저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트, Inc.에) 감사의 말씀을 전합니다. 그레고리 블라스는 원고의 중요한 교정을 인정한다. 이 연구는 (AS에) 1-15-BS-172 및 DVI (에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동을 부여 건강 보조금 HL108880 및 미국 당뇨병 협회 (American Diabetes Association)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

동물 사용 및 복지 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인 프로토콜 다음과 같은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수해야합니다. 1. 신장 세척 <ol><li> (그러나 다른 연령과 성별의 다른 균주에 따라 변경 사용할 수 있습니다, 스프 라그 돌리 변형이 제안) 8-12주 세 남성 쥐를 사용합니다. </li><li> IACUC 프로토콜에 의해 허용 된 절차에 따라 동물을 마취; 마취 깊이를 모니터링하고 동물을 검사한다. 수술의 상세한 설명은 1.3에서 수행되는 - 1.8 Ilatovskaya 외에서 찾을 수있다 (7). </li><li> 적절한 마취 후, 온도 조절 수술 테이블에 동물을 배치 (최대 길이 3 인치) 복부의 정중선 절개를하고, 대정맥과 대동맥을 발견. </li><li> 복강 및 상 장간막 동맥과 복부 주위에 합자를 삽입그 위의 대동맥; 결찰하지 않습니다. </li><li> 신장 동맥 아래 복부 대동맥을 해부하고, 주위에 두 개의 합자를 배치하지만, 결찰하지 않는 무딘, 다음 합자 위의 대동맥을 고정하고 밑실 넥타이. </li><li> 클램프 아래 (PBS로 가득 주사기 펌프에 부착) 폴리에틸렌 PE50 튜브와 대동맥을 카테 테르를 꽂다 두 번째 합자와 카테터를 해결; 클램프를 제거 펌프를 켜고 대동맥을 결찰 및 복강 동맥과 장간막. 빠르게 압력을 완화하기 위해 신장 정맥 절개를합니다. </li><li> / 분의 6 ml의 속도로 2 ~ 3 분 동안 프리 - 냉각 PBS로 대동맥 달이다. </li><li> 관류, 소비세를 중지하고 7 신장을 디 캡슐하고, PBS 용액에 얼음에 넣어. IACUC에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 동물을 안락사. </li></ol> 쥐 사구체 2. 분리 <ol><li> RPMI 1640에서 5 % BSA의 신선한 용액 30 ㎖를 준비합니다. </li><li> 면도날과 가위를 사용하여,모두 신장의 피질을 분리 한 다음 균일까지 말하다. 이 절차는 앞에서 설명 하였다 7. </li><li> 100 메쉬 스테인레스 강 체를 통해 이전 단계 동안 다진 조직을 밀어 주걱을 사용하여 (BSA / RPMI 5 % 용액에 미리 침지). 관류 및 중력에 의해이 플로우 스루는 140 메쉬 체를 통과 할 수 있도록 수집. </li><li> , 미리 적신 200 메쉬 체를 사용하여 체 140 메쉬로부터 수집 관류 필터 여과 액을 폐기하고 (10) 자체의 상단 세척 -에 침강 사구체를 수집하기 위해 제조 된 BSA / RPMI 용액 15 ml에 체. </li><li> 최대 20 분 동안 튜브의 하단 사구체 침전물을 15ml의 튜브에 얼음 사구체 함유 BSA / RPMI 용액을 넣고하자. 튜브의 하단에있는 사구체 농축 명확하게 볼 수 있습니다. 튜브에 약 2 mL를 떠나, 초과 솔루션을 제거합니다. </li></ol> 3. 단일 채널 패치 클램프 엘ectrophysiology <ol><li> MW 70,000로 코팅하여 5 × 5mm 커버 유리 칩을 준비 - 150,000 폴리 ʟ 라이신, 건조 할 수 있습니다. 