Name: sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology
Uploaded: 2015-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
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We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

장치 석사 1. 광학 리소그래피 <ol><li> 적어도 1 시간 동안 ~ 250 ℃에서 핫 플레이트상에서 깨끗한 실리콘 웨이퍼 탈수. 참고 : 사용자 오류가 발생하는 경우에, 마스터를 준비 할 때 하나 이상의 웨이퍼를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 포토 레지스트 분량을 준비합니다. 사용 1의 비율로 희석으로 SU-8 얇은 : 2015 년 SU-8 포토 레지스트 및 2 SU-8 2015 포토 레지스트의 희석 모두의 분량을 준비합니다. 참고 : 약 1 ㎖의 포토 레지스트는 스핀 코팅 한 웨이퍼 필요하다. </li><li> 이 마스터를 생성하기위한 세 가지 마스크 패턴을 준비합니다. 하나 패터닝 멤브레인 채널 및 다른 패터닝 반응 챔버 : 멤브레인 마스터 들어, 두 개의 마스크를 준비한다. 제어 밸브 마스터를 들어, 하나의 마스크 패턴을 준비합니다. 참고 : 마스크 패턴을 포함 리소그래피 기술에 대한 자세한 내용은, 장치 설계에 대한 자세한 설명은 이토 오카자키, 2000 년 36 참조 Fowlkes 및 콜리어, 2013 참조 (37). </li><li> 막 마스터 준비 <ol><li> 스핀 코트 2 : 45 초 동안 1,000 rpm에서 웨이퍼에 1 SU-8 2,015 포토 레지스트 희석. </li><li> 2 분 95 ° C에서 소프트 베이킹 웨이퍼. 콘택트 얼 라이너를 사용하여, 10 초 동안 채널 막 패턴으로 웨이퍼를 노광하고, 95 ℃에서 2 분 동안 노광 후 베이킹을 수행한다. </li><li> 1 분 동안 SU-8 현상액에 웨이퍼를 개발, 또는 포토 레지스트 잔류 물을 제거 할 때까지. 위에서 아래로 이동, 이소프로판올로 웨이퍼를 씻어. 다시 위에서 아래로 이동 질소로 건조 웨이퍼. 4 분 동안 180 ° C에서 구워 웨이퍼. </li><li> 45 초 동안 2,000 rpm에서 1 SU-8 희석 : 스핀 코트 2 다시 웨이퍼를 패턴 화합니다. </li><li> 소프트 베이크는 95 ° C에서 2 분 동안 웨이퍼를 패턴 화합니다. 연락처 정렬을 사용하여, 반응 챔버 패턴 패턴 웨이퍼를 정렬하고 10 초 동안 노출. 95 ° C에서 2 분 동안 노출 후 베이킹을 수행합니다. </li><li> 단계 1.4.3에 설명 된대로 웨이퍼를 개발한다. 4 분 동안 180 ° C에서 웨이퍼, 웨이퍼를 현상 베이크 및 건조 후에. 주 : 웨이퍼는 이전 단계에서 사용 된 것과 동일한 현상에 개발 될 수있다. </li></ol></li><li> 제어 밸브 마스터 준비 <ol><li> 스핀 코트 45 초 동안 2,000 rpm에서 깨끗한 웨이퍼에 SU-8 포토 레지스트를 희석하지 않았을. </li><li> 6 분 95 ° C에서 소프트 베이킹 웨이퍼. 콘택트 얼 라이너를 사용하여, 10 초 동안 제어 밸브 패턴 웨이퍼를 노출. 6 분 동안 95 ° C에 노출 후 베이킹을 수행합니다. </li><li> 2 분 동안 SU-8 Developer에서 웨이퍼를 개발, 또는 잔류 물이 제거 될 때까지. 위에서 아래로 이동, 이소프로판올 씻어. 4 분 동안 180 ° C에서 질소와 빵을 건조 웨이퍼. </li></ol></li></ol> 2. PDMS 소자 제조 <ol><li> 증착을 통해 0.2 ml의 트리메틸 클로로 실란 ~에 모든 마스터를 silanization합니다. <ol><li> 빠르게 silanizing 에이전트의 몇 방울을 실온에서 밀폐 용기에 마스터로 묶습니다. 참고 :. 다른 silanizing 프로토콜이 수용 될 수있다 (38)의 경우 수행 properlY는 PDMS는 쉽게 제거 할 수있을 것입니다. </li></ol></li><li> 유사한 적층 밸브에서 입증 된 바와 같이 (39)를 설계, 장치 및 제어 밸브 멤브레인 층 모두에 대해 상이한 비율로 상용 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS) 및베이스 경화제를 혼합한다. 1과 5 : 기본 1 비율 : 20을 사용하여 멤브레인 및 제어 밸브 금형에 대한 경화제, 각각. <ol><li> 멤브레인 금형 경화제 0.5 g과 10 g의 염기를 혼합한다. 참고 :이 볼륨이 막 마스터에 스핀 코팅됩니다. </li><li> : 1 비율 제어 밸브 금형, 5 기재와 경화제를 혼합한다. 제어 밸브 마스터를 보유하는 데 사용되는 용기에 따라 달라진다 제어 밸브 성형이 필요한 PDMS의 양; 마스터는 PDMS의 ~ 1cm로 코팅되도록 컨테이너 채우기. </li></ol></li><li> 철저히 기포가 보이지 않을 때까지 모두 진공 챔버 내에 제제, 탈기 PDMS 이들을 혼합한다. 