Gli autori desiderano ringraziare Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) per un&#39;eccellente assistenza tecnica con gli esperimenti di microscopia. Gregory Blass è riconosciuto per la correzione critica del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health HL108880 concessione e American Diabetes Association concedere 1-15-BS-172 (AS), e il Ben J. Lipps Research Fellowship dalla Società Americana di Nefrologia (DVI).

Uso e benessere degli animali dovrebbero aderire alla guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio seguendo protocolli esaminato e approvato dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC). 1. Rene Flush <ol><li> Utilizzare da 8 a 12 settimane di età topo maschio (consigliato è un ceppo Sprague Dawley, ma altri ceppi di età e sesso diverso possono essere utilizzati con le opportune modifiche). </li><li> Anestetizzare l&#39;animale secondo la procedura consentita dal protocollo IACUC; monitorare profondità dell&#39;anestesia e controllare l&#39;animale. La descrizione dettagliata della chirurgia da eseguire in 1,3-1,8 possono essere trovati in Ilatovskaya et al 7. </li><li> Dopo anestesia corretta, posizionare l&#39;animale su un tavolo operatorio temperatura controllata, fare una incisione mediana dell&#39;addome (fino a 3 pollici di lunghezza), e scoprire la vena cava e l&#39;aorta. </li><li> Inserire legatura intorno ai celiaci e mesenterica superiore arterie e gli addominaliaorta sopra di quelli; non legare. </li><li> Blunt sezionare l&#39;aorta addominale al di sotto delle arterie renali, e mettere due legature attorno ad esso, ma non legare, quindi bloccare l&#39;aorta sopra le legature e legare il filo inferiore. </li><li> Cateterizzarla l&#39;aorta con un tubo di polietilene PE50 (collegato a una pompa a siringa riempita con PBS) sotto il morsetto e fissare il catetere con la seconda legatura; rimuovere il morsetto, accendere la pompa, e legare l&#39;aorta e le arterie mesenterica con celiaci. Fare rapidamente incisione nella vena renale per alleviare la pressione. </li><li> Infondere l&#39;aorta con PBS pre-raffreddata per 2 o 3 minuti ad una velocità di 6 ml / min. </li><li> Smettere di perfusione, accise e decapsulate 7 i reni, e metterli sul ghiaccio in soluzione PBS. Euthanize l&#39;animale secondo il protocollo approvato da IACUC. </li></ol> 2. Isolamento del Topo glomeruli <ol><li> Preparare 30 ml di soluzione fresca di 5% BSA in RPMI 1640. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio e forbici,isolare la corteccia di entrambi i reni, e poi sminuzzare fino omogeneo. Questa procedura è stata descritta in precedenza 7. </li><li> Spingere il tessuto tritato durante la fase precedente al setaccio in acciaio inossidabile 100 mesh (pre-imbevuto di 5% di BSA soluzione / RPMI) con una spatola. Raccogliere il flusso continuo e dalla forza di gravità consentono il flusso continuo di passare attraverso un setaccio di 140 mesh. </li><li> Filtrare il flow-through raccolti dalle maglie 140 setaccio con un vaglio da 200 pre-impregnato, scartare il filtrato, e lavare la parte superiore del vaglio a 10 - 15 ml della soluzione di BSA / RPMI preparati a raccogliere i glomeruli che sedimenti il setaccio. </li><li> Mettere la soluzione BSA / RPMI contenente glomeruli su ghiaccio in una provetta da 15 ml e lasciare il sedimento glomeruli sul fondo del tubo fino a 20 min. Il concentrato glomeruli sul fondo del tubo sarà visto chiaramente. Rimuovere la soluzione in eccesso, lasciando circa 2 ml nel tubo. </li></ol> 3. monocanale patch-clamp Electrophysiology <ol><li> Preparare 5 x 5 mm frammenti di vetro di copertura da rivestimento con 70.000 MW - 150.000 poli-ʟ-lisina, e lasciare asciugare. Usare circa 30 ml di 0,01% sterile soluzione filtrata in acqua al vetro di copertura. </li><li> Riscaldare le soluzioni sperimentali RT e riempire la camera patch-clamp e pipetta. Per il monitoraggio canali TRPC, utilizzare una soluzione del bagno, in mm: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 glucosio, pH 7.4; pipetta: 126 NaCl, 1,5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 glucosio; pH 7.4. <ol><li> Aggiungere inibitori alla soluzione pipetta per bloccare l&#39;attività