커버 유리 당 물에 0.01 % 멸균 여과 된 용액의 약 30 μl를 사용합니다. </li><li> RT에 대한 실험 솔루션을 따뜻하게하고, 패치 클램프 챔버와 피펫을 입력합니다. TRPC 채널 모니터링의 경우, mM의에서 목욕 솔루션, 사용 : (126)의 NaCl, CaCl2를 1, 10 HEPES, 2의 MgCl 2, 10 포도당, 산도 7.4; 피펫 : (126)의 NaCl, CaCl2를 1.5, 10 HEPES, 10 포도당; pH가 7.4. <ol><li> 추천 연구 (관련이 없습니다 내생 채널의 활동을 차단하는 피펫 솔루션에 억제제를 추가 있습니다 : 100 μm의 니플 룸산 또는 DIDS이 (칼슘 부활 CL 차단 - 채널), 10 mM의 차 (을 억제하는 큰 컨덕턴스 칼슘 + - 의존적 K + 채널), 10 나노 iberiotoxin (,)를 10 μM 니 카르 디핀 칼슘 부활 K + 채널을 차단하는 (N 형 칼슘을 차단2+ 직접 패치 클램프 실험 전 채널)). </li></ol></li><li> 조심스럽게 사구체 함유 용액을 혼합 한 후 폴리 ʟ 라이신 코팅 커버 유리 칩에 약 50 μl를 적용합니다. 사구체는 약 5 분 동안 연결하자. </li><li> 패치 - 클램프 챔버 욕 용액으로 미리 충전하는 사구체으로 유리 절삭 가루를 이동; 부착 사구체의 제거를 보장하기 위해 1 분 / mL의 3 분의 속도로 관류 챔버. </li><li> 세포 부착 모드 7에서 기존의 패치 클램프 실험을 실시한다. 유리 피펫 (7 - 10 MΩ 피펫 저항) 피펫 부드러운 흡입 (고립 사구체의 표면에 발 세포 부착 피펫을 적용하여 발 세포 막 사이에 고 저항 시일을 형성하기에,도 2에 도시 왼쪽). </li><li> 세포 부착 된 측정을 위해 팔 극 베셀 필터에 의해 300 Hz에서 전류를 낮은 패스. </li><li> 유6 시간 - SE는 최대 4에 대한 패치 클램프 실험에서 사구체를 격리합니다. 얼음에 주식 사구체의 비율을 유지합니다. </li></ol> 족 세포에서 세포 내 칼슘 농도의 4 비례 공 초점 형광 측정 <ol><li> 원뿔 튜브 0.5 ml의 (2.5에서 설명) 사구체 분획 500 μl를 넣고 칼슘 염료의 Fura 레드, AM 및 FLUO-4, 오전를 추가합니다. 2 mM의과 (DMSO에 용해 -20 ° C에서 저장,)은 Fura 레드, AM 및 FLUO-4, 오전, 각각의 1 mM의 재고 농도를 사용하여 사구체 분획 500 ㎕를 각 염료의 2.5 μl를 사용합니다. 즉시 염료 첨가 후 알루미늄 호일로 커버 튜브. </li><li> 실온에서 1 시간에 적어도 20 분까지를위한 회전하는 통에 장소 튜브. 주 : 약리 제제는이 단계에서 첨가 될 수있다. </li><li> , 커버 글라스를 준비 폴리 ʟ 라이신로를 커버하고 70 ℃로 가열 플레이트 세트를 사용하여 건조 할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 염료 로딩 COMPLET되면E는, 폴리 리신 코팅 ʟ 커버 슬립을 함유 용액 사구체 100 μL를 적용하고 약 5 분 동안 표면에 충실하자. 촬상 챔버 내로 사구체 부착 된 커버를 장착하고 욕 용액 (() mm 단위 함유 :의 MgCl 2 (145)의 NaCl, 4.5 KCl을, 2, 10 HEPES, pH가 7.35)으로 관류 3 ㎖의 속도 / 분 제거 사구체 부착하고 나머지 염료. </li><li> 488 nm의 여기 파장과 방출 필터 (각각 FLUO-4의 Fura 레드에 대한 25분의 525과 25분의 650 nm의)에 공 초점 레이저 주사 현미경을 설정합니다. 원하는 주파수와 해상도 이미징 소프트웨어를 설정합니다. </li><li> 시야에서 사구체를 찾아 다음 형광 신호의 검출을 켭니다. 신호의 포화를 피하기 위해 각각의 염료에 대해 레이저의 강도를 조정한다. 직접 유리에 부착 된 족 세포에 초점면을 선택합니다. 이는 약물에 반응 사구체의 수축에 의한 영향을 최소화신청. 선택의 사구체가 아니라 유리에 연결되어 있는지 다시 확인; </li><li> 선택의 초점면을 이미징 시작, (높은 해상도 이미지에 대한 60X / NA 1.4 또는 유사한 대물 렌즈를 사용합니다. 빠른 칼슘 과도 변화를 시각화하기 위해 4 초에서 설정 한 주파수로 512 X 512 이미지를 가지고) 관심의 약물을 적용 하고 응답을 기록합니다. <ol><li> (사구체 족 세포의 표면 상에 이미징을 보장하기 위해 가능한 한 유리 표면에 가까운) 원하는 초점면을 선택한다. Fluo4 및 FuraRed 채널에 형광의 강도를 확인하고, 사구체 분명히 시야에서 볼 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 영상을 시작합니다. 