내열성에 제어 밸브 마스터 배치용기, 유리 접시 등. 한 비 마스터 위에 PDMS, 탈기 용기 번째 시간 : 5를 조심스럽게 붓는다. </li><li> 제어 밸브 PDMS 용기가 탈기되는 동​​안 스핀 코트 20 : 신중 기포 형성을 최소화하기 위해 멤브레인 마스터 상에 PDMS 혼합물 부어서 막 마스터 1 비율 PDMS 후 회전 도포 마스터를 1,000 rpm에서 45 초 동안. </li><li> 부분적 멤브레인 마스터 6 분 제어 밸브 마스터 15 분 동안 80 ° C의 오븐에서 두 마스터를 경화. 참고 : 부분적으로 경화 된 경우, PDMS는 그 형태를 유지해야하지만, 재료가 약간 끈적 될 것입니다. PDMS가 아직 경화되지 않은 경우 누르면 재료가 그 형태를 보유 할 때까지 시간에 몇 분의 간격으로 다시 굽는다. </li><li> 멀리 부드럽게 금형을 필링, 제어 밸브 마스터에서 직사각형 PDMS 금형을 잘라. 0.75 mm의 구멍 펀치를 사용하여 성형 구성 요소를 통해 유입 구멍을 뚫습니다. 참고 : 구멍은 23 게이지 blun를 삽입하여 정리 될 수 있음필요한 경우 t 팁 바늘, 몰드 외부는, 셀로판 테이프로 정리 될 수있다. </li><li> 멤브레인 마스터 반응 챔버를 찾을 반응 챔버 막의 기능 제어 밸브 주형 부재를 정렬하고 멤브레인 마스터 위에 직접 제어 밸브 구성 요소를 배치하기 위해 광학 현미경을 사용. 장치의 왼쪽 아래 모서리에 제어 밸브 입구의 방향을, 상기 반응 챔버와 멤브레인 마스터 채널 직사각형 컨트롤 밸브 내부의 볼 수 있도록 보장한다. </li><li> 2 시간 동안 80 ° C에서 정렬 된 주형 부재를 굽는다. 참고 : 막 및 제어 밸브 금형 지금 함께 밀봉, 하나의 금형으로 조작 할 수 있습니다. </li><li> 멤브레인을 천공하지 않도록 아주 부드럽게 마스터로부터 멀리 몰드를 박리 멀리 멤브레인 마스터로부터 계층화 PDMS 몰드 컷. </li><li> 입구 펀치 및 0.75 mm의 펀치 구멍을 사용하여 세포 추출물 입력 용 구멍 출구. 두 레이어를 통해 구멍을 펀치,단계 2.6에 기재된 바와 같이 동일한 방식으로 세척. </li><li> 유도 결합 플라즈마 클리너, 플라즈마 치료 모두 금형 (막면이 위로) 20 초 동안 10.5 W에서 0 번 유리 커버 슬립을 사용. 즉시 플라즈마 세정기로부터 주형 및 커버 슬립을 제거하고, 유리와 금형 사이에 공기 포켓을 최소화하기 위해 시도하는, 유리쪽으로 막 측 구성 요소 층을 포함한다. 멤브레인 입력 채널에 직접 누르지 않거나 막 어렵게 값와 채널을 채우는 데있어 유리 어닐링있다. <ol><li> 유리 층을 파손되지 않도록 조립 장치를 취급 할 때 특별한주의하십시오. 장치가 고배율 오일 침지 사용 목표 유리 커버 슬립으로 묘화해야 얇은 커버 글라스를 사용 - 유리가 너무 두꺼우면, 장치 기능이 보이지 않을 수있다. </li></ol></li><li> 마지막으로, 2 시간 동안 80 ° C에서 완성 된 장치들을 경화. </li></ol> 3. 실험 설정 FOR 무 세포 단백질 합성 반응 <ol><li> 1 시간 동안 탈 이온수에 끓는 장치 수화물. 참고 : 완전히 수화 때 장치는 흐린 모습이 있어야합니다. 장치는 또한 수분을하기 위해 RT에서 멸균 물에 O / N을 남아있을 수 있습니다. </li><li> 배양 챔버와 도립 현미경을 사용하여, 30 ° C로 주위 온도를 설정한다. 참고 :이 온도는 너무 다른 반응을위한 최적의 온도가 40 다를 수 있습니다, T7 프로모터와 GFP의 발현을 최적화하기 위해 선택되었다. </li><li> 마운트 장치는, 셀로판 테이프로 스테이지 홀더를 현미경 및 로컬 수화를 유지하기 위해 습윤 티슈 종이 장치의 에지를 래핑한다. </li><li> 제어 밸브 활성화 및 시약 입력 용 질소 가스의 압력을 조절하기 위해 두 고정밀 폐쇄 - 루프 전압 압력 변환기를 사용한다. 참고 : 다른 불활성 가스를 사용할 수있다하지만이 프로토콜은 저 순도 질소로 테스트되었습니다. <ol><li> 하여 제 1 변환기를 연결합니다격막 뚜껑이있는 4 ㎖의 유리 병에서 열린 물이 저수지에 24 게이지 PTFE 튜브. 무딘 팁 23 게이지 바늘로 끝나는 제 2 튜브를 사용하여 제어 밸브 입구에 리저버를 연결한다. 참고 : 두 튜브는 두 개의 날카로운 23 게이지 바늘 저수지 격벽을 관통. </li><li> 남성 대 남성 루어-LOK 커넥터에 연결 24 게이지 PTFE 튜브에 의해 제 2 변환기를 연결합니다. 각 장치에 대해 개별적으로 조립 된 다른 23 게이지 뭉툭한 팁 바늘과 튜브로 연결된 루어 코리아 23 게이지 바늘이 부착합니다. 이 바늘 막 반응 채널에 연결; 반응 채널 및 입력 시약으로부터 물을 세척하기 위해 사용. </li></ol></li><li> 무 세포 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조사의 지침에 따라, 얼음에 반응 CFP들에 대한 구성 요소를 조립한다. 