di canali endogeni, che non sono rilevanti per gli studi (consigliate sono: 100 micron niflumico o DIDS (per bloccare Ca 2+ -activated Cl - canali), TEA 10 mm (per inibire la grande-conduttanza Ca 2 + - K + dipendente canale), 10 nM iberiotoxin (per bloccare gli Ca 2 + K + canali -activated), 10 mM nicardipina (per bloccare tipo N Ca2+ canali)) direttamente prima dell&#39;esperimento patch-clamp. </li></ol></li><li> Mescolare delicatamente la soluzione contenente glomeruli, e quindi applicare circa 50 ml di al coperchio rivestito chip di vetro poli-ʟ-lisina. Lasciate che i glomeruli attribuiscono per circa 5 minuti. </li><li> Spostare i chip di vetro con glomeruli alla camera di patch-clamp pre-riempite con la soluzione del bagno; profumato camera ad una velocità di 3 ml / min per 1 min per assicurare la rimozione dei glomeruli separati. </li><li> Condurre un esperimento patch-clamp convenzionale in una modalità cella-attached 7. Con una pipetta di vetro (7 - 10 MW resistenza pipetta) formare una tenuta ad alta resistenza tra una pipetta e una membrana podocyte applicando aspirazione delicata (una pipetta collegata ad un podocyte sulla superficie del glomerulo isolato è mostrato in figura 2, sulla la sinistra). </li><li> Per le misure di cella-attached, passa-basso le correnti a 300 Hz da un filtro a otto poli Bessel. </li><li> Use isolata glomeruli in esperimenti di patch-clamp per un massimo di 4-6 ore. Mantenere la frazione magazzino glomeruli sul ghiaccio. </li></ol> 4. Raziometrico confocale misure di fluorescenza intracellulare concentrazione di calcio nelle podociti <ol><li> Mettere 500 ml di frazione glomeruli (descritto in 2.5) a 0,5 ml tubo conico e aggiungere coloranti calcio Fura Red, AM e Fluo-4, AM. Utilizzare 2mM e 1 mm concentrazioni di stock di Fura Red, AM e Fluo-4, AM, rispettivamente (conservare a -20 ° C, sciolto in DMSO) e l&#39;uso di 2,5 ml di ciascun colorante per 500 ml di frazione glomeruli. Immediatamente dopo l&#39;aggiunta dei coloranti coprire il tubo con un foglio di alluminio. </li><li> Porre le provette su un agitatore rotante per almeno 20 minuti fino a 1 ora a temperatura ambiente. Nota: Agenti farmacologici possono essere aggiunti durante questa fase. </li><li> Preparare vetrini, coprirli con poli-ʟ-lisina e permettere l&#39;asciugatura utilizzando set piatto riscaldato a 70 ° C. </li><li> Una volta che il carico di coloranti calcio è complete, applicare 100 ml di i glomeruli contenenti soluzione ai vetrini rivestiti di poli-ʟ-lisina e farli aderire alla superficie per circa 5 minuti. Montare i coprioggetti glomeruli-schiera in una camera di imaging, e profumato con la soluzione del bagno (contenente (in mM): 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7,35) ad una velocità di 3 ml / min per rimuovere i glomeruli assegnata e le restanti coloranti. </li><li> Impostare il microscopio confocale a scansione laser ad una lunghezza d&#39;onda di eccitazione 488 nm e filtri di emissione (525/25 e 650/25 nm per Fluo-4 e Fura Red, rispettivamente). Impostare il software di imaging per una frequenza e risoluzione desiderata. </li><li> Trovate i glomeruli in campo chiaro e poi accendere il rilevamento del segnale di fluorescenza. Regolare l&#39;intensità del laser per ciascun colorante per evitare la saturazione del segnale. Scegliere il piano focale con podociti che sono direttamente collegati al vetro. Ciò minimizza l&#39;effetto causato dalla contrazione di un glomerulo in risposta a farmaciapplicazione. Doppio controllo che glomerulo di scelta è ben attaccato al vetro; </li><li> Avviare l&#39;imaging piano focale scelta (prendere 512 x 512 immagini con la frequenza impostata a 4 secondi per visualizzare Ca 2+ veloce cambiamenti transitori. Usare un 60X / NA 1.4 o simile lente dell&#39;obiettivo immagine ad alta risoluzione per), si applicano le droghe di interesse, e registrare la risposta. <ol><li> Selezionare un piano focale desiderata (il più vicino alla superficie del vetro come possibile, per assicurare l&#39;imaging di podociti sulla superficie del glomerulo). Controllare l&#39;intensità della fluorescenza sul Fluo4 canali FuraRed, e assicurarsi che il glomerulo si vede chiaramente in campo chiaro. </li><li> Inizia