어떤 약물의 응용 프로그램을하기 전에, 기본 형광 기록 적어도 1 분은 신호가 (이 갑작스런 스파이크가 없거나 신호의 페이딩) 안정적인지 확인합니다. </li><li> 마이크로 피펫의 도움으로 원하는 약물을 적용; 주의 및 약물이 잘 확산 할 수 있었다 확인하고 glomer에 도달ulus. 필요한 경우, 상기 선택된 초점면을 감시하고 있기 때문에 약물 애플리케이션의 초점이 이동되지 않았다는 것을 확인 부드럽게 욕 용액을 섞는다. </li><li> Fluo4 및 FuraRed 신호에 대한 형광 강도의 변화를 기록한다. 녹음이 신호가 고원 수준에 도달 또는 피크에 도달 한 후베이스 라인으로 복귀 할 때까지 대기하여 충분히 긴 있는지 확인합니다. 필요한 경우 솔루션의 변경 또는 다른 약물의 추가를 수행합니다. </li><li> 녹음을 중지하고 소프트웨어의 기본 형식으로 파일을 저장합니다. </li></ol></li></ol> 칼슘 측정 5. 이미지 분석 <ol><li> 기본 ND2 형식으로 이미지를 가져 오기 할 수 있습니다 ND 유틸리티 플러그인을 갖춘 ImageJ에 열려있는 소프트웨어와 이미지 분석을 수행합니다. </li><li> 이미지 시퀀스를 가져옵니다; 채널을 분할하고 hyperstack 그레이 스케일 모드를 사용하십시오. </li><li> O에 ImageJ에 소프트웨어의 분석 → 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자 경로를 따라펜 투자 수익 (ROI) 관리자 창. 타원형 선택 도구 및 투자 수익 (ROI) 관리자의 &quot;추가 (T)&quot;기능을 사용하여 관심 (족 세포)의 여러 지역을 선택합니다. ROI 마지막으로, 배경 영역을 선택; (저장 → 기타) 선택된 ROI를 저장합니다. </li><li> 분석을 위해 선택된 채널을 포함하는 윈도우를 강조. , 투자 수익 (ROI) 관리자에서 멀티 측정 기능 → 이상을 사용 튀어 나올 대화에서 &quot;하나의 행 조각 당&quot;상자를 표시 한 다음 확인을 클릭합니다. 선택 집합 측정 → 메뉴 옵션의 결과에 입력 &quot;회색 평균치&quot;와 표시되는 각 ROI에 대한 화소 강도 값을 계산 : 결과는 결과 창에서 설정 될 수 형식으로 표시 될 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 별도의 컬럼에서 결과 창. </li><li> 바람직한 데이터 분석 소프트웨어로 각 채널 (FLUO-4의 Fura 레드)에 대한 ROI 측정 강도 값을 복사; 각 DAT에서 빼기 배경 강도 값점. </li><li> 각 시점의 Fura 들어 레드 채널 FLUO-4의 세기의 비율을 계산한다. 플롯 분산 / 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 칼슘 과도의 라인 포인트 - 시간 변경. 선택 사구체에 대한 평균 / SE 값을 계산합니다. 참고 : 시간 ​​열은 4.5에서 선택한 영상 주파수에 따라 설정해야합니다. </li></ol> FLUO-4 형광 신호를 이용하여 제 세포 내 칼슘 농도 계산 <ol><li> 사구체의 샘플을 가지고 4.7 단계로 실험 프로토콜을 수행합니다. 배경 형광의 기록 후에 조 용액 및 기록 형광 강도 증가 (10 μM이어야 화장실 실내에 최종 농도) 이오 노마 이신을 추가한다. 강도가 최대에 도달하고 붕괴가 시작되면, MnCl 2 추가 8 형광을 켄칭 (최종 농도 5 mM의이어야). </li><li> 6.1에서 얻어진 데이터를 분석한다. 수득 FLUO-4 ROI 신호 세기 값이있어서 복사선호하는 분석 소프트웨어에 의해 5.1-5.5에 설명 된 프로토콜. </li><li> 수식을 이용하여 ROI에 대응 발 세포에서 (㎚)에서 세포 내 칼슘 농도를 계산한다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> K d를 FLUO-4 (345 ㎚)에 대한 일정한 소정 해리이고, F는 (기준)에 대한 칼슘 농도를 산출하는 평가시기에서의 세기는이고, F 최소 및 F 최대의 강도 값이며 (이오 노마 이신 신청 후) 및 (MnCl 2) 형광의 담금질 후의 칼슘 최대 하중 점의 각각 (도 3 참조). </li></ol>

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여기에 설명 된 방법은 설치류 사구체의 족 세포에 의한 칼슘 처리의 분석을 위해 수 있습니다. 이 기술은 패치 클램프 단일 채널 전기 생리학 및 형광 비율 계량 공 초점 영상의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 그러나, 두 방식은 자신에, 별도로 사용할 수있다. 제안 된 프로토콜은 1) 신장 플러시 등 여러 상대적으로 간단한 단계를 가지고있다; 2) 차동 체질에 의한 사구체의 분리; 3) 패치 클램프...

신장은 다양한 물질에 대한 항상성 균형을 유지하고 전체의 혈압을 결정하는 방식으로 혈액량을 조절한다. 하이퍼 또는 저혈압에 이르기까지의 신장의 여과, 재 흡수 또는 분비 리드의 장애 또는 동반 병적 인 상태는, 결국 신장 이식을 필요로 무대 신장 질환을 종료합니다. 모세 혈관 내피, 기저막 및 상피 세포의 단세포 층 - - 슬릿 다이어프램 무결성 및 기능 (1)의 유지에 중요한 역할을 족 세포, 신장 필터링 부 (사구체)은 3 개의 층으로 이루어져있다. 투과성 사구체 필터 부전은 단백뇨와 같은 거대 분자의 소변 손실이 발생합니다. 각종 제제는 사구체 여과 장벽의 완전성을 결정 족 세포 및 그들의 발 프로세스의 구조에 영향을 미칠 수있다. 족 세포는 glom의 유지에 관여eruli 여과 기능. 이는 발 세포 부적절한 칼슘 처리가 세포 손상에 이르게하고 병증 2,3- 다양한 형태의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 확립되어있다. 따라서, 발 세포의 기능 연구를위한 수단이 될 것입니다 세포 내 칼슘 농도의 변화를 직접 측정 가능하게하는 모델의 개발. 격리 사구체 이전 알부민 반사 계수의 측정 (4) 및 전체 셀 전기 생리 패치 - 클램프 측정 5,6-에서 적분 셀룰러 전류의 평가를 변경 포함한 수많은 연구에 사용 하였다. 본 논문에서는, 약학 제제의 적용에 응답하여 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 세포 내 칼슘의 기저 레벨을 추정하고, 개별 칼슘 채널의 활성을 평가하기 위해 연구를 허용하는 프로토콜을 기술한다. Ratometric 칼슘 농도 측정 및 패치 클램프 electrophysiology 각각 발 세포 및 채널 활동 내에서 세포 내 칼슘 농도의 변화를 결정하는데 사용 하였다.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>solution</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Germany</td></tr><tr><td>Nikon confocal microscope (inverted)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Silicone Compound</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Low pass filter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 pole Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Motorized micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microvibration isolation table</td><td>TMC</td><td></td><td>equipped with Faraday cage</td></tr><tr><td>Multichannel valve perfusion system</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Niflumic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA chloride</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>without antibiotics</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% albumin solution</td></tr><tr><td>Temperature controlled surgical table</td><td>MCW core</td><td></td><td>for rodents</td></tr><tr><td>Steel sieves:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>mesh 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>screen for CD-1</td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump-based perfusion system</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane anesthesia</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

여기에서는 족 세포에서 칼슘 농도 급성 변화를 측정하는 문제를 해결. 1 갓의 족 세포에서 고해상도 실시간 형광 공 초점 이미지 및 단일 이온 채널 활성 레코딩을 수행하기 위해 설계된 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다 고립 된 쥐 사구체. 쥐를 마취 한 후 간단히, 신장은 피를 취소 PBS로 플러시해야합니다. 그런 다음, 신장 절제와 디 캡슐화하고, 사구체는 차동 체질...

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Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K 조회수.  Medical College of Wisconsin. Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. 

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Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte foot processes contain actin bundles that bind to cytoskeletal adaptor proteins such as podocin. Those adaptor proteins, such as podocin, link the backbone of the glomerular slit diaphragm, such as nephrin, to the actin cytoskeleton. Studying the localization and function of these and other podocytic proteins is essential for the understanding of the glomerular filter&#39;s role in health and disease. The presented protocol enables the user to visualize actin, podocin, and nephrin in cells with super resolution imaging on a conventional microscope. First, cells are stained with a conventional immunofluorescence technique. All proteins within the sample are then covalently anchored to a swellable hydrogel. Through digestion with proteinase K, structural proteins are cleaved allowing isotropical swelling of the gel in the last step. Dialysis of the sample in water results in a 4-4.5-fold expansion of the sample and the sample can be imaged via a conventional fluorescence microscope, rendering a potential resolution of 70 nm.

The presented method enables visualization of fluorescently labeled cellular proteins with expansion microscopy leading to a resolution of 70 nm on a conventional microscope.

확장 현미경 검사법을 가진 Podocytic 단백질 Nephrin, 액틴 및 포도신의 화상 진찰

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

연구

생화학

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

신경과학

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

의학

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

생물학

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

<meta charset="utf8"></head><body>채널 활성화 연구를 위한 단세포 칼슘 이미징

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...