얼음에 CFP들 시약을 보류하​​는 데 소요되는 시간을 최소화하고 조립 후 즉시 장치에 반응을 배치합니다. 참고 :이 장치는있다상업 E. 사용 대장균은 단백질 발현 키트와 구조적으로 GFP를 발현하는 플라스미드를 추출합니다. 총 반응 부피는 25 μL로 확장 하였다 - 이는 필요한 경우, 반응물 더 낮은 볼륨을 사용하는 것이 가능할 수있다. CFP들 시약 사이클 동결 - 해동에 민감한 경향으로서, 실험 전에 적절한 음량으로 시약을 분주하는 것이 도움이 될 수있다. 다른 시약은 반응 혼합물에 첨가 될 수 있지만, 완전히 반응 장치에 적용되기 전에 조립되어야한다. <ol><li> 마지막 DNA 입력을 첨가하여 반응을 조립한다. 참고 : 에펜 도르프 튜브에 조립하면 얼음에 개최하지 않을 경우, CFP들 반응이 시작됩니다. 이 문제 해결을 일관 실험 사이 척도 및 보조제를 유지할 - 시간이 장치에 시약을 적용하고 실험 다를 수 시작 취해진 이후 반응을 모아 혼합되면, 타이머를 시작하는 것이 도움이된다. </li></ol></li><li> 사용단계 3.4.2에서 설명 배관 및 바늘 커넥터, 1ml의 주사기를 이용하여 튜브에 조립 반응을 철회. 반응 챔버의 입구에 뭉툭한 팁 바늘을 삽입합니다. 주사기의 바늘 커넥터를 분리하고 반응 챔버 변환기에 사용 남성 대 수 커넥터에 부착. </li><li> 채널을 채우기 위해 CFP들 시약에 압력 (&lt;10 PSI)을 적용합니다. 반응이 채워질 때 바늘을 제거한다. </li><li> 제어 밸브 입구에 다른 변환기에서 무딘 튜브를 삽입합니다. 아직 제어 밸브 압력을 가하지 마십시오. </li><li> 무대에 장착 된 장치를 놓습니다. 촬상 시야를 사용하여, 100 배 오일 액침 대물 함께 반응 챔버를 찾는. </li><li> Actuate의 20 PSI로 조절 밸브 변환기를 가압하여 조절 밸브; 제어 밸브가 작동 될 때 막의 가시 변화 명백 ​​할 것이다. 반응 챔버의 바닥에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 이미지 수집을 시작; 형광의 성장 w가능성이 반응의 초기 단계에서 분명하지 않을 것이지만 병, 내부에 상기 반응 챔버의 외부 주위에 표시. 반응이 정상 상태에 도달 할 때까지 형광 1-3 분마다 이미지를 캡처. 자동 초점 단계를 사용할 수없는 경우, 간단히 이미지가 촬영되기 전에 각각의 이미지를 집중할. 주 : 일부 광표백이 발생되지만, 광표백에 의한 상대적인 형광에 영향만큼의 광표백 레이트가 공지 된 바와 같이 설명 될 수있다. 이 속도는 photobleaching에 일정 기간 동안 일정하게 광표백 그러한 GFP의 공지 농도 또는 형광 단 혼합물로서 형광 표준, 노광에 의해 추정 될 수있다. </li><li> 취득 된 화상에 상기 제 반응 조립체로부터 경과 된 시간을 기록한다. 참고 :이 문제는 보통 4 ~ 5 분 소요됩니다. </li></ol> 4. 이미지 분석 및 데이터 처리 <ol><li> 이러한 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 선택을ROI 등의 반응 챔버의 내부입니다. 모든 화상 ROI의 평균 형광 강도 값을 획득. 주 : 이것은 원시 형광 강도 트레이스이다. <ol><li> 각 반응 챔버의 내부 주위의 관심 영역을 선택하는 데 사용하는 시계열 분석 - 시계열 분석 및 투자 수익 (ROI) 관리자 플러그인을 사용하여 ImageJ에이 작업을 수행합니다. 각 반응 챔버의 내부에 해당하는 영역 &quot;AutoROIProperties을&quot;설정 &quot;을 클릭에 추가&quot;를 확인하고, 각 실을 선택합니다. 참고 :이 단계는 또한 형광 실 주위에 ROI를 그릴 타원 도구를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 이 투자 수익 (ROI)의 크기는 일반적으로 100X의 목적으로 본 10 μm의 직경 챔버를위한 30 X 30 픽셀 타원에 해당합니다. </li><li> 투자 수익 (ROI) 관리자에서 모든 로아를 선택합니다. 전체 이미지 스택을 통해 각각의 투자 수익 (ROI)의 형광 강도의 평균을 결정하기 위해 &quot;다중 측정&quot;기능을 사용합니다. 참고 : 역 이름 플러그인ckReg 필요한 경우, 화상의 스택을 정렬하기 위해 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 실험에서 모든 챔버에 대한 원시 형광 강도 트레이스를 획득 한 후, 모든 흔적 걸쳐 실험 간 평균 복용, 개별 원시 트레이스로부터 평균을 뺌으로써 반응의 결정적 요소를 결정한다. 이와 분석 IGOR 또는 MS Excel과 같은 사용 데이터 분석 소프트웨어. 참고 :이 노이즈를 제공하는 각 반응 챔버에 대한 추적합니다. </li><li> 셀 (25)로부터 유래 된 유전자 발현을 분석 노이즈 사용한 것과 동일한 방법을 이용하여 상기 반응 챔버들에서 유전자 발현을 분석 노이즈. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

