methods that allow visualization and analysis of three and four-dimensional image data of mouse embryos in the context of axial elongation and segmentation, obtained by in toto optical projection tomography, and by live imaging and whole-mount immunofluorescence staining using multiphoton microscopy.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

A Label-free Xenograft Model for Investigating the Behavior of Human Stem Cell Spheroids in Chick Embryos

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell migration, differentiation, and morphogenesis, with unique instructive signals and germ layer identity that are often absent from adult xenograft models. In addition, embryonic models cannot discriminate self versus non-self tissues, eliminating the risk of rejection of the graft and the need for immune suppression of the host. This paper presents a methodology for transplantation of spheroids of human cells into chicken embryos, which are accessible, amenable to manipulation, and develop at 37 &#176;C. 
Spheroids allow the selection of a specific region of the embryo for transplantation. After being grafted, the cells become integrated into the host tissue, allowing the follow-up of their migration, growth, and differentiation. This model is flexible enough to allow the utilization of different adherent populations, including heterogeneous primary cell populations and cancer cells. To circumvent the need for prior cell labeling, a protocol for the identification of donor cells through hybridization of human-specific Alu probes is also described, which is particularly important when investigating heterogeneous cell populations. Furthermore, DNA probes can be easily adapted to identify other donor species. This protocol will describe the general methods for preparing spheroids, grafting into chicken embryos, fixing and processing tissue for paraffin sectioning, and finally identifying the human cells using DNA in situ hybridization. Suggested controls, examples of interpretation of results and various cell behaviors that can be assayed will be discussed in addition to the limitations of this method.

Here, we describe a method to transplant and identify human cell spheroids into chick embryos. This xenograft model uses the embryonic microenvironment as a source of instructive signals to assay cell migration, differentiation, and tropism and is especially suited for the study of primary and/or heterogeneous cell populations.

Xenografts are valuable methods to investigate the behavior of human cells in vivo. In particular, the embryonic environment provides cues for cell ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread chondrocyte death, potentially leading to irreversible breakdown of the joint and the onset of osteoarthritis. Additionally, maintenance of chondrocyte viability is important in osteochondral graft procedures for optimal surgical outcomes. We present a method to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of intact murine synovial joints after application of controlled mechanical loads or impacts. This method can be used in comparative studies to investigate the effects of different mechanical loading regimens, different environmental conditions or genetic manipulations, as well as different stages of cartilage degeneration on short- and/or long-term vulnerability of in situ articular chondrocytes. The goal of the protocol introduced in the manuscript is to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of murine synovial joints. Importantly, this method enables testing on fully intact cartilage without compromising native boundary conditions. Moreover, it allows for real-time visualization of vitally stained articular chondrocytes and single image-based analysis of cell injury induced by application of controlled static and impact loading regimens. Our representative results demonstrate that in healthy cartilage explants, the spatial extent of cell injury depends sensitively on load magnitude and impact intensity. Our method can be easily adapted to investigate the effects of different mechanical loading regimens, different environmental conditions or different genetic manipulations on the mechanical vulnerability of in situ articular chondrocytes.

We present a method to assess the spatial extent of cell injury/death on the articular surface of intact murine joints after application of controlled mechanical loads or impacts. This method can be used to investigate how osteoarthritis, genetic factors and/or different loading regimens affect the vulnerability of in situ chondrocytes.

실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

생체공학

In Vitro Preparation of Actively Maturing Bovine Articular Cartilage Explants for X-Ray Phase Contrast Imaging

Understanding the mechanisms that underpin post-natal maturation of articular cartilage is of crucial importance for designing the next generation of tissue engineering strategies and potentially repairing diseased or damaged cartilage. In general, postnatal maturation of the articular cartilage, which is a wholesale change in collagen structure and function of the tissue to accommodate growth of the organism, occurs over a timescale ranging from months to years. Conversely dissolution of the structural organization of the cartilage that also occurs over long timescales is the hallmark of tissue degeneration. Our ability to study these biological processes in detail have been enhanced by the findings that growth factors can induce precocious in vitro maturation of immature articular cartilage. The developmental and disease related changes that occur in the joint involve bone and cartilage and an ability to co-image these tissues would significantly increase our understanding of their intertwined roles.
The simultaneous visualization of soft tissue, cartilage and bone changes is nowadays a challenge to overcome for conventional preclinical imaging modalities used for the joint disease follow-up. Three-dimensional X-ray Phase-Contrast Imaging methods (PCI) have been under perpetual developments for 20 years due to high performance for imaging low density objects and their ability to provide additional information compared to conventional X-ray imaging.
In this protocol we detail the procedure used in our experiments from biopsy of the cartilage, generation of in vitro matured cartilage to data analysis of image collected using X-ray phase contrast imaging.

This protocol describes the preparation of in vitro bovine articular cartilage for imaging in high resolution with X-rays. These explants actively undergo postnatal maturation. We describe here the necessary steps from the biopsy to data analysis of 3D X-ray phase contrast imaging, passing through explant culture, tissue fixation and synchrotron preparation.

Understanding the mechanisms that underpin post-natal maturation of articular cartilage is of crucial importance for designing the next generation of ...

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To decode disc degeneration and to be able to develop regenerative approaches a thorough understanding of the cellular biology of the IVD is essential. One aspect of this biology that still remains unanswered is the question of how cells are spatially arranged in a physiological state and during degeneration. The biological properties of the IVD and its availability make this tissue difficult to analyze. The present study investigates spatial chondrocyte organization in the anulus fibrosus from early embryonic development to end-stage degeneration. An optical sectioning method (Apotome) is applied to perform high resolution staining analyses using bovine embryonic tissue as an animal model and human disc tissue obtained from patients undergoing spine surgery. From a very high chondrocyte density in the early embryonic bovine disc, the number of cells decreases during gestation, growth, and maturation. In human discs, an increase in cellular density accompanied the progression of tissue degeneration. As had already been demonstrated in articular cartilage, cluster formation represents a characteristic feature of advanced disc degeneration.

We present a method to investigate spatial chondrocyte organization in the anulus fibrosus of the intervertebral disc using an optical sectioning method.

배아 개발에서 퇴화까지 의 상호 디스크의 광학 단면 및 시각화

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...