imaging. Prima dell&#39;applicazione di qualsiasi droga, record di almeno 1 min di riferimento di fluorescenza per assicurarsi che il segnale è stabile (non ci sono picchi improvvisi o dissolvenza del segnale). </li><li> Applicare farmaci desiderati con l&#39;aiuto di una micropipetta; fare attenzione e verificare che il farmaco è stato in grado di diffondere bene e raggiungere il glomerUlus. Mescolare delicatamente la soluzione del bagno, se necessario, controllare il piano focale selezionata e verificare che non si muoveva fuori fuoco a causa della domanda di droga. </li><li> Registrare i cambiamenti di intensità di fluorescenza per i segnali Fluo4 e FuraRed. Assicurarsi che la registrazione è abbastanza lungo, aspettando fino a quando il segnale raggiunge il livello di plateau o raggiunge un picco e poi ritorna al basale. Eseguire cambiamento soluzione o l&#39;aggiunta di altri farmaci se necessario. </li><li> Interrompere la registrazione, e salvare il file nel formato nativo del software. </li></ol></li></ol> 5. Image Analysis per le Misure di calcio <ol><li> Eseguire l&#39;analisi delle immagini con il software ImageJ attrezzata con il plugin Utility ND che consente di importare le immagini nel formato ND2 nativo. </li><li> Importare la sequenza di immagini; assicurarsi di dividere i canali e utilizzare una modalità HyperStack scala di grigi. </li><li> Seguire la → Strumenti → ROI percorso Analizzare manager nel software ImageJ per openna un window manager ROI. Seleziona più regioni di interesse (podociti) utilizzando uno strumento di selezione ovale e il &quot;(t) Aggiungi&quot; funzione nel ROI Manager. Come l&#39;ultimo ROI, selezionare l&#39;area in background; salvare il ROI selezionate (More → Salva). </li><li> Evidenziare la finestra contenente il canale selezionato per le analisi. Utilizzare la More → funzione Multi Measure nella ROI Manager, selezionare la casella &quot;una riga per ogni slice&quot; nel dialogo che si apre, e quindi fare clic su OK. I risultati saranno mostrati nel formato che può essere impostato nella finestra dei risultati: entrare nei risultati opzione di menu → Set misurazioni, selezionare &quot;Mean valore di grigio&quot; e calcolare i valori di intensità dei pixel per ogni ROI, che verrà visualizzato nella finestra Risultati in colonne separate per ogni ROI. </li><li> Copiare i valori di intensità ROI misurati per ogni canale (Fluo-4 e Fura Red) nel comodo software di analisi dei dati; sottrazione di valori di intensità di fondo di ogni datun punto. </li><li> Per ogni punto di tempo calcolare il rapporto di intensità del Fluo-4 a canali Fura rossi. Trama scatter / linea point-tempo cambia di Ca 2+ transitoria per ogni ROI. Calcolare i valori medi / SE per glomeruli selezionati. Nota: colonna Ora deve essere impostato in base alla frequenza di imaging selezionato a 4.5. </li></ol> 6. intracellulari Calcoli calcio Concentrazione Uso Fluo-4 fluorescenza del segnale <ol><li> Prelevare un campione dei glomeruli ed eseguire il protocollo sperimentale fino al punto 4.7. Dopo la registrazione della fluorescenza di fondo aggiungere Ionomicina (concentrazione finale nella camera vasca dovrebbe essere 10 pM) per la soluzione del bagno, e aumento dell&#39;intensità di fluorescenza registrare. Una volta che l&#39;intensità raggiunge il suo massimo e il decadimento comincia, aggiungere MnCl 2 (concentrazione finale dovrebbe essere 5 mM) per estinguere la fluorescenza 8. </li><li> Analizzare i dati ottenuti in 6.1. Copiare il Fluo-4 valori di intensità di segnale ROI ottenuti secondoil protocollo descritto a 5,1-5,5 da software di analisi preferito. </li><li> Calcolare la concentrazione di calcio intracellulare (in nm) nella podocita corrispondente alla ROI utilizzando una formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> dove K d è una dissociazione predeterminato costante Fluo-4 (345 nM), F è l&#39;intensità alla prima rilevazione che si sta calcolando la concentrazione di calcio per (basale) e F min e F max sono i valori di intensità del punto di carico massimo calcio (dopo l&#39;applicazione ionomicina) e dopo quenching della fluorescenza (con MnCl 2), rispettivamente (vedere Figura 3). </li></ol>