세포에서 유전자 발현 인해 작은 볼륨 및 셀룰러 중요한 반응물의 적은 카피 수 본질적 잡음이다. 소음 생물학은 종종 소스, 처리 및 유전자 회로 및 네트워크 (44)를 제어하는 분자의 인구, 농도, 위치 또는 상태의 변동의 생물학적 영향에 초점을 맞추고있다. 본 작업의 대부분은 세포 내에서 유전자의 자연 네트워크 컨텍스트 내 유전자 회로의 노이즈를 볼 수있는 장점을 갖는다 셀룰러 시스템에서 수행되었다. 그러나, 무 세포 시스템은 셀룰러 시스템에서 피할 수없는 외부 교란 효과 (18)없이 개별 유전자 회로의 본질적인 특성의 변동을 허용한다. 잡음 분석은 유전자 기능을 어떻게 구성되어 회로 및 방법에 중요한 물리적 통찰을 제공 할 수 있고, 음극 (25) 및 양극을 특성화하기 위해 셀룰러 시스템에 사용 된 <suP&gt; (27) 자동 조절, 외부 및 45, 46 파열 식 노이즈 (18), 그리고 전사의 본질 기여. 여기서 우리는 더 한정하고 47, 48 군집이없이 극한 단백질 발현 노이즈에 미치는 역할을 이해하기 위해, 반응기의 크기 및 반응 개시 시간의 동시 제어를 가능 마이크로 유체 소자에서 무 세포 발현 시스템의 연구를 설명 살아있는 세포와 관련된 합병증. 디자인의 기능을 활성화 키 femtoliter 볼륨 (마이크론 스케일) 트랩 PDMS에 엘라스토머 「제어 밸브」멤브레인, 무 세포 단백질 발현 시스템의 반응물을 한정 사용, 반응 챔버의 배열의 통합이다 반응 개시에 대한 잘 정의 된, &quot;0 시간&quot;에 반응물 (도 1). 이 컨트롤은 단백질 합성에 관여하는 반응의 반응 속도가 foll 수 있습니다높은 정밀도와 실시간으로 빚. 실험 간 가변성은 가급적 최소화되도록 이와 같이, 무 세포 반응물을 관리하는 것이 중요하다. 이러한 제어 기술은 우리는 이전에 살아있는 세포에서 유전자 발현을 평가하는데 사용되는 유사하게하여 무 세포 유전학적인 회로 노이즈 구조를 평가할 수있다. CFP들 시스템에 사용되는 반응물 사이클 동결 - 해동에 민감 할 수있는 바와 같이, 상기 반응물은 얼음 위에서 해동 보내는 시간을 차가운 반응물을 유지하고 최소화하는 것이 중요하다. 주기적으로 시간이 지남에 따라 발현 수준의 변화를 식별하기 위해 대량으로 CFP들 시스템의 발현을 테스트하는 것이 좋다 - 이것은 에펜 도르프 튜브에서 10 내지 15 μL 반응에서 수행, 또는 마이크로 플레이트 리더와 같은 장치 일 수있다 다중을 수행하는 반응 속도를 캡처하는 시간이 지남에 따라 읽습니다. 낮은 표현 리터 문제를 해결할 때 모든 실험 반응물의 연령과 해동 시간을 주목하는 것은 도움이 될 것입니다evels. CFP들 시약 조립시 게다가, 그것이 완전히 조립과 얼음에서 제거되면 반응을 시작한다는 것을 명심해야한다. 일관성 &quot;0 시간&quot;을 유지하기 위해, DNA 입력의 최종 첨가 후 CFP들 반응 시작 다음 시간을 기록하고, 배양 장치에 가능한 한 빨리 상기 반응을 적용하는 것이 도움이된다. 이 과정은 약 4-5 분 소요, 형광 아직 반응 챔버 내에서 볼 수 없습니다해야합니다. 이 컨트롤은 반응 곡선의 성장 부를 시각화 가능 시간이 최대화되는 것을 보장한다. 단말기 CFP들 반응을 실행하기 전에, 품질 관리 시험 챔버로부터 누설이없는 검증하기 위해 실행하는 것이 바람직하다. FRAP 시험 장치에 형광 물질을 도포하고, 웰을 완전히 탈색 될 때까지 개별 웰을 노출시킴으로써 (도 2d에서와 같이) 수행 될 수있다. 챔버가있는 경우실의 벽과 내부와 외부 공간 사이의 뚜렷한 대조가 있어야한다 - 어떤 복구는 물론 내부에 볼 수 없어야한다, 잘 밀봉. 형광 복구 명백한 또는 반응 챔버의 벽이 잘 정의되지 않은 경우, 제어 밸브의 압력은 증가되어야하거나 장치는 유리 슬라이드로부터의 누설이나 박리를 검사한다. 이 프로토콜은 상업 E.에서 CFP들 시약 테스트되었습니다 다른 강력한 CFP들 시스템이 사용될 수 있지만 (25 μL로 조정) 대장균 무 세포 단백질 발현 키트. 이 시약 비용이 실험에서 제한 인자 일 때 도움이 될 수있어서, 반응에 적용시 25 μL보다 훨씬 낮은 볼륨을 사용하는 것이 가능하다. 따라서이 장치 suitab 아니다 - 반응물이 장치에 첨가하고, 반응 챔버가 밀봉되면, 디 - 구동 제어 밸브없이 용액에 반응물을 추가 할 수 없다반응 과정 중에 시약의 첨가를 필요로 반응 르. 평가되지 않은이 기간 후에 탈수 및 건조 장치의 효과 -이 장치는 또한, CFP들 3 시간보다 오래 실행할 수 반응을 관찰에 최적화되지 않는다. 긴 반응 시간이 요구되는 경우, 이러한 효과는, 또는 습도 챔버를 사용하여, 증발을 방지하기 위해 소자 밀봉 배양 온도를 변경함으로써 완화 될 수있다. 이러한 챔버 벽 (49, 50) 또는 다공성 멤브레인 층의 포함에 나노 다공성 구조로서 장치 설계에 대한 수정은, 시약 교환을 허용하고, 따라서, 반응 시간의 척도를 길게 할 수 몇 가지 방법을 나타낸다. 균일 한 볼륨의 미세 반응 구획 구획 벽 쪽 &quot;반응&quot;으로 실험과 조사를 위해 매우 적합 일관된 치수를 유지하는 가치가있다. 사용 방법과는 달리이러한 반응은 작은 숫자로 평가되어야한다, 기술을 N-마이크로 제조, 실험시 차원의 유연성을 제공하지 않습니다. 그러나, 이들의 반응 챔버에 대한 제어 가능한 설계는 시간 경과 현미경에 매우 적합하고, 협착의 높은 처리량에있어서 조명 보완 될 수있다.

무 세포 시스템은 살아있는 세포의 연구에 불가피한 같은 피트니스, 분할, 돌연변이 등의 복잡한 요인이없는 생물학적 반응을 볼 수있는 간단하고 유연한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 접근법은 막 단백질의 한 특성, 단백질 상호 작용이 프로빙 및 평행 3-7의 기본적인 양태의 탐사를 포함한 셀룰러 시스템을 연구하기 위해 사용되었다. 최근 무 세포 시스템은 합성 생물학 (synthetic biology) 8-10에 대한 실행 가능한 플랫폼으로 발판을 마련하기 시작했다. 이러한 접근 방식의 매력은 살아있는 세포의 반응 역학에 영향을 미치는 자원 공유와 &#39;외부 소음&#39;에서 합성 생물학 (synthetic biology)을 확보한다는 것이다. 그러나 문제는 무 세포 반응 매립되는 물리적 환경이 반응의 진행과 결과에 영향을 미치는 방법으로 남아있다. 무 세포 반응 환경 - 특별히 한정 environm세포 관련 볼륨을 접근 엔트 - 제대로 특징으로 남아있다. 무 세포 단백질 합성 (CFP들)은 리터 규모의 반응 부피 11 마이크로 리터의 범위에 걸쳐 동등 동력학을 나타내는 &#39;프리 스케일,&#39;종래의 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 셀룰러 스케일 볼륨 반응은 크게 한정 단백질 발현율 (12)에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 확률 무 세포 반응의 성격 - 특히 볼륨 femtoliter 아래에 가도 이러한 시스템 접근 또는이 - 특히 중요 할 수있다. 유전자 발현에 노이즈가 크게 소세포 볼륨 및 부품의 고밀도로서 한정 영향 재산권 중요한 분자의 많은 힘이 매우 낮은 인구 수준으로 - 예를 들어, 하나의 FL 볼륨 내의 대장균 경계만큼 4300 상이한 폴리펩티드 아래 수백 개의 다른 프로모터 (1)의 유도 제어3.이 고유의 잡음은 화성 (14) 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 원동력으로 연루되어있다, 활성 복제 및 대기 시간이 15 용해와 원성 (16, 17) 사이의 λ 파지 결정과 능력 사이의 바실러스 subtillus 결정 사이의 HIV 결정 과 포자 (17). 무 세포 합성 생물학은 세포 유전자 회로 및 네트워크의 확률 적 특성을 탐구하고, 특정 기술 목표를 달성하기 위해 이러한 행동을 조작 할 수있는 기회를 모두 제공합니다. 셀룰러 시스템의 소음 문제가 18~27 잘 연구되어 왔지만, 특히 셀룰러 규모, 무 세포 시스템 (8)의 기본적인 동작 잡음의 작은 탐사가 있었다. 여기에서 우리는 무 세포 합성 생물학 (synthetic biology)의 확률 적 영향의 연구를위한 플랫폼을 제시한다. 이 미세 플랫폼은 femtoliter 규모의 반응 C를 포함빨리 오픈 (및 챔버 중 무료로 확산) 및 상태 폐쇄 (챔버 내에서 제한 반응물) 사이에 전환 할 수있다 hambers. 폐쇄 상태에서는, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 무 세포 단백질 합성 (CFP들) 반응물을 제한하고, 시간 경과 형광 현미경 (28) (도 1)를 사용하여 유전자 발현을 따른다. 우리는 셀 (25)을 특성화하는 데 사용되는 것과 유사한 방식으로 직접적으로 유전자 발현 변동의 스토캐스틱 구조를 측정함으로써 셀이없는 환경을 특성화. 무 세포 반응을 한정하는 비 미세 방법은 소포와 리포좀 29-32, 유 중수 에멀젼 (12), 및 다공성 지지체 (33)를 포함한다. 이들 방법은 제한된 볼륨 (34)의 크기 분포에 대한 제어를 제공하는 반면, 미세 가공 방법은 심지어 나노 스케일에 단단히 지정된 치수 매우 복제 기능을 만든다.더욱이, 이러한 구조는 쉽게 강성 증발 또는 외부 환경의 변화에​​ 민감하지 않고 시간에 따라 추적 될 수있다. 반응이 빠르게 (0시)을 개시하고 나서 시간 명확한 지정을 복잡 반응 개시 다음 반응 챔버를 밀봉 할 수 전작 8,35 미세 가공에 사용되는 컨테이너 디자인. 여기에 제시된 방법을 사용하여, 4-5 분함으로써 잘 정의 된 &quot;0 시간&quot;을 제공하고, 개시하고, 반응 장치에서의 시각화 사이에 필요하다. 프로토콜은 다음의 제조 및 광 리소그래피 장치 조립체, 디바이스 테스트, 및 이미지 분석을위한 방법을 포함하여이 장치를 테스트하기위한 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>SU-8 2015</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000 series</td><td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td></tr><tr><td>SU-8 Thinner</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000 series</td><td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000 series</td><td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td></tr><tr><td>Chlorotrimethylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360 FLUKA</td><td>Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm hole-puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>Harris Uni-Core</td></tr><tr><td>23 gauge needles blunt tip</td><td>Component Supply Co.</td><td>/NE-231PL-25</td><td></td></tr><tr><td>#0 glass coverslip</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260366</td><td>Gold Seal</td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE 300</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Roper Scientific</td><td>CoolSNAP-HQ</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Shutter Insturment</td><td>Lambda SC</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>Nikon</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>Color Filters</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission</td><td></td></tr><tr><td>100X oil-immersion objective</td><td>Nikon</td><td>N.A. 1.4</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Regulator</td><td>Oko Lab</td><td>H201-T</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Universal Imaging Corp.</td><td>Version 7.8.3.0</td><td></td></tr><tr><td>Marsh Bellofram transducers</td><td>Marsh Bellofram</td><td>T2000</td><td></td></tr><tr><td>24 gauge PTFE tubing</td><td>Component Supply Co.</td><td>/SWTT-24-C</td><td></td></tr><tr><td>Septum vials</td><td>National Scientific</td><td>C4015- 17W</td><td></td></tr><tr><td>Power Supply</td><td>Hewlett Packard</td><td>6205B Dual DC Power Supply</td><td></td></tr><tr><td>Sharp 23 gauge needles</td><td>Precision Glide</td><td>305129</td><td></td></tr><tr><td>Male-to-male luer lock adapters</td><td>Qosina</td><td>20024</td><td>Polycarbonate</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge</td><td>Component Supply Co.</td><td>/NE-232PL-5C</td><td>Polypropylene</td></tr><tr><td>S30 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; protein expression system</td><td>Promega</td><td>L1110</td><td></td></tr><tr><td>Pet3a-GFP vector/protein</td><td>Novagen</td><td>69418-3</td><td>Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.</td></tr><tr><td>Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit</td><td>Biorad</td><td>#732-6120</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Molecular Probes</td><td>AF555</td><td>http://www.lifetechnologies.com</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>Version 1.46r</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: Time Series Analyzer</td><td>Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA</td><td>Version 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: StackReg/TurboReg</td><td>Ecole Polytechnique F&amp;eacute;d&amp;eacute;rale de Lausanne Biomedical Imaging Group</td><td>Distribution is dated July 7, 2011</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: ROI Manager Tools</td><td>Tiago Ferreira</td><td>12/15/2013 Version</td><td></td></tr></tbody></table>

sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology

무 세포 시스템이 복잡한 자원 공유로부터 단리 생물학적 반응의 특정 네트워크를 프로빙 유연한 플랫폼을 제공한다 (예를 들면, 글로벌 유전자 발현, 세포 분열) 살아있는 세포 내에서 발생. 그러나, 종래의 거시 규모의 벌크 반응기에 사용 된 이러한 시스템은 종종 그들의 생활 마이크로 미터 수준의 특성 동태 및 효율을 발휘하지 못한다. 반응 역학에 내부 세포 구조와 규모의 영향을 이해하는 것은 복잡한 유전자 네트워크를 이해하는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 동봉 된 분자 시스템의 유연한 특성을 허용하면서 세포 규모 볼륨에서 무 세포 반응을 한정 미세 장치를보고합니다. 이 다층 폴리 (디메틸 실록산)을 (PDMS) 장치 (개방 및 폐쇄) 작동 할 수있는 탄성 중합체 막에 femtoliter 규모의 반응 챔버를 포함한다. 작동시, 챔버는 무 세포 단백질 합성 (CFP들)의 반응을 제한시간 경과 형광 현미경을 사용하여 시간에 따른 반응 속도의 시각화를 허용 형광 단백질을 발현. 여기서 우리는이 장치가 CFP들 유전자 회로를 특성화함으로써, 셀룰러 시스템에서 사용되는 잡음 생물학 기술의 사용을 가능 셀룰러 시스템을 특성화하기 위해 사용 된 것과 직접 유사하게 CFP들 반응의 노이즈 구조를 측정하는데 이용 될 수있는 방법을 보여주고 무 세포 환경과의 상호 작용.

이 미세 가공 된 플랫폼의 뚜렷한 이점은 독립적으로 반응 CFP들 (도 2a)를 한정하기 위해 작동되는 제어 가능한 엘라스토머 「제어 밸브」의 애플리케이션이다. 장치가 작동 될 때, 멤브레인 챔버가 반응 챔버 (도 2c)의 배열로 형광 시약을 제한하는데 유리 슬라이드에 대해 가압된다. 챔버 확실 실험 기간을 통해 반응을 제한하는지 확인하기 위해, 기본적인 시험 FRAP (광표백 후 형광 복구) (37)을 실시 하였다. 형광 물질 (AF 555) 장치에인가하고, 제어 밸브 작동시켰다 현미경의 셔터 조리개를 사용하여 (그림 2D)를 하나의 잘 형광 물질은 격리 된 구속 개별적으로 광 퇴색. 어두운되었고, 제어 밸브가 20 분을 감압 될 때까지 밝기가 회복되지 않았다 잘 선택60; 후, 유리 챔버를 해제. 이 시험은 이러한 반응 챔버는 실험 기간 동안 잘 밀봉 남아 있는지 확인. 최적의 조건에서 (예 : GFP 또는 루시 페라 제)를 쉽게 시각화 단백질을 발현 CFP들 반응이 장치에 적용되는 몇 분 이내에 검출 단백질을 표현한다. 반응의 수명 동안, 반응 챔버의 내부 및 외부에서 단백질 합성이 묘화되고 각각의 챔버 (도 3a)에서 형광 강도를 측정하는 단위로 정량. 형광 강도는, 단백질 농도에 대응하여, 각각의 반응 챔버 (도 3d)에 대한 시간에 걸쳐 매핑 될 수있다. 유전자 발현은 모든 분자 단계 (바인딩 합성, 분해, 단백질 DNA 등) (20)의 변동 (잡음)를 소개 본질적으로 확률 적 과정이다. 노이즈 생물학의 한 지점에 초점을 맞추고유전자 회로 (41)의 소음 시험하는 값. 무 세포 시스템에서의 발현은 발현의 분자 장치 및 반응 용기의 경계를 정의하는 표면들 사이의 상호 작용에서 발생하는 외부 잡음 효과를 가질 것이다. 무 세포 반응이 더 작은 반응 챔버에 갇혀 이러한 외부 효과는 가능성이 더 뚜렷해질 것이다. 다중 밀폐 CFP들 반응의 시간 경과 이미징을 수행하는 기능은 셀룰러 시스템 (25)에 대해보고 된 방법에 직접적으로 유사한 방식으로 한정 무 세포 시스템에서의 잡음 구조체 (크기 및 역학)의 신중한 분석을 가능하게한다.도 3c를 및 3D 약, 약 300 FL의 양에 대응하는, PDMS 반응 챔버 10 μm의 직경에 비해, 15 μL의 웰 부피 표준 384- 웰 마이크로 플레이트에서 T7 프로모터 항시 적 GFP 발현의 시간 과정을 보여 일곱 순서작은 크기의. 10 μm의 반응 챔버에서의 단백질 발현 비율의 변동은 이러한 세포에서 본 접근, 웰 - 플레이트의 측정에 비해 훨씬 높다. 장치상에서 수행 다중 반응은 마이크로 플레이트 리더 고원은 종종 반응 부피 42,43 내의 리소스의 제한에 의해 야기되는 것으로 가정 형광의 신속한 증가가 (도 3b)에 일괄 적으로 수행 CFP들 반응과 유사한 반응 속도를 나타낸다 . 이 결정 성장 거동은 변동하지만, 모든 반응 챔버들에 걸쳐, 그리고 실험간에 대체로 일관 - 실험을 통해 챔버들 사이 트레이스를 평균화함으로써, 결정적 경향 반응 (도 4a) 만 노이즈 성분을 떠나는 추적 값으로부터 감산 될 수있다 .도 4b는 결정 성, 과도 성분의 제거 (상단 후 GFP 발현 노이즈를 도시),도 4a는 10 μm의 반응 챔버에 대응하는 흔적을 표시하는 동안 잡음 (하단)의 자기 상관 (autocorrelation). 자기 상관 추적의 제로 래그 타임이 변동으로서, 노이즈의 크기를 제공하는 동안 자기 상관 추적의 절반 시간의 분포는 소음의 주파수 의존성을 제공한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig1.jpg" /> 도 1의 무 세포 단백질 합성 반응은 유전자 발현 노이즈를 측정 할 목적 femtoliter 규모 반응 챔버 내에 한정되어있다. 상업적 무 세포 단백질 발현 시스템에서 반응물 내부 PDMS 반응 챔버 GFP 구조적 익스프레스 한정하기 위해 사용된다. 이러한 챔버들의 배열은 단백질 발현 및 유전자 발현 잡음을 특성화하기 위해 저속 형광 현미경으로 가시화 될 수있다. 형광 강도 오시간이 지남에 따라 각 반응 챔버는 개별 추적으로 그릴 수있다 바. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52616/52616fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig2.jpg" /> 그림 밀봉 femtoliter 규모의 챔버와 두 겹의 미세 유체 장치의 2. 제조. (A) 레이아웃 및 장치 층의 분해도. 두 장치는 PDMS 층과 유리 커버 슬립으로 구성된다. 유리와 컨트롤 밸브 사이에 밀봉 층 PDMS 막는 반응 챔버를 보유하고있다. PDMS 반응 챔버 (B) SEM 이미지. 내경 ~ 10㎛이다. 장치에서의 입력 채널 (C) 회로도. 무 세포 단백질 합성 (CFP들) 시약은 반응 채널을 통해 흐른다. 물은 컨트롤에 가압밸브 실 (37)을 밀봉, 유리 슬라이드에 대해 반응 챔버를 압축. 참고 문헌에서 재현. 화학의 왕립 학회의 허가 37. (D) 형광 복구 잘 FITC 챔버를 나타냅니다 사용하여 하나의에 (FRAP) 시험을 광표백 후 외부 환경에 대해 잘 밀봉한다. 형광은 챔버 (상단 이미지)에서 체포됐다 단일 우물 (아래 이미지) 광 퇴색되었다. 형광 복구가 제어 밸브가 해제 될 때까지 광 퇴색 실에서 볼 수 없습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52616/52616fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig3.jpg" /> 밀폐 셀 무료 반응 그림 3. EGFP 식입니다. (A) 밀봉 반응 C의 형광 이미지<html> 반응에서 선택한 시점에서 hambers. 단백질 생산은 반응 챔버 내부에서 상기 메인 채널의 챔버 안팎을 알 수있다. (B) EGFP는 T7 중합 효소 프로모터와 터미네이터 강한 리보좀 결합 부위 (RBS)를 제공, Pet3a 벡터에 클로닝 하였다. (C) 마이크로 플레이트 판독기에서 수행되는 벌크 무 세포 반응에서 EGFP의 구성 적 발현 표준화 형광 측정. CFP들 반응은 통상 신속 &#39;정상 상태&#39;로 감속하기 전에 형광 단백질을 생산 - 이것은 리소스 제한 (43)와 관련된다. 검은 색 대시 평균 추적을 나타냅니다. (D) 여러 실험을 통해 51 반응 챔버에서 읽기 (51) 원시 형광 강도 추적의 표준화 형광. 블랙 대시 단백질 발현의 결정적 요소를 도시 여러 실험을 통해 평균 트레이스를 나타낸다./52616/52616fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig4.jpg" /> 그림 4. 개별 노이즈 추적 및 셀룰러와 무 세포 시스템의 노이즈 자기 상관. (A) 오스틴에서 등., GFP 발현 (위)와 박테리아 (25) 생활의 추적 GFP 생산에서 얻은 정규화 된 자기 상관 함수 (아래)에서 2006 년 소음. 맥밀란 출판사 (주)의 허가에 의해 재판 : [자연] (25). (권 439), 저작권 (2006). 미세 유체 장치의 반응 챔버에서 추적 (B) GFP 발현 (위)과 무 세포 시스템에서 GFP의 생산에서 얻은 정규화 된 자기 상관 함수 (아래)에 소음. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52616/52616fig4highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

무 세포 생물학 밀봉 Femtoliter 상공 회의소 배열

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

sealable-femtoliter-chamber-arrays-for-cell-free-biology

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K 조회수.  University of Tennessee, Knoxville. A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

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Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

연구

암 연구학

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

생체공학

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms

Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and analyzing cells at the single-cell level by eliminating the influence of external factors on the cellular microenvironment. Encapsulation of cells in droplets is dictated by the Poisson distribution as a function of the number of cells present in each droplet and the average number of cells per volume of droplet. Primary cells, especially immune cells, or clinical specimens can be scarce and loss-less encapsulation of cells remains challenging. In this paper, we present a new methodology that uses pipette-tips to load cells to droplet-based microfluidic devices without the significant loss of cells. With various cell types , we demonstrate efficient cell encapsulation in droplets that closely corresponds to the encapsulation efficiency predicted by the Poisson distribution. Our method ensures loss-less loading of cells to microfluidic platforms and can be easily adapted for downstream single cell analysis, e.g., to decode cellular interactions between different cell types.

This article presents a protocol for seeding scarce population of cells using pipette-tips to droplet microfluidic devices in order to provide higher encapsulation efficiency of cells in droplets.

피 펫 팁 드롭릿 미세 플랫폼 시드 셀에 대 한 메서드를 기반으로

Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and ...

공학

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

화학

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...