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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li><li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter.">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li><li>Roshanravan, H., Dryer, S. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;approccio qui descritto permette l&#39;analisi di movimentazione calcio dai podociti dei glomeruli roditori. Questa tecnica consente l&#39;applicazione di patch-clamp elettrofisiologia singolo canale e imaging di fluorescenza confocale raziometrico. Tuttavia, entrambi gli approcci possono essere utilizzati separatamente, per conto proprio. Il protocollo proposto ha diverse relativamente semplici passaggi, tra cui a livello 1) del rene; 2) l&#39;isolamento dei glomeruli da vagliatura differenziale; 3) l&#39;esecuzi...

I reni mantenere l&#39;equilibrio omeostatico per varie sostanze e regolare il volume di sangue in un modo che determina la pressione totale di sangue. Disturbi della filtrazione renale, riassorbimento o secrezione causare o accompagnare stati patologici, che vanno da iper- o ipotensione per terminare malattia renale allo stadio che alla fine richiede il trapianto di rene. L&#39;unità di filtrazione renale (glomerulo) consiste di tre strati - l&#39;endotelio capillare, membrana basale e uno strato cella singola di cellule epiteliali - podociti, che svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell&#39;integrità e della funzione 1 fessura diaframma. Disfunzione nel filtro glomerulare permselective causa la perdita urinaria di macromolecole, come la proteinuria. Vari agenti possono influenzare la struttura dei podociti ei processi piede, che determinano l&#39;integrità della barriera di filtrazione glomerulare. I podociti sono coinvolti nel mantenimento della glomfunzione di filtrazione Eruli. È stato stabilito che la movimentazione calcio improprio dal podociti porta a danno cellulare e svolge un ruolo importante nella progressione di varie forme di nefropatie 2,3. Pertanto, lo sviluppo di un modello che permette di misurazione diretta dei cambiamenti concentrazione intracellulare di calcio sarà determinante per lo studio della funzione podocita. Isolati glomeruli erano già stati utilizzati in numerosi studi, tra cui la misurazione del coefficiente di riflessione albumina cambia 4 e la valutazione delle correnti cellulari integrali nelle cellule intere elettrofisiologiche misurazioni patch-clamp 5,6. Nel presente lavoro si descrive il protocollo che consente al ricercatore di misurare le variazioni della concentrazione di calcio intracellulare in risposta a richieste di agenti farmacologici, stimare i livelli basali di calcio all&#39;interno delle cellule, e valutare l&#39;attività canali del calcio individuale. Misure della concentrazione di calcio Ratometric e patch-clamp electrophysiology sono stati usati per determinare le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio nell&#39;ambito dell&#39;attività podocita e il canale, rispettivamente.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>solution</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Germany</td></tr><tr><td>Nikon confocal microscope (inverted)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Silicone Compound</td></tr><tr><td>Software</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Low pass filter</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 pole Bessel</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Motorized micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microvibration isolation table</td><td>TMC</td><td></td><td>equipped with Faraday cage</td></tr><tr><td>Multichannel valve perfusion system</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Niflumic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA chloride</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>without antibiotics</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% albumin solution</td></tr><tr><td>Temperature controlled surgical table</td><td>MCW core</td><td></td><td>for rodents</td></tr><tr><td>Steel sieves:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>mesh 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>screen for CD-1</td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Binocular microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump-based perfusion system</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane anesthesia</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Qui abbiamo affrontato il problema di misurare variazioni acute dei livelli di calcio nei podociti. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo sperimentale progettata per eseguire alta risoluzione confocale a fluorescenza diretta di imaging e singole registrazioni attività del canale ionico in podociti del fresco isolati glomeruli roditori. In breve, dopo che il ratto è anestetizzato, i reni devono essere lavati con PBS per eliminarli del sangue. Poi, i reni vengono escissi e de...

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Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Medical College of Wisconsin. Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. 

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Ricerca

Neuroscienze

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Medicina

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biologia

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging del calcio a singola cellula per studi di attivazione dei canali

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

Monocanale Analisi e Imaging di calcio nei podociti del Freshly Isolato glomeruli

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

Imaging locale